Il presente protocollo descrive la precipitazione proteica a base solvente in condizioni controllate per il recupero e la purificazione robusti e rapidi dei campioni di proteoma prima della spettrometria di massa.
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Articolo metodologico
Precipitazione di proteine organiche a base di solventi per una robusta purificazione del proteoma prima della spettrometria di massa
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mentre i molteplici progressi negli strumenti di spettrometria di massa (MS) hanno migliorato l'analisi qualitativa e quantitativa del proteoma, approcci front-end più affidabili per isolare, arricchire e processare le proteine prima della SM sono fondamentali per una caratterizzazione del proteoma di successo. Il recupero proteico basso e incoerente e le impurità residue come i tensioattivi sono dannosi per l'analisi della SM. La precipitazione delle proteine è spesso considerata inaffidabile, dispendiosa in termini di tempo e tecnicamente impegnativa da eseguire rispetto ad altre strategie di preparazione del campione. Queste preoccupazioni vengono superate utilizzando protocolli ottimali di precipitazione delle proteine. Per la precipitazione dell'acetone, la combinazione di sali specifici, controllo della temperatura, composizione del solvente e tempo di precipitazione è fondamentale, mentre l'efficienza della precipitazione del cloroformio / metanolo / acqua dipende dal corretto pipettaggio e manipolazione del flaconcino. In alternativa, questi protocolli di precipitazione sono semplificati e semi-automatizzati all'interno di una cartuccia di spin usa e getta. I risultati attesi della precipitazione proteica a base di solvente nel formato convenzionale e utilizzando una cartuccia di filtrazione ed estrazione monouso a due stadi sono illustrati in questo lavoro. Ciò include la caratterizzazione dettagliata delle miscele proteomiche mediante analisi LC-MS/MS bottom-up. Le prestazioni superiori dei flussi di lavoro basati su SDS sono dimostrate anche rispetto alle proteine non contaminate.
Introduzione
L'analisi del proteoma mediante spettrometria di massa è diventata sempre più rigorosa, grazie alla maggiore sensibilità, risoluzione, velocità di scansione e versatilità dei moderni strumenti MS. I progressi della SM contribuiscono a una maggiore efficienza di identificazione delle proteine e a una quantificazione più precisa 1,2,3,4,5. Con una migliore strumentazione per la SM, i ricercatori richiedono una strategia di preparazione del campione front-end corrispondentemente coerente in grado di recuperar....
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Protocollo
1. Considerazioni sui materiali e pre-preparazione del campione
- Utilizzare solo solventi ad alta purezza (acetone, cloroformio, metanolo) (>99,5%) e sostanze chimiche, privi di umidità in eccesso.
- Preparare soluzioni di cloruro di sodio e solfato di zinco (1 M) in acqua.
NOTA: le soluzioni saline possono essere conservate indefinitamente a temperatura ambiente, purché siano prive di contaminanti o crescita microbica. - Utilizzare il più piccolo flaconcino di microcentrifuga in polipropilene (PP) sufficiente a trattenere il volume richiesto di campione e solventi per indurre la precipitazione.
- Assicurarsi che la....
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Risultati
La Figura 4 riassume l'esaurimento SDS previsto a seguito della precipitazione di proteine basate su flaconcino o facilitata dalla cartuccia in una cartuccia filtrante monouso che utilizza acetone. L'incubazione notturna convenzionale (-20 °C) nell'acetone viene confrontata con il protocollo di precipitazione rapida dell'acetone a temperatura ambiente (fase 2), così come la precipitazione CMW (fase 4). La SDS residua è stata quantificata dal saggio dei principi attivi blu di metilene (MBAS)<.......
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Discussione
La caratterizzazione ottimale della SM si ottiene quando la SDS residua è esaurita al di sotto di 10 ppm. Mentre approcci alternativi, come FASP e digestione su perline, offrono un esaurimento quantitativo della SDS con recupero variabile 31,32,33, l'obiettivo primario delle precipitazioni è massimizzare la purezza e la resa contemporaneamente. Ciò dipende dall'isolamento efficace del surnatante (contenente la SDS) senza disturb.......
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Dichiarazioni
Il laboratorio Doucette ha ideato e brevettato il ProTrap XG impiegato in questo studio. AAD è anche socio fondatore di Proteoform Scientific, che ha commercializzato la cartuccia per la preparazione dei campioni.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Gli autori ringraziano Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) e SPARC BioCentre (Molecular Analysis) presso l'Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) per il loro contributo all'acquisizione dei dati sulla SM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetone | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤ 0,002 % aldeide |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | Grado HPLC |
| Bicarbonato di ammonio | Millipore Sigma | A6141-1KG | solido |
| Beta mercaptoetanolo | Millipore Sigma | M3148-25ML | Grado in biologia molecolare |
| Blu di bromofenolo | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromofenolo sale di sodio blu |
| Cloroformio | Fisher Scientific | C298-400 | Cloroformio |
| Acido formico | Honeywell | 56302 | Additivo eluent per LC-MS |
| Spettrometro di massa Fusion Lumos | ThermoFisher Scientific | per l'analisi di miscele proteiche standard | |
| Glicerolo | Millipore Sigma | 356352-1L-M | Per la biologia molecolare, > 99% |
| Isopropanolo | Fisher Scientific | A4641 | Grado HPLC |
| Metanolo | Fisher Scientific | A452SK-4 | Grado HPLC |
| Microcentrifuga | Fisher Scientific | 75-400-102 | Fino a 21.000 XG |
| Tubo microcentrifuga (1,5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-130 | Fondo rastremato |
| Tubo microcentrifuga (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | Parte inferiore arrotondata |
| Punte per micropipette (0.1-10 μ L) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Punta universale per pipetta, non sterile |
| Punte per micropipette (1-200 μ L) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Punta universale per pipetta, non sterile |
| Punte per micropipette (200-1000 μ L) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Punta universale per pipetta, non sterile |
| Micropipette | Fisher Scientific | 13-710-903 | Pacchetto Trio a micropipette |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Polvere liofilizzata, >3200 unità/mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 unità complete per scatola |
| Cloruro di sodio | Millipore Sigma | S9888-1KG | Reagente ACS, >99 % |
| Dodecile solfato di sodio | ThermoFisher Scientific | 28312 | Solido in polvere |
| TimsTOF Pro Mass Spectrometer | Bruker | per l'analisi dell'estratto di proteoma epatico | |
| Acido trifluoroacetico | ThermoFisher Scientific | L06374. AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Grado in biologia molecolare |
| Tripsina | Millipore Sigma | 9002-07-7 | Dal pancreas bovino, trattato con TPCK |
| Urea | Bio-Rad | 1610731 | solido |
| Acqua (deionizzata) | Sistema di Purificazione Mini dell'Acqua Sartorius Arium | 76307-662 | Tipo 1 ultrapuro (18,2 MΩ cm) |
| Solfato di zinco | Millipore Sigma | 307491-100G | solido |
Riferimenti
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E.
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Ristampe e permessi
