Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

Alannah S. Chalkley; Margaritha M. Mysior; Jeremy C. Simpson

doi:10.3791/63436

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Articolo metodologico

Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

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DOI:

10.3791/63436

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28 dicembre 2021

Alannah S. Chalkley¹ , Margaritha M. Mysior¹ , Jeremy C. Simpson¹

¹Cell Screening Laboratory, UCD School of Biology and Environmental Science, University College Dublin

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l'analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.

Abstract

Lo screening ad alto contenuto (HCS) e l'analisi ad alto contenuto (HCA) sono tecnologie che forniscono ai ricercatori la capacità di estrarre misurazioni fenotipiche quantitative su larga scala dalle cellule. Questo approccio si è dimostrato potente per approfondire la nostra comprensione di una vasta gamma di eventi sia fondamentali che applicati nella biologia cellulare. Ad oggi, la maggior parte delle applicazioni per questa tecnologia si è basata sull'uso di cellule cresciute in monostrati, anche se è sempre più consapevole che tali modelli non ricapitolano molte delle interazioni e dei processi che si verificano nei tessuti. Come tale, c'è stato un emergere nello sviluppo e nell'uso di assemblaggi cellulari tridimensionali (3D), come sferoidi e organoidi. Sebbene questi modelli 3D siano particolarmente potenti nel contesto della biologia del cancro e degli studi sulla somministrazione di farmaci, la loro produzione e analisi in modo riproducibile adatto a HCS e HCA presenta una serie di sfide. Il protocollo qui dettagliato descrive un metodo per la generazione di sferoidi tumorali multicellulari (MCTS) e dimostra che può essere applicato a tre diverse linee cellulari in modo compatibile con HCS e HCA. Il metodo facilita la produzione di diverse centinaia di sferoidi per pozzo, fornendo il vantaggio specifico che, se utilizzato in un regime di screening, i dati possono essere ottenuti da diverse centinaia di strutture per pozzo, tutte trattate in modo identico. Vengono inoltre forniti esempi, che descrivono in dettaglio come elaborare gli sferoidi per l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione e come l'HCA può estrarre caratteristiche quantitative sia a livello sferoide che da singole cellule all'interno di ciascun sferoide. Questo protocollo potrebbe essere facilmente applicato per rispondere a una vasta gamma di domande importanti nella biologia cellulare.

Introduzione

Tradizionalmente, i saggi basati su cellule sono stati eseguiti in monostrati che crescono su un substrato solido, che può effettivamente essere considerato come un ambiente bidimensionale (2D). Tuttavia, sta diventando sempre più riconosciuto che i modelli di coltura cellulare 2D mancano di rilevanza fisiologica in alcuni contesti e non possono replicare molte delle complesse interazioni che si verificano tra le ^cellule1. I metodi di coltura cellulare tridimensionale (3D) stanno rapidamente diventando popolari tra i ricercatori e i modelli cellulari 3D mostrano un alto potenziale per imitare meglio le condizioni fisiologiche incontrate dalle c....