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Articolo metodologico

Singola cellula riutilizzabile per analisi epigenomiche iterative

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DOI:

10.3791/63456

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11 febbraio 2022

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1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive un metodo a singola cellula per analisi epigenomiche iterative utilizzando una singola cellula riutilizzabile. La singola cellula riutilizzabile consente l'analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula e la convalida statistica dei risultati.

Abstract

Le attuali analisi dell'epigenoma monocellulare sono progettate per l'uso singolo. La cellula viene scartata dopo un singolo utilizzo, impedendo l'analisi di più segni epigenetici in una singola cellula e richiedendo dati da altre cellule per distinguere il segnale dal rumore di fondo sperimentale in una singola cellula. Questo articolo descrive un metodo per riutilizzare la stessa singola cellula per analisi epigenomiche iterative.

In questo metodo sperimentale, le proteine cellulari vengono prima ancorate a un polimero di poliacrilammide invece di reticolarle a proteine e DNA, alleviando i pregiudizi strutturali. Questo passaggio critico consente esperimenti ripetuti con la stessa singola cellula. Successivamente, un primer casuale con una sequenza di scaffold per la legatura di prossimità viene ricotto al DNA genomico e la sequenza genomica viene aggiunta al primer per estensione utilizzando una DNA polimerasi. Successivamente, un anticorpo contro un marcatore epigenetico e IgG di controllo, ciascuno marcato con diverse sonde di DNA, sono legati ai rispettivi bersagli nella stessa singola cellula.

La legatura di prossimità viene indotta tra il primer casuale e l'anticorpo aggiungendo un DNA connettore con sequenze complementari alla sequenza di scaffold del primer casuale e della sonda anticorpo-DNA. Questo approccio integra le informazioni sugli anticorpi e le sequenze del genoma vicino in un singolo prodotto del DNA di legatura di prossimità. Consentendo esperimenti ripetuti con la stessa singola cellula, questo metodo consente un aumento della densità dei dati da una cellula rara e analisi statistiche utilizzando solo IgG e dati anticorpali dalla stessa cellula. Le singole cellule riutilizzabili preparate con questo metodo possono essere conservate per almeno alcuni mesi e riutilizzate in seguito per ampliare la caratterizzazione epigenetica e aumentare la densità dei dati. Questo metodo offre flessibilità ai ricercatori e ai loro progetti.

Introduzione

La tecnologia a cella singola sta entrando nell'era della multiomica a cella singola, che integra le tecnologie omiche a singola cella individuale1. Recentemente, la trascrittomica a singola cellula è stata combinata con metodi per rilevare l'accessibilità della cromatina (scNMT-seq2 e SHARE-seq3) o le modifiche istoniche (Paired-seq4 e Paired-Tag5). Più recentemente, la trascrittomica e la proteomica a singola cellula sono state integrate con l'accessibilità della cromatina (DOGMA-seq6). Questi metodi utilizzano la marcatura basata sulla trasposasi per rilevare l'accessibilità della cromatina o le modifiche degli istoni.

Gli approcci basati sulla trasposasi scindono il DNA genomico e aggiungono un codice a barre del DNA alla fine del frammento di DNA genomico. Ogni frammento genomico scisso può accettare solo fino a due codici a barre del DNA (= un segno epigenetico per sito di scissione) e il DNA genomico nel sito di scissione viene perso. Pertanto, gli approcci basati sulla scissione hanno un compromesso tra il numero di segni epigenetici testati e la densità del segnale. Ciò ostacola l'analisi di più segni epigenetici nella stessa singola cellula. Un metodo epigenomico unicellulare che non fende il DNA genomico è stato sviluppato per superare questo problema 7,8.

Oltre al problema derivato dalla scissione sopra menzionato, gli approcci basati sulla trasposasi hanno altre limitazioni. Nell'analisi dell'epigenoma a singola cellula, è fondamentale conoscere la posizione degli istoni e delle proteine associate al DNA sul genoma. Negli approcci attuali, questo si ottiene utilizzando singole cellule non fissate e la conservazione delle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina. Tuttavia, ciò genera una forte distorsione verso le regioni della cromatina accessibili, anche nell'analisi delle modificazioni istoniche 9. La posizione degli istoni e delle proteine associate al genoma sul genoma può essere preservata senza reticolare proteina-DNA e proteina-proteina, utilizzando un'impalcatura di poliacrilammide 7,8. Questo approccio riduce la distorsione strutturale osservata negli approcci attuali che dipendono dalle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina.

Gli approcci basati sulla trasposasi possono acquisire segnali solo una volta da una singola cellula. Pertanto, è difficile delineare l'epigenoma completo di una singola cellula a causa della caduta dei segnali. Le singole cellule riutilizzabili sono state sviluppate per superare i limiti attuali consentendo l'analisi epigenomica iterativa nella stessa singola cellula.

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Protocollo

NOTA: una rappresentazione schematica del metodo è illustrata nella Figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro del protocollo. I passaggi 7.2-13 sono spiegati attraverso rappresentazioni schematiche. Ogni riga indica un passaggio nel protocollo. Una proteina cellulare colorata in verde è un nucleosoma umano generato sulla base di una struttura cristallina (PDB: 6M4G). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Equilibrazione delle colonne di dissalazione

NOTA: le colonne di spin di dissalazione sono bilanciate come descritto nei passaggi seguenti. Le colonne di dissalazione equilibrate vengono utilizzate nei passaggi 2.1, 3.4 e 4.6.

  1. Rimuovere la chiusura inferiore di una colonna di dissalazione (taglio di 7 kDa, volume del tallone di resina di 0,5 ml, vedere la tabella dei materiali) e allentare il tappo nella parte superiore della colonna di dissalazione.
  2. Porre la colonna in una provetta proteica a basso legame da 1,5 mL (una provetta di raccolta, vedere la Tabella dei materiali) e centrifugare a 1.500 × g per 1 minuto a temperatura ambiente per rimuovere la soluzione di conservazione nella colonna.
    NOTA: Utilizzare una centrifuga a rotore oscillante per appiattire la parte superiore del letto a tallone.
  3. Rimuovere il flusso nel tubo da 1,5 mL e aggiungere 300 μL di tampone fosfato 150 mM NaCl/100 mM, pH 8,0 (vedere Tabella 1), sopra il letto di resina.
  4. Centrifugare a 1.500 × g per 1 minuto a temperatura ambiente e rimuovere il flusso nel tubo di raccolta.
  5. Ripetere i passaggi 1.3-1.4 altre tre volte.
  6. Eliminare il buffer dal tubo di raccolta e posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta.
  7. Utilizzare la colonna di dissalazione equilibrata nei punti 2.1, 3.4 e 4.4.

2. Scambio tampone di anticorpi

NOTA: Rimuovere glicerolo, arginina e azoturo di sodio da anti-H3K27ac 10, anti-H3K27me3 10, anti-Med111 e anti-Pol II10 (vedere la composizione del tampone mostrata nella Tabella 1). Tutte le seguenti procedure vengono eseguite sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1 h

  1. Applicare la soluzione anticorpale (100 μL; vedere Tabella 2) su una colonna di desalinizzazione equilibrata preparata dopo la fase 1.
  2. Centrifugare a 1.500 × g per 2 minuti a 4 °C e trasferire il flusso dalla provetta di raccolta a una provetta proteica a basso legame da 1,5 ml.
  3. Misurare la concentrazione di IgG utilizzando l'assorbanza a 280 nm12 (utilizzare uno spettrofotometro a microvolume).
  4. Trasferire la soluzione anticorpale in una cassetta di ultrafiltrazione (cut-off del peso molecolare 100 kDa, 0,5 mL, vedere la tabella dei materiali) e centrifugare a 12.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
  5. Misurare la concentrazione di IgG utilizzando l'assorbanza a 280 nm.
  6. Ripetere i passaggi 2,4-2,5 fino a quando la concentrazione di IgG raggiunge 1 mg/ml.

3. Attivazione anticorpale

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2.5 h

  1. Sciogliere 1 mg di succinimidil 6-idrazinonicotinato acetone hydrazone (S-HyNic; vedere la tabella dei materiali) con 100 μL di N,N-dimetilformammide anidra (DMF; vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: DMF è un solvente organico infiammabile e una potente tossina epatica assorbita attraverso la pelle. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  2. Aggiungere 0,6 μL di S-HyNic/DMF a 100 μL della soluzione anticorpale (1 mg/mL in 150 mM NaCl/100 mM di fosfato di sodio, pH8,0. Vedere Tabella 2 per gli anticorpi usati e le IgG di controllo.
  3. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore (proteggere dalla luce).
  4. Applicare 100 μL di anticorpo S-HyNic-reagito sulla parte superiore della colonna di desalinizzazione equilibrata (vedere punto 1) e centrifugare a 1.500 × g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere il campione.
  5. Eliminare la colonna di dissalazione dopo l'uso.
    NOTA: La stabilità dei gruppi HyNic su proteine e altre biomolecole varia. Si raccomanda di coniugare immediatamente le biomolecole modificate da HyNic.

4. Attivazione della sonda del DNA

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2.5 h

  1. Sciogliere un pellet di una sonda di DNA modificata dall'ammina per gli anticorpi o controllare le IgG (Antibody Probe, Tabella 3) con 20 μL di tampone fosfato di sodio 150 mM NaCl/100 mM, pH 8,0.
    NOTA: Cercare un pellet/film sottile e trasparente sul fondo del tubo. Applicare il tampone direttamente sul pellet. Se il pellet non è visibile, il pellet potrebbe essersi staccato e aderito alla parete o al coperchio. In questo caso, centrifugare il tubo e cercare un pellet sul fondo del tubo.
  2. Sciogliere 1 mg di succinimidil 4-formilbenzoato (S-4FB; vedere la tabella dei materiali) con 50 μL di DMF anidro e aggiungere 10 μL di DMF alla sonda anticorpale disciolta.
  3. Aggiungere 4 μL di S-4FB/DMF preparato al punto 4.2, mescolare e incubare a temperatura ambiente per 2 ore (proteggendo dalla luce).
  4. Applicare 34 μL di sonda anticorpale con reazione S-4FB sulla parte superiore della colonna di desalinizzazione equilibrata (vedere punto 1).
  5. Applicare 15 μL di tampone fosfato di sodio 150 mM NaCl/100 mM, pH 8,0, sulla parte superiore del letto di gel dopo che il campione è stato completamente assorbito e centrifugare a 1.500 × g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere la sonda anticorpale modificata S-4FB.
  6. Utilizzare il flowthrough per la successiva coniugazione; misurare l'assorbanza a 260 nm; e calcolare il tasso di recupero della sonda anticorpale.

5. Coniugazione dell'anticorpo modificato S-HyNic e della sonda anticorpale modificata da S-4FB

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2 h

  1. Mescolare l'anticorpo modificato S-HyNic e la sonda anticorpale modificata S-4FB e pipettare la soluzione su e giù per miscelare.
  2. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente (proteggendo dalla luce).
  3. Per estinguere la reazione, aggiungere 478,8 μL di soluzione di tempra e conservazione (vedere Tabella 1).
  4. Trasferire la soluzione anticorpale coniugata con sonda anticorpale in una cassetta di ultrafiltrazione (cut-off del peso molecolare 100 kDa).
  5. Centrifugare per 5 min a 12.000 × g, 4 °C.
  6. Controllare il volume della soluzione all'interno della cassetta mediante pipettaggio.
  7. Ripetere i punti 5,5-5,6 fino a raggiungere il volume di 100 μL e conservare a -20 °C.
    NOTA: La concentrazione di IgG viene misurata mediante sandwich ELISA13,14,15 utilizzando uno standard IgG.

6. Preparazione di perle magnetiche del nucleo

NOTA: In questo metodo, una singola cella è incorporata in una perla di acrilammide a doppio strato (vedere Figura 2). Il nucleo è una perla magnetica in poliacrilammide. Lo strato esterno è solo poliacrilammide. Le perle magnetiche del nucleo sono generate in questa sezione. Questa sezione non è essenziale per l'esperimento. Tempo: 3 h

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Figura 2: Struttura di una perla di poliacrilammide a doppio strato per la visibilità e la facilità d'uso negli esperimenti REpi-seq . (A) Nanoparticelle magnetiche della fase 6.6 dopo la centrifugazione. Le nanoparticelle magnetiche sono modificate con acrilammide monomerica e integrate nella perla magnetica di poliacrilammide mostrata in B. (B) Rappresentazione schematica di una singola cella riutilizzabile con una perla magnetica di poliacrilammide. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

  1. Mescolare 50 μL di tampone bicarbonato di sodio 1 M, pH 8,5, e 450 μL di soluzione di acrilammide al 40%.
    NOTA: L'acrilammide è una neurotossina. Indossare guanti, una protezione per gli occhi e un camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  2. Sospendere 1 g di polvere di ossido di ferro funzionalizzata con estere NHS (vedere la tabella dei materiali) nel tampone acrilammide/bicarbonato di sodio e incubare a 4 °C per una notte.
    NOTA: Poiché le perle di acrilammide sono trasparenti, potrebbe essere difficile vedere e manipolare la posizione delle perle. L'inclusione di una perla di anima in ossido di ferro migliora la visibilità e facilita la manipolazione perché la posizione delle perle può essere controllata utilizzando un magnete. Tuttavia, se gli utenti hanno familiarità con gli esperimenti REpi-seq, l'uso delle perle magnetiche di poliacrilammide può essere saltato.
  3. Trasferire la sospensione di nanobead in 2 tubi (1,5 ml), centrifugare a 21.300 × g per 1 ora (utilizzare un rotore angolato) a 4 °C e rimuovere il surnatante.
  4. Sospendere il liquame inferiore con 1 mL di acrilammide/bisacrilammide al 40% (19:1, vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: Bis-acrilammide è una neurotossina. Indossare guanti e camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  5. Centrifugare a 21.300 × g per 1 h (utilizzare un rotore angolato) a 4 °C.
  6. Centrifugare a 5.000 × g per 30 minuti (utilizzare un rotore oscillante senza freno) a 4 °C.
  7. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta P1000 con aspirazione a bassa velocità.
  8. Regolare il volume a 400 μL di acrilammide/bisacrilammide (19:1, vedere la tabella dei materiali).
  9. Aggiungere 25 μL di soluzione di persolfato di ammonio al 10% (vedere Tabella 1).
    NOTA: Il persolfato di ammonio è un forte agente ossidante. La polvere sospesa nell'aria contenente persolfato di ammonio può irritare l'occhio, il naso, la gola, i polmoni e la pelle al contatto. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  10. Per generare perle magnetiche di poliacrilammide, trasferire 0,5 μL della sospensione di ossido di ferro modificato con acrilammide in un tubo PCR.
  11. Aggiungere 50 μL di 4% di N,N,N' ,N'-TETRAMETILETILENDIAMMINA/OLIO MINERALE (TEMED, vedere Tabella 1) e incubare per una notte a temperatura ambiente.
    NOTA: TEMED è un solvente infiammabile. Lavora sotto un cofano. Non inalare. Tenere lontano da fiamme libere, superfici calde e fonti di accensione. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.

7. Modifica del gruppo amminico delle proteine cellulari con acrilammide monomero

NOTA: REpi-seq è stato progettato per analizzare l'epigenoma di cellule di topo e umane a livello di singola cellula. Ogni passaggio deve essere ottimizzato quando si utilizza questo metodo su cellule di specie diverse dal topo o dall'uomo.

  1. Raccolta delle cellule
    NOTA: Tempo: 30 min
    1. Misurare la concentrazione e la vitalità delle celle utilizzando un contatore di celle (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: la vitalità delle celle in questa fase influisce sul numero di celle vive nell'analisi dei dati.
    2. Regolare la concentrazione cellulare a 1 × 105 cellule/ml con terreno di coltura (*) contenente il 10% di siero fetale bovino.
      NOTA: *Il terreno di coltura è un terreno di coltura ottimale per le cellule di interesse.
    3. Trasferire 1 mL della sospensione cellulare in un tubo da 1,5 mL.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 240 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.
    5. Aggiungere 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS), mescolare le cellule mediante pipettaggio delicato e centrifugare la sospensione cellulare a 240 × g per 5 minuti a 4 °C.
    6. Rimuovere il surnatante.
      NOTA: tutti i passaggi precedenti devono essere eseguiti in una cappa pulita a flusso laminare per evitare contaminazioni.
  2. Modifica del gruppo amminico delle proteine cellulari con acrilammide monomerica
    NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1.5 h
    1. Aggiungere 1 mL di soluzione di modifica del gruppo amminico (vedere Tabella 1) al pellet cellulare e sospendere il pellet cellulare mediante pipettaggio delicato.
    2. Incubare la provetta su ghiaccio per 1 ora e centrifugare la sospensione cellulare a 240 × g per 5 minuti a 4 °C.
    3. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con 100 ml di acrilammide al 4% / 1 mM EDTA / PBS contenenti un colorante intercalatore per DNA (vedere Tabella 1, 1 cellula/μL).

8. Preparazione di singole celle riutilizzabili

  1. Preparazione di singole celle riutilizzabili (versione manuale)
    NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 9 h/96 celle
    1. Mescolare 1 mL della sospensione cellulare (1 cellula/μL) e 199 mL di 1 mM EDTA/PBS contenente un colorante intercalatore per il DNA (vedere Tabella 1).
    2. Trasferire 200 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di piastre a fondo piatto a 96 pozzetti (totale 10 piastre, vedere la tabella dei materiali).
    3. Posizionare il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e scansionare le 10 piastre utilizzando un microscopio a scansione (vedere la tabella dei materiali) per identificare i pozzetti contenenti una singola cellula.
    4. Trasferire il contenuto del pozzetto contenente una singola cellula in un tubo PCR.
      1. Inclinare la piastra (verso l'operatore) e attendere alcuni minuti fino a quando la singola cella non è affondata sul bordo inferiore del pozzetto.
      2. Posizionare la punta della pipetta nell'angolo inferiore e trasferire la singola cella e il tampone (aspirare 210 μL/pozzetto = 200 μL di tampone + 10 μL di aria) in una provetta PCR.
        NOTA: assicurarsi di utilizzare una punta P200 a bassa ritenzione.
      3. Controllare il pozzetto utilizzando un microscopio a fluorescenza per confermare il trasferimento.
      4. Se una singola cellula è ancora nel pozzo, aggiungere 200 μL/pozzetto di 1 mM EDTA/PBS contenente un colorante intercalatore per il DNA.
      5. Quindi, ripeti il trasferimento.
    5. Centrifugare il tubo PCR a 240 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante senza freno.
      NOTA: La frenata provoca un flusso vorticoso di acqua nel tubo, che interrompe la precipitazione della singola cellula. Quando si centrifuga con un rotore oscillante senza freno, la singola cella affonderà sempre sul fondo del tubo. Tuttavia, se viene utilizzato un rotore angolato, la singola cella si attacca alla parete laterale del tubo PCR e potrebbe essere persa.
    6. Rimuovere 195 μL del surnatante con una velocità di pipettaggio molto lenta.
    7. Aggiungere 195 μL/tubo di soluzione di acrilammide/bis-acrilammide/APS (vedere tabella 1).
    8. Centrifugare il tubo PCR a 240 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante senza freno.
    9. Rimuovere 195 μL del surnatante con una velocità di pipettaggio molto lenta.
    10. Trasferire i 3 μL inferiori alla provetta PCR contenente il 4% di TEMED/olio minerale e una perla magnetica in poliacrilammide (generata nella fase 6).
      NOTA: assicurarsi di utilizzare una punta P10 a bassa ritenzione. Erogare la cella vicino al tallone magnetico in poliacrilammide. Nell'olio minerale, il liquido contenente la singola cellula aderisce alla superficie del tallone magnetico di poliacrilammide per tensione superficiale.
    11. Incubare durante la notte a temperatura ambiente.
      NOTA: Questo processo genera una perla di gel di acrilammide a doppio strato. Il nucleo è una perla di gel magnetico. Lo strato esterno è un gel di poliacrilammide contenente una singola cellula. La singola cellula è incorporata nello strato esterno del gel. Punto di arresto sicuro: dopo aver lavato le singole celle riutilizzabili con glicerolo al 50% / 1 mM EDTA / tampone BSA / TBS al 20% / 0,5%, le singole celle riutilizzabili possono essere conservate a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.
  2. Preparazione di celle singole riutilizzabili (versione semiautomatica)
    NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 3 h/96 celle
    1. Mescolare 1 mL di sospensione cellulare (1 cellula/μL) e 199 mL di 1 mM EDTA/PBS contenente un colorante intercalatore per DNA (vedere Tabella 1).
    2. Trasferire 200 μL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di nanopozzetti da 4 nL (vedere la Figura 3 e la Tabella dei materiali) e posizionare la piastra dei nanopozzetti da 4 nL su un robot automatizzato di prelievo a cella singola (vedere la Tabella dei materiali).
    3. Posizionare una piastra PCR a 96 pozzetti come piastra di destinazione sul robot automatizzato di prelievo a cella singola. Assicurarsi che ogni pozzetto contenga 200 μL/pozzetto Soluzione di acrilammide/Bis-acrilammide/APS (vedere Tabella 1).
    4. Trasferire una singola cellula da un nanopozzetto da 4 nL a un pozzetto della piastra PCR a 96 pozzetti (vedere Video supplementare S1).
    5. Mettere un coperchio sopra la piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 240 × g per 5 minuti a 4 °C utilizzando un rotore oscillante senza freno.
    6. Posizionare la piastra PCR a 96 pozzetti sul ponte di un robot automatico per la gestione dei liquidi (vedere la tabella dei materiali, figura 4 e codice supplementare 1).
    7. Trascinare e rilasciare il codice supplementare 1 nella finestra del software (vedere la tabella dei materiali) del robot per la gestione dei liquidi.
    8. Eseguire il programma sul robot automatico per la gestione dei liquidi (vedere Video supplementare S2 e Video supplementare S3).
      1. Rimuovere 195 μL del surnatante con una velocità di pipettaggio molto lenta.
      2. Aggiungere 50 μL di TEMED al 4%.
        NOTA: i passaggi da 8.2.8.1 a 8.2.8.2 possono essere eseguiti mediante pipettaggio manuale.
    9. Incubare durante la notte a temperatura ambiente (Figura 5). Punto di arresto sicuro: dopo aver lavato le singole cellule riutilizzabili con glicerolo al 50% / 1 mM EDTA / tampone BSA / TBS al 20% / 0,5%, conservare le singole celle riutilizzabili a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.

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Figura 3: Prelievo automatico di una singola cellula e trasferimento in una piastra PCR a 96 pozzetti nella fase 8.2 . (A) Panoramica di un sistema di prelievo a singola cella. Un robot di prelievo a cella singola è in una cappa pulita a flusso laminare per evitare la contaminazione. (B) Una piastra da 24 pozzetti con 4 nanopozzetti nL all'interno del pozzetto. (C) Distribuzione cellulare in un pozzetto dalla piastra a 24 pozzetti. I punti verdi sono cellule identificate come una singola cellula in ogni nanopozzetto da 4 nL. I punti magenta sono cellule identificate come doppietti o multipletti di cellule. (D) Immagine in campo chiaro del pozzo nella piastra a 24 pozzetti. Un quadrato verde è un nanopozzetto da 4 nL contenente una singola cellula. Un quadrato magenta è un nanopozzetto da 4 nL contenente più cellule. (E) Campo ingrandito di circa 4 nanopozzetti nL. I punti luminosi sono singole cellule in nanopozzetti da 4 nL. Il sistema di prelievo di singole cellule identifica i nanopozzetti contenenti una singola cellula acquisendo immagini in campo chiaro e fluorescenza di cellule con colorazione DAPI. Le singole cellule identificate vengono trasferite dal nanopozzetto da 4 nL a un pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Barre di scala = 2 mm (C, D), 100 μm (E). Abbreviazione = DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Generazione di singole celle riutilizzabili utilizzando un robot per la gestione dei liquidi. (A) Un ponte del robot per la gestione dei liquidi. Il deck dispone di 11 slot per rack di punta per pipette (punta P300: slot 1-3, punta P20: slot 5-6), 2 mL di piastra da 96 pozzetti (slot 4), due piastre PCR a 96 pozzetti contenenti una singola cella per pozzetto (slot 7 e 10) e due piastre a fondo piatto a 96 pozzetti per rifiuti liquidi (slot 8 e 11). (B) Il mazzo dopo aver posizionato l'attrezzatura da laboratorio. (C) Rappresentazione schematica del pipettaggio robotizzato nella fase 8.8.1. Il programma rimuove il surnatante senza aspirare una singola cellula dal fondo della piastra PCR a 96 pozzetti. (D) Celle singole riutilizzabili generate utilizzando il codice supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

9. Ricottura ed estensione del primer casuale

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Gli asterischi (*) nei passi seguenti indicano che un separatore magnetico può essere utilizzato per controllare la posizione delle sfere di poliacrilammide contenenti una singola cella riutilizzabile nel tubo. Tuttavia, l'uso del separatore magnetico non è essenziale. Spostandosi lentamente lungo la punta della pipetta lungo la parete del tubo, le perline vengono spinte verso l'alto per il lavaggio o lo scambio di tampone. Tempo: 9 h

  1. Rimuovere l'olio minerale mediante pipettaggio(*) e lavare (*) 5 volte con 200 μL di tampone 1x TP Mg(-) (diluire 10x tampone TP Mg(-) in 1x tampone con acqua ultrapura, vedere Tabella 1).
  2. Rimuovere il surnatante (*) e aggiungere 15 μL di tampone di ricottura (vedere Tabella 1).
  3. Incubare per 1 ora su ghiaccio.
    NOTA: Lo scopo di questa incubazione è quello di permeabilizzare il plasma e le membrane nucleari e fornire il primer casuale al nucleo cellulare.
  4. Posizionare i tubi PCR su un termociclatore e riscaldare a 94 °C per 3 minuti.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 20 μL, compreso il volume della perla di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  5. Trasferire i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e incubare per 2 minuti.
  6. Aggiungere 4 μL di miscela MgSO4/NaCl/dNTP (vedere Tabella 1) e mescolare con un miscelatore a vortice a velocità media.
  7. Aggiungere 1 μL di Bst polimerasi, frammento grande (vedere la tabella dei materiali) e mescolare utilizzando un miscelatore a vortice a velocità media.
  8. Incubare per 4 ore su uno shaker (600 rpm a 4 °C).
    NOTA: Lo scopo di questa incubazione è quello di fornire la Bst polimerasi al nucleo cellulare.
  9. Posizionare il tubo PCR su un termociclatore ed eseguire uno dei seguenti programmi.
    1. Eseguire un programma di 4 ore: 10 °C per 30 min, 20 °C per 30 minuti e 25 °C per 180 min.
    2. In alternativa, eseguire un programma notturno: 4 °C per 4 ore, 10 °C per 2 ore, 20 °C per 2 ore, 25 °C per 4 ore e tenere a 4 °C.
      NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 25 μL, compreso il volume della perla di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C. Punto di arresto sicuro: interrompere l'esperimento qui per un massimo di 1 giorno conservando le singole celle riutilizzabili a 4 °C.

10. Legame anticorpale

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1.5 h

  1. Aggiungere 1,625 μL di soluzione di NaCl/EDTA/BSA (vedere Tabella 1) e mescolare a vortice a bassa velocità.
    NOTA: Questo passaggio mira a 1) facilitare la chelazione di Mg2+ da parte dell'EDTA, 2) stabilizzare il legame del 1° primer casuale esteso di 300 mM NaCl e 3) bloccare il legame aspecifico degli anticorpi usando l'albumina sierica bovina (BSA) nella reazione successiva.
  2. Incubare per 1 ora su ghiaccio e aggiungere 0,1 μg/ml ciascuno di anticorpi e IgG di controllo coniugati con la sonda anticorpale (preparata al punto 5).
  3. Incubare durante la notte sul ghiaccio agitando delicatamente su uno shaker.

11. Legatura di prossimità della sonda anticorpale e primer casuale esteso prossimalmente

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Gli asterischi (*) nei passi seguenti indicano dove un separatore magnetico può essere utilizzato per controllare la posizione delle sfere di poliacrilammide contenenti una singola cella riutilizzabile nel tubo. Tuttavia, l'uso del separatore magnetico non è essenziale. Spostandosi lentamente lungo la punta della pipetta lungo la parete del tubo, le perline possono essere spinte verso l'alto per il lavaggio o lo scambio tampone. Tempo: 6 h

  1. Lavare (*) due volte con 200 μL di 1x tampone TPM-T (20 minuti di incubazione in ogni lavaggio) su ghiaccio. Diluire 10x tampone TPM-T (Tris-HCl/cloruro di potassio/solfato di magnesio/Triton X-100) a 1x con acqua ultrapura).
  2. Rimuovere (*) il surnatante e lavare (*) una volta con 1x tampone T4 DNA ligasi (vedere la tabella dei materiali).
  3. Rimuovere (*) il surnatante e aggiungere 19 μL di soluzione adattatore di legatura (vedere Tabella 1).
  4. Incubare per 1 h a 25 °C.
  5. Aggiungere 1 μL di T4 DNA ligasi (vedere la tabella dei materiali) e mescolare il tubo su un miscelatore a vortice a velocità media.
  6. Posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il seguente programma: programma di legatura di prossimità, 4 ore a 16 °C e 30 minuti a 25 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 25 μL, compreso il volume della perla di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è a temperatura ambiente.
  7. Lavare (*) due volte brevemente con 200 μL di 1x tampone Bst Mg(-) EDTA(+) (vedere Tabella 1; preparare 1x tampone da 10x tampone stock) e conservare la cella a 4 °C, durante la notte. Punto di arresto sicuro: interrompere l'esperimento qui per un massimo di 1 giorno conservando le singole celle riutilizzabili a 4 °C.

12. Estensione completa del 1 ° primer casuale

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 4.5 h

  1. Lavare due volte con 200 μL di tampone Bst Mg(-) EDTA(-) (vedere Tabella 1, preparare 1x tampone da 10x tampone stock), rimuovere il surnatante e aggiungere 20 μL di miscela Bst/dNTPs/MgSO4 (vedere Tabella 1).
  2. Mescolare con un miscelatore a vortice a media velocità e incubare per 4 ore su uno shaker orbitale (a 6 °C e 500 giri/min).
  3. Posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il seguente programma: programma di estensione completa: 10 °C per 1 ora, 20 °C per 1 ora, 30 °C per 1 ora, 40 °C per 1 ora, 50 °C per 1 ora, 65 °C per 1 ora, 94 °C per 10 minuti e tenere a 4 °C.
    NOTA: Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere interrotto qui per un massimo di 1 giorno conservando le singole celle riutilizzabili a 4 °C.

13. Amplificazione a spostamento multiplo

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2,5 h (fasi 13.1-13.2) + 15 min (fasi 13.3-13.4) + 1 giorno (fasi 13.5-13.10)

  1. Aggiungere 0,4 μL di 100 μM 2° primer casuale (vedi Tabella 3) e mescolare con un miscelatore a vortice a media velocità.
  2. Incubare per 2 ore a 6 °C e 500 giri/min su uno scuotitore orbitale, posizionare il tubo su un termociclatore e riscaldare a 94 °C per 3 minuti.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 25,4 μL, compreso il volume del tallone di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  3. Posizionare i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e aggiungere 1 μL/tubo di Bst DNA polimerasi.
  4. Vortice a bassa velocità, posizionare i tubi su un termociclatore ed eseguire il seguente programma:
    4 °C per 4 ore, 10 °C per 30 min, 20 °C per 30 min, 30 °C per 30 min, 40 °C per 30 min, 50 °C per 30 min, 65 °C per 60 min, 94 °C per 3 min, e tenere a 4 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 26,4 μL, compreso il volume del cordone di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C. Punto di arresto sicuro: interrompere l'esperimento qui per un massimo di 1 giorno conservando le singole celle riutilizzabili a 4 °C.
  5. Raccogliere il surnatante (circa 20 μL) e trasferirlo in un tubo PCR.
  6. Conservare il surnatante raccolto a -80 °C.
  7. Aggiungere 20 μL/tubo di tampone Tween 20/0.1x TE allo 0,05% a una provetta PCR contenente la singola cellula riutilizzabile (vedere Tabella 1) e incubare la singola cella riutilizzabile a 4 °C, durante la notte. Punto di arresto sicuro: interrompere l'esperimento qui per alcuni giorni prolungando il tempo di incubazione.
  8. Raccogliere il surnatante e combinarlo con il campione raccolto al punto 13.5.
  9. Ripetere ancora una volta i passaggi 13.7-13.8. Immergere la singola cella riutilizzabile in un tampone 50% glicerolo/5 mM EDTA/0,5% BSA/0,05% Tween20/TBS e incubarlo per 30 minuti su uno shaker orbitale (4 °C, 600 rpm). Conservare la singola cella riutilizzabile a -20 °C fino al prossimo esperimento.
  10. Aggiungere 40 μL di Exo-master mix (vedere Tabella 1) e posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il seguente programma: i) 95 °C per 5 min, ii) 95 °C per 30 s, iii) 60 °C 30 s, iv) 72 °C per 30 s, v) ripetere i passaggi ii-iv 19 volte, vi) 72 °C per 5 min, vii) tenere a 4 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di circa 45 μL, compreso il volume della perla di poliacrilammide. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C. Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere fermato qui per almeno alcuni giorni conservando il campione a -80 °C.

14. Purificazione fenolo-cloroformio e precipitazione di polietilenglicole

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1.5 h

  1. Trasferire il prodotto in una provetta a basso legame di DNA da 0,5 mL e aggiungere 100 μL di fenolo:cloroformio:alcool isoamilico.
    NOTA: Fenolo: Cloroformio: Isoamil L'alcol provoca irritazione e possibilmente ustioni per contatto. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Utilizzare solo con un'adeguata ventilazione o indossare un respiratore appropriato. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  2. Agitare per 30 s a mano e centrifugare a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
  3. Raccogliere la fase acquosa (80 μL) in una provetta a basso legame di DNA da 0,5 mL e aggiungere 40,84 μL/tubo di miscela lineare acrilammide/MgCl2 (vedere Tabella 1).
  4. Aggiungere 47,06 μL/tubo al 50% (p/v) PEG8000 (senza RNasi) e miscelare mediante pipettaggio.
  5. Incubare per 20 min a temperatura ambiente e centrifugare a 240 × g per 10 min a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere il surnatante e aggiungere 400 μL/tubo di etanolo all'80% (EtOH).
  7. Lavare con 80% di EtOH, rimuovere il surnatante con un aspiratore e asciugare all'aria il pellet.
  8. Sospendere il pellet con 20 μL di 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl, tampone pH 7,4, e conservare la soluzione a -80 °C.
    NOTA: Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un colorante intercalatore specifico per DNA a doppio filamento (vedere la Tabella dei materiali). Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente fermato qui per almeno una settimana.

15. Trascrizione in vitro

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi e RNasi. Tempo: 5 h

  1. Scongelare il DNA dei prodotti derivati da singole cellule (dalla fase 14) e preparare una libreria mista di prodotti derivati da singole cellule mescolando 2 μL/cellula dei prodotti a base di DNA (volume totale 20 μL).
  2. Aggiungere 26 μL di master mix di trascrizione in vitro (vedere la tabella dei materiali e il protocollo del produttore) e miscelare mediante pipettaggio.
  3. Posizionare il tubo PCR su un termociclatore e incubare per 4 ore a 37 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di 46 μL. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  4. Aggiungere 5 μL di tampone 10x DNasi I (vedere la Tabella dei Materiali) e aggiungere 4 μL di DNasi I (senza RNasi, 4 U, vedere la Tabella dei Materiali).
  5. Mescolare e incubare per 15 minuti a 37 °C e trasferire il campione in una provetta da 0,5 ml.
  6. Aggiungere 300 μL/tubo di guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio (vedere la tabella dei materiali) e mescolare mediante vortice delicato.
    NOTA: Il guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio può causare gravi ustioni chimiche per contatto. Indossare guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Utilizzare solo con un'adeguata ventilazione o indossare un respiratore appropriato. Seguire le linee guida di sicurezza istituzionali. Scartare gli oggetti da laboratorio usati secondo le linee guida istituzionali.
  7. Incubare per 5 minuti a RT su uno shaker e quindi conservare i campioni a -80 °C per un massimo di 3 giorni.
    NOTA: punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente interrotto qui per un massimo di 3 giorni.

16. Purificazione dell'RNA

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi e RNasi. Tempo: 2 h

  1. Aggiungere 80 μL/tubo di cloroformio al campione del punto 15.7 e agitare vigorosamente la provetta a mano per 15 s.
  2. Incubare per 2-15 minuti a temperatura ambiente e centrifugare il campione a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C.
  3. Raccogliere e trasferire la fase acquosa del campione (~200 μL) in una nuova provetta da 1,5 ml.
  4. Aggiungere 600 μL/tubo di guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio e trasferire il campione in una provetta da 1,5 ml.
  5. Aggiungere 180 μL/tubo di cloroformio e agitare vigorosamente il tubo a mano per 15 s.
  6. Centrifugare il campione a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
  7. Raccogliere e trasferire la fase acquosa del campione (~450 μL) in una provetta da 1,5 ml.
  8. Aggiungere 60 μL/tubo di acrilammide lineare (5 μg/μL) e aggiungere 400 μL/tubo di isopropanolo al 100% alla fase acquosa.
  9. Incubare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti e centrifugarlo a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
  10. Rimuovere accuratamente il surnatante .
  11. Lavare il pellet di RNA 3 volte con 200 μL di etanolo al 75% (acqua priva di EtOH / RNasi), rimuovere il surnatante e asciugare all'aria il pellet di RNA.
    NOTA: Non lasciare asciugare completamente l'RNA perché il pellet può perdere solubilità.
  12. Risospendere il pellet di RNA in 20 μL di acqua priva di RNasi contenente un inibitore della RNAsi (1 μL/20 μL) e sciogliere il pellet mediante pipettaggio.
  13. Misurare l'assorbanza a 260 nm.

17. Trascrizione inversa

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 1 h

  1. Aggiungere 7 μL/tubo di primer a trascrizione inversa + miscela dNTP (vedere Tabella 1 e Tabella 3) e posizionare i tubi su un termociclatore.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di 27 μL. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  2. Riscaldare a 65 °C per 5 minuti e posizionare i tubi sul ghiaccio per almeno 1 min.
  3. Aggiungere 14 μL/tubo di master mix di trascrittasi inversa (vedere Tabella 1) e miscelare mediante pipettaggio.
  4. Posizionare i tubi su un termociclatore e incubarli a 55 °C per 10 minuti e poi a 80 °C per 10 minuti.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di 60 μL. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.

18. Sintesi del secondo filamento

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 2.5 h

  1. Aggiungere 40 μL/tubo di acqua ultrapura e dividere la soluzione da 100 μL in due provette da 0,2 mL di PCR (50 μL/tubo).
  2. Aggiungere 60 μL/tubo di miscela di sintesi del secondo filamento (vedere Tabella 1) e posizionare i tubi su un termociclatore ed eseguire il seguente programma: i) 95 °C per 5 minuti, ii) 95 °C per 30 s, iii) 60 °C per 30 s, iv) 72 °C per 30 s, v) ripetere i passaggi ii-iv 20 volte e vi) tenere a 4 °C.
    NOTA: La dimensione del tubo è 0,2 ml. Il volume della soluzione è di 110 μL. La temperatura del coperchio del termociclatore è di 105 °C.
  3. Aggiungere 4,4 μL/tubo di 0,5 M EDTA (finale 20 mM) e conservare a -80 °C, per tutta la notte.
    NOTA: punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente interrotto qui per un massimo di alcuni giorni.
  4. Purificare il DNA mediante purificazione fenolo-cloroformio e precipitazione del glicole polietilenico (descritto nella fase 14).
    NOTA: Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente interrotto qui per almeno una settimana.

19. Digestione enzimatica di restrizione e selezione delle dimensioni

NOTA: la seguente procedura viene eseguita sotto un cappuccio pulito per evitare la contaminazione da DNasi. Tempo: 3 h (passi 19.1-19.7)

  1. Misurare la concentrazione di DNA del DNA purificato (dal punto 18.4) misurando l'assorbanza a 260 nm.
  2. Trasferire 6 μg di DNA in una provetta PCR, aggiungere 30 μL di tampone di digestione 10x e regolare il volume a 294 μL con acqua ultrapura.
  3. Aggiungere 6 μL di enzima di restrizione BciVI e incubare a 37 °C per 1 ora.
  4. Eseguire la precipitazione EtOH con poliacrilammide lineare.
    1. Aggiungere 60 μL/tubo di acetato di sodio 3 M (pH 5,2) e quindi aggiungere 40 μL/tubo di acrilammide lineare (5 mg/ml; vedere la tabella dei materiali).
    2. Aggiungere 400 μL/tubo di EtOH e incubare per una notte a -20 °C.
      NOTA: Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente fermato qui per un giorno.
    3. Centrifugare 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante.
    4. Lavare il pellet due volte con l'80% di EtOH e asciugare il pellet.
    5. Sciogliere il pellet con 20 μL di tampone 1xTE e aggiungere 4 μL/tubo di tampone 6x Gel Loading fresco.
  5. Caricare il campione in un gel di agarosio al 5% / tampone TAE 0,5x ed eseguire l'elettroforesi (50 V per 40 minuti).
  6. Tagliare e raccogliere il gel oltre 50 bp (vedere Figura 6) ed estrarre il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel.
    NOTA: Punto di arresto sicuro: l'esperimento può essere tranquillamente interrotto qui per almeno una settimana.
  7. Costruire la libreria di sequenziamento usando un kit di preparazione della libreria del DNA (vedi la Tabella dei Materiali)16,17.

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Risultati

Le singole celle K562 sono state generate utilizzando il protocollo descritto nel passaggio 8 (vedere la Figura 5). Le singole celle sono state incorporate nello strato esterno della perla di poliacrilammide. Il DNA cellulare è stato colorato e visualizzato utilizzando un colorante intercalatore per la colorazione del DNA.

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Figu...

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Discussione

Questo articolo descrive il protocollo passo-passo per l'analisi multiepigenomica a singola cellula recentemente riportata utilizzando singole cellule riutilizzabili7. Nei paragrafi successivi, discutiamo i punti critici, sottolineando i potenziali limiti nel protocollo.

Uno dei punti critici in tutto il protocollo (dai passaggi 7.2-13) è evitare la contaminazione da DNasi. Una singola cellula ha solo due copie di DNA genomico. Pertanto, danneggiare il DNA genomico rid...

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Dichiarazioni

Ohnuki e Tosato sono co-inventori di un brevetto intitolato "Metodi per la preparazione di una singola cellula riutilizzabile e metodi per analizzare l'epigenoma, il trascrittoma e il genoma di una singola cellula" (EP3619307 e US20200102604). La domanda di brevetto è stata depositata in parte sulla base dei risultati preliminari relativi alla tecnologia descritta nel manoscritto corrente. L'invenzione o le invenzioni descritte e rivendicate in questa domanda di brevetto sono state fatte mentre gli inventori erano dipendenti a tempo pieno del governo degli Stati Uniti. Pertanto, ai sensi del 45 Code of Federal Regulations Part 7, tutti i diritti, i titoli e gli interessi relativi a questa domanda di brevetto sono stati o dovrebbero essere assegnati per legge al governo degli Stati Uniti. Il governo degli Stati Uniti trasmette una parte delle royalties che riceve ai suoi inventori dipendenti ai sensi del 15 Codice degli Stati Uniti § 3710c.

Ringraziamenti

Ringraziamo i dottori David Sanchez-Martin e Christopher B. Buck per i commenti durante la fase di concettualizzazione del progetto. Ringraziamo anche il Genomics Core, il Center for Cancer Research, il National Cancer Institute, il National Institutes of Health per l'aiuto negli esperimenti preliminari e la Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH per i consigli nell'analisi computazionale. Ringraziamo la signora Anna Word per l'aiuto nell'ottimizzazione delle DNA polimerasi utilizzate nel metodo. Questo lavoro ha utilizzato le risorse computazionali del cluster NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). Questo progetto è supportato dal programma intramurale del Center for Cancer Research, dal National Cancer Institute, dal National Institutes of Health, dal NCI Director's Innovation Award (# 397172) e dai fondi federali del National Cancer Institute con contratto n. HHSN261200800001E. Ringraziamo i dottori Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy e tutti i membri del Laboratorio di Oncologia Cellulare per i commenti produttivi.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x CutSmarttampone New England BioLabsB600410x Tampone di digestione
200 proof etanoloWarner-Graham Company200 proofEtanolo
5-idrossimetilcitosina (5-hmC) Anticorpo monoclonale [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100Anti-5hmC
Acridina Arancio/Propidio Ioduro StainLogos BiosystemsF23001Contatore di cellule
Soluzione di acrilammide, 40% in H2O, per biologia molecolareMilliporeSigma01697-500MLSoluzione di acrilammide al 40%
Microscopio a fluorescenza all-in-one BZ-X710KeyenceBZ-X710Unità di
filtro centrifugo Amicon Ultra-0.5Cassetta di ultrafiltrazioneSigmaUFC510024
Persolfato di ammonio per biologia molecolareMilliporeSigmaA3678-100GPolvere di persolfato di ammonio
DMFanidro Vettorilaboratori S-4001-005Anidro N,N-dimetilformammide (DMF)
Anti-RNA polimerasi II CTD ripetere YSPTSPS (fosfo S5) anticorpo [4H8]Abcamab5408Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (fosfo T1457) anticorpoAbcamab60950Anti-Med1
BciVINew England BioLabsR0596LBciVI
Soluzione di albumina sierica bovina, 20 mg/mL in H2O, a bassa carica microbica, senza proteasi, per biologia molecolareMilliporeSigmaB8667-5ML20% BSA (Tabella 7)
Bst DNA polimerasi, frammento grandeNew England BioLabsM0275LBst DNA polimerasi
BT10 Serie 10 &; l Punta barrieraNEPTUNEBT10P10 Punta a bassa ritenzione
CellCelectorSoluzioni di laboratorio automatizzateN/ARobot di prelievo automatizzato a cella singola
CellCelector 4 piastre a nanopozzetti nl per la clonazione di singole cellule, piastra S200-100 100K, 24 pozzetti, ULAAutomated Lab SolutionsCC0079Piastra a 4 nanopozzetti da 4 nL
CloroformioMilliporoSigmaCloroformio
Corning Costar Micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti, trattata con colture cellulariCorning3596Piastre a fondo piatto a 96 pozzetti
DNA polimerasi a sfiato profondo (eso-) NewEngland BioLabsM0259LExo- DNA polimerasi
DNA LoBind Tubes, 0,5 mLEppendorf301080350,5 mL di provetta a basso legame
DNA DNA Oligo, 1° primer casualeTecnologie DNA integrateN/ A, vedi Tabella 31° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#01Integrated DNA TechnologiesN/A, vedi Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#02Integrated DNA TechnologiesN/A, vedi Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#03Integrated DNA TechnologiesN/A, vedi Tabella 32° primer
casualeDNA Oligo, 2° primer casuale Cell#04Integrated DNA TechnologiesN/A, vedi Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#05Integrated DNA TechnologiesN/A, vedi Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#06Integrated DNA TechnologiesN/A, vedi Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#07Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#08Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#09Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 32° primer
casuale DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#10Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#11Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer casuale Cell#12Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 32° primer casuale
DNA Oligo, 2° primer di sintesiDNA TechnologiesN/A, vedere Tabella 32° primer
di sintesiDNA Oligo, Adattatore di legaturaIntegrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 3Adattatore di legatura
DNA Oligo, Primer per trascrizione inversaDNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 3Primer per trascrizione inversa
DNase I (senza RNasi)New England BioLabsM0303LDNase I (senza RNasi, 4 U).
Tampone di reazione DNase INew England BioLabsB0303S10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM ciascuno)Thermo FisherR019210 mM dNTPs
Siero fetale bovino, origine USA, inattivato a caldoMilliporeSigmaF4135-500MLSiero fetale bovino
HiScribe T7 Kit di sintesi di RNA ad alto rendimentoNew England BioLabsE2040Smix di trascrizione in vitro
Anticorpo istone H3K27acMotivo attivo39133Anti-H3K27ac
Anticorpo istone H3K27me3Motivo attivo39155Anti-H3K27me3
IgG da siero di coniglioMillipore SigmaI5006-10MGControllo IgG
Ossido di ferro (II,III) nanopolvere magnetica, 30 nm dimensione media della parte (TEM), NHS estere funzionalizzatoMilliporeSigma747467-1GPolvere di ossido di ferro da 30 nm funzionalizzata con estere NHS
K-562Raccolta di colture di tipo americano (ATCC)Cellule CCL-243
Acrilammide lineare (5 mg/mL)Thermo FisherAM9520Acrilammide lineare
LUNA-FL Contatore di cellule a doppia fluorescenzaLogos BiosystemsL20001Contatore di cellule
LUNA Vetrini per conteggio cellulare, 50 vetriniLogosBiosystems L12001Contatore di cellule
Olio minerale, BioReagent, per biologia molecolare, olio leggeroMilliporeSigmaM5904-500MLOlio minerale
N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiammina per biologia molecolareMilliporeSigmaT7024-100MLN,N,N′,N′-Tetrametiletilendiammina
NaCl (5 M), senza RNasiThermo FisherAM9760G5M NaCl
NanoDrop LiteThermo Fisher2516  Spettrofotometro per microvolumi
NEST 2 mL Piastra a pozzetti profondi a 96 pozzetti, fondo a VOpentronsN/APiastra a 96 pozzetti con pozzetti profondi da 2 mL
Piastra PCR a 96 pozzetti senza bordoGenesee Scientific27-405Piastra per PCR a 96 pozzetti
NuSive GTG AgaroseLonza50081Agarose
OmniPur Acrilammide: Bis-acrilammide 19:1, soluzione al 40%MilliporeSigma1300-500MLRobot da laboratorio OT-2 al 40% acrilammide/bis-acrilammide
OpentronsOT2Robot automatizzato per la manipolazione dei liquidi
Paraformaldeide, grado EM, purificato, soluzione acquosa al 20%Scienze della microscopia elettronica1571320% pararmaldeide
PBS (10x), pH 7,4Thermo Fisher7001104410x PBS
PIPETMAN Classic P1000GILSONF123602A P1000 pipetta
Provette Protein LoBind, 1,5 mLEppendorf9250000901,5 mL Provetta a basso legame proteico
QIAgen Kit di estrazione su gelQiagen28706A Pipetta P1000
Quant-iT PicoGreen dsDNA AssayThermo FisherP11495  Kit di legatura rapida per colorante intercalante specifico per dsDNA
New England BioLabsM2200LT4 DNA ligasi (NEB)
RNaseOUT Inibitore della ribonucleasi ricombinanteThermo Fisher10777019Inibitore dell'RNAsi
S-4FB Crosslinker (solubile in DMF)Laboratori vettoriS-1004-105Succinimidil 4-formilbenzoato (S-4FB)
vettorialiS-HyNicS-1002-105Succinimidil 6-idrazinonicotinato acetone idrazone (S-HyNic)
Acetato di sodio, 3 M, pH 5.2, grado di biologia molecolareMilliporeSigma567422-100ML3M Acetato di sodio (pH 5.2)
Bicarbonato di sodio, 1M tampone soln., pH 8.5Alfa AesarJ604081M tampone bicarbonato di sodio, pH 8.5
Sodio fosfato bibasico per biologia molecolareMilliporeSigmaS3264-250GNa2HPO4
Fosfato di sodio monobasico per biologia molecolareMilliporeSigmaS3139-250GNaH2PO4
Trascrittasi inversa SuperScript IVThermo Fisher18090050Trascrittasi inversa
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10.000x concentrato in DMSO)Thermo FisherS11494Un colorante intercalante per DNA
T4 Tampone di reazione DNA ligasiNew England BioLabsB0202S10x T4 Tampone di reazione DNA ligasi
ThermoPol Pacchetto tampone di reazioneNew England BioLabsB9004S10x tampone TPM-T (Tris-HCl/Cloruro di pottasio/Solfato di magnesio/Triton X-100)
Reagente TRIzol LSThermo Fisher10296-028Estrazione di tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinio
Kit di preparazione della libreria di DNA TruSeq NanoIllumina20015965Un kit di preparazione della libreria di DNA (vedere anche le istruzioni del produttore)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 3Una sonda DNA modificata con ammina per l'anticorpo
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 3Una sonda DNA modificata con ammina per anticorpi
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 3Una sonda di DNA modificato con ammina per l'anticorpo
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 3Una sonda di DNA modificato con ammina per l'anticorpo
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 3Una sonda di DNA modificato con ammina per l'anticorpo
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001Integrated DNA TechnologiesN/A, vedere la Tabella 3Una sonda DNA modificata con ammina per il controllo IgG
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher155750200,5 M EDTA, pH 8,0
Acqua distillata UltraPure DNasi/RNasiThermo Fisher10977023Acqua ultrapura
Colonne di desalinizzazione Zeba Splin, 7K MWCO, 0,5 mLThermo Fisher89882Colonna di desalinizzazione
Integrated Integrated Master Laboratori

Riferimenti

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