Articolo metodologico

Generazione e caratterizzazione dell'infarto miocardico ventricolare destro indotto dalla legatura permanente dell'arteria coronaria destra nei topi

DOI:

10.3791/63508

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1 febbraio 2022

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1The First Clinical College of Dalian Medical University, 2Department of Cardiology, State Key Laboratory of Organ Failure Research, Nanfang Hospital, Southern Medical University, 3College of Pharmacy, Dalian Medical University

In questo articolo

Sommario

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Ci sono diverse differenze tra i ventricoli destro e sinistro. Tuttavia, la fisiopatologia dell'infarto ventricolare destro (RVI) non è stata chiarita. Nel presente protocollo viene introdotto un metodo riproducibile per la generazione di modelli murini RVI, che può fornire un mezzo per spiegare il meccanismo di RVI.

Abstract

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L'infarto ventricolare destro (RVI) è una presentazione comune nella pratica clinica. La RVI grave può portare a disfunzione emodinamica fatale e aritmia. In contrasto con il modello di infarto miocardico di topo (MI) ampiamente utilizzato generato dalla legatura dell'arteria coronaria sinistra, il modello murino RVI è raramente impiegato a causa della difficoltà associata alla generazione del modello. La ricerca sui meccanismi e il trattamento del rimodellamento e della disfunzione del camper indotto da RVI richiede modelli animali per imitare la fisiopatologia della RVI nei pazienti. Questo studio introduce una procedura fattibile per la generazione di modelli RVI in topi C57BL/ 6J. Inoltre, questo modello è stato caratterizzato sulla base di quanto segue: valutazione delle dimensioni dell'infarto a 24 ore dopo l'infarto, valutazione del rimodellamento cardiaco e della funzione con ecocardiografia, valutazione dell'emodinamica del camper e istologia della zona dell'infarto a 4 settimane dopo RVI. Inoltre, è stato eseguito un calco vascolare coronarico per osservare la disposizione arteriosa coronaria in RV. Questo modello murino di RVI faciliterebbe la ricerca sui meccanismi dell'insufficienza cardiaca destra e cercherebbe nuovi bersagli terapeutici del rimodellamento del camper.

Introduzione

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Il ventricolo destro (RV), a lungo pensato per essere un semplice tubo collegato all'arteria polmonare, è stato erroneamente trascurato per molti anni1. Tuttavia, recentemente c'è stato un crescente interesse per la funzione RV poiché svolge un ruolo essenziale nei disturbi emodinamici 2,3 e può servire come predittore di rischio indipendente di malattie cardiovascolari 4,5,6,7. Le malattie RV includono infarto RV (RVI), ipertensione arteriosa polmonare e malattia valvolare8. In contrasto con l'immenso interesse per l'ipertensione dell'arteria polmonare, RVI è rimasto trascurato 7,9.

La RVI, di solito accompagnata da infarto miocardico inferiore-posteriore10,11, è causata dall'occlusione dell'arteria coronaria destra (RCA). Secondo le indagini cliniche, la RVI grave probabilmente induce disturbi emodinamici e aritmie, come ipotensione, bradicardia e blocco atrioventricolare, associati a una maggiore morbilità e mortalità ospedaliera 12,13,14. La funzione RV potrebbe recuperare spontaneamente in una certa misura anche in assenza di riperfusione15,16. Esistono diverse differenze morfologiche e funzionali tra il ventricolo sinistro (LV) e RV17. Si ritiene che il camper sia più resistente all'ischemia rispetto al LV8, in parte a causa della più ampia formazione di circolazione collaterale dopo RVI. Chiarire le differenze tra infarto LV (LVI) e RVI e identificare i meccanismi sottostanti fornirebbe nuovi bersagli terapeutici per la rigenerazione cardiaca e l'insufficienza cardiaca ischemica. Tuttavia, a causa della difficoltà associata alla generazione di modelli murini RVI, la ricerca di base su RVI è principalmente limitata.

Un grande modello animale di RVI è stato generato legando RCA in suini18, che è più facile da usare a causa del RCA visibile. Rispetto al modello animale di grandi dimensioni, il modello murino presenta i seguenti vantaggi: maggiore accessibilità nella manipolazione genica, costi economici inferiori e periodo sperimentale più breve19,20. Sebbene in precedenza fosse stato riportato un modello RVI murino incentrato sull'influenza di RVI sulla funzione LV, le fasi dettagliate della procedura, le difficoltà e i punti chiave di funzionamento e le caratteristiche del modello come i cambiamenti emodinamici non sono stati completamente introdotti 9,21.

Questo articolo fornisce procedure chirurgiche dettagliate per la generazione di un modello murino di RVI. Inoltre, questo modello è stato caratterizzato da misurazione ecocardiografica, valutazione emodinamica invasiva e analisi istologica. Inoltre, è stato eseguito un calco vascolare coronarico per osservare la disposizione arteriosa coronarica in RV. La tecnica introdotta in questo documento aiuterebbe i principianti a cogliere rapidamente la generazione del modello RVI del topo con mortalità operativa accettabile e approcci di valutazione affidabili. Il modello murino di RVI aiuterebbe a ricercare i meccanismi dell'insufficienza cardiaca destra e a cercare nuovi bersagli terapeutici del rimodellamento del camper.

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state eseguite secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health degli Stati Uniti (pubblicazione NIH n. 85-23, rivista nel 1996) e sono state approvate dal Comitato etico animale dell'ospedale Nanfang, Southern Medical University (Guangzhou, Cina). Topi maschi sani C57BL / 6J (8-10 settimane; peso corporeo, 25-30 g) sono stati ottenuti dall'Animal Center della Southern Medical University. Possono essere utilizzati anche topi femmina, ma non è consigliabile mescolare entrambi i sessi a causa delle potenziali influenze delle differenze sessuali. Dopo l'arrivo, i topi sono stati alloggiati sotto un ciclo buio / luce di 12 ore / 12 ore (3-4 topi per gabbia), con cibo e acqua ad libitum.

1. Preparazione per la chirurgia

  1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante autoclave prima dell'intervento. Regolare la piastra riscaldante a 37 °C.
  2. Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital (vedi Tabella dei materiali) per alleviare il dolore chirurgico. Posizionare i topi in scatole separate per l'induzione dell'anestesia. Garantire la profondità dell'anestesia dall'assenza di una risposta di astinenza da punta.
    NOTA: Si consiglia inoltre di utilizzare l'1,5% di isoflurano per l'anestesia per inalazione perché è meglio per l'analgesia.
  3. Posiziona i topi supini sul pad fissando i loro incisivi con una sutura e immobilizzando i loro arti con nastro adesivo. Garantire nuovamente la profondità dell'anestesia controllando il riflesso.
  4. Rimuovere i peli dal collo allo xifoide con una crema depilatoria. Disinfettare l'area chirurgica 3 volte con scrub antisettico alternato e alcool al 75% e quindi drappeggiare il campo chirurgico.
  5. Eseguire l'intubazione seguendo i passaggi seguenti.
    1. Regolare la frequenza respiratoria dell'animale con un mini ventilatore (vedi Tabella dei materiali) a 150/min e il volume di marea a 300 μL.
      NOTA: non è necessario utilizzare la modalità di pressione positiva di fine espirazione.
    2. Estrarre leggermente la lingua con una pinzetta, sollevare la mandibola con un depressore della lingua per esporre la glottide ed eseguire l'intubazione intra-tracheale inserendo una cannula da 22 G nella glottide.
    3. Accendere il mini ventilatore e collegare la cannula tracheale al ventilatore. Il fenomeno dell'ondulazione toracica che diventa uguale alla frequenza del ventilatore indica un successo dell'intubazione. Fissare la cannula con del nastro adesivo per evitare che scivoli durante l'operazione.

2. Legatura permanente dell'arteria coronaria destra

  1. Collegare correttamente gli elettrodi per elettrocardiografia (ECG) (vedere Tabella dei materiali) agli arti del topo e registrare l'ECG.
    NOTA: uno dei lead II, III o AVF viene selezionato come lead di monitoraggio; Lead III è più appropriato.
  2. Apri il petto.
    1. Fai un'incisione lunga 1 cm nella pelle parallela alla terza costola destra con forbici oftalmiche. Determinare nuovamente il terzo intercostale e garantire uno spazio adeguato in base all'angolo dello sterno.
      NOTA: La direzione dell'incisione cutanea è fatta dall'angolo dello sterno alla linea ascellare anteriore destra.
    2. Separare e tagliare i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori con forbici e micro pinze sopra il terzo spazio intercostale. Successivamente, separare senza mezzi termini il muscolo intercostale con una pinza del gomito per esporre il campo chirurgico.
      NOTA: Solo una piccola parte dei muscoli pettorali deve essere tagliata, e quindi si consiglia una separazione smussata per esporre il cuore.
    3. Incidere il pericardio. Sollevare l'atrio destro con cotone sterile e legare l'RCA con uno sterile 8-0 filo di nylon con un intervallo di legatura di 3-5 mm. Dopo aver legato l'RCA, l'ECG di monitoraggio (piombo III) mostra l'elevazione del segmento ST.
      NOTA: poiché l'RCA del mouse è invisibile, la sua posizione anatomica deve essere attentamente confermata. Il miocardio del camper è molto più sottile di quello del LV. Pertanto, è difficile afferrare la profondità dell'ago inserito. È facile indurre bradicardia sinusale e blocco atrioventricolare se la profondità dell'ago inserito è troppo profonda e l'intervallo di legatura è troppo ampio.
  3. Rimuovere il cotone sterile e suturare i muscoli e la pelle con un filo di nylon sterile 5-0 per chiudere l'incisione intercostale. Disinfettare nuovamente la pelle con alcol al 75% e utilizzare il topo dopo l'intervento chirurgico.
    NOTA: Il muscolo ben suturato è importante per evitare l'aerotorace. Un tubo di drenaggio sterile viene posizionato nella cavità toracica fino al completamento della chiusura del torace, quindi la cavità toracica viene evacuata da una siringa per iniezione che collega il tubo di drenaggio.
    NOTA: Dopo l'intervento chirurgico, i topi vengono posizionati su una piastra riscaldante. Analgesici come la buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo, iniezione sottocutanea) sono necessari per ridurre il dolore degli animali dopo l'intervento chirurgico. Le complicanze attese sono bradicardia sinusale e blocco atrioventricolare e il tasso di mortalità post-operatorio è del 10-20%.

3. Valutazione ecocardiografica della funzione RV dopo l'intervento chirurgico

NOTA: per l'ecocardiografia, utilizzare una sonda MS400D con una frequenza centrale di 30 MHz, collegata a un sistema di imaging ad ultrasuoni ad alta risoluzione (vedere Tabella dei materiali). L'esame ecocardiografico viene eseguito 4 settimane dopo l'intervento chirurgico.

  1. Anestetizzare il mouse con il 3% di isoflurano per inalazione.
  2. Posizionare il mouse in posizione supina su una piattaforma ad ultrasuoni per la fissazione degli animali e il funzionamento ad ultrasuoni. Fissare i suoi artigli all'elettrodo per ottenere una registrazione ECG attraverso un sistema collegato alla macchina ad ultrasuoni.
  3. Monitorare la frequenza cardiaca attraverso l'ECG e mantenerla tra 450-550 battiti / min regolando la concentrazione di anestetico tra l'1,5% e il 3%.
  4. Rimuovere i capelli dal petto del topo con una crema depilatoria e applicare il gel ad ultrasuoni sulla pelle del torace.
  5. Impostare la piattaforma in posizione orizzontale. Orientare il trasduttore parallelamente alla gamba sinistra e ottenere l'immagine dell'asse lungo ventricolare sinistro. Ruotare la sonda di 90° in senso orario per ottenere la vista LV a breve asse. Premere il pulsante Cine store per salvare le immagini.
    NOTA: l'angolo superiore sinistro della piattaforma è inclinato nel punto più basso. L'angolo di rotazione LV a breve asse del trasduttore viene mantenuto mentre il trasduttore è orientato verso la spalla destra del mouse.
  6. Spostarsi verso il basso verticalmente del trasduttore, mantenendo la sua posizione sopra l'addome superiore e sotto il diaframma del mouse in modalità B. Regola leggermente la posizione della piattaforma ruotando gli assi x e y fino a quando il camper, l'atrio destro (RA), l'atrio sinistro (LA) e il LV sono chiaramente visibili sullo schermo. Salva le immagini apicali a quattro camere premendo il pulsante Cine store o Frame store .
    NOTA: la modalità B viene utilizzata per visualizzare la vista bidimensionale (2D) del cuore.
  7. Premere la modalità M; dopo aver visualizzato la linea dell'indicatore 2x, individuare la linea dell'indicatore sull'orifizio della valvola tricuspide per ottenere il movimento del piano anulare tricuspide. Premere il pulsante Cine store o Frame store per salvare dati e immagini.
    NOTA: modalità M indica la modalità di movimento, che rivela il movimento del cuore o del vaso in forma curva.
  8. Premere il pulsante Misura per accedere alla modalità di misurazione. Fare clic sul pulsante Misurazione area per zonare in RV e LV. Calcolare l'area di RV e LV per ottenere il rapporto di area tra RV e LV.
    1. Fare clic sul pulsante Timeline e creare due linee di base per definire l'intervallo di movimento del piano anulare tricuspide durante i periodi sistolico e diastolico. Fare clic sul pulsante Distanza e misurare la distanza tra due linee di base per ottenere un'escursione sistolica del piano anulare tricuspide (TAPSE).
  9. Inclina il lato sinistro della piattaforma nel punto più basso. Mantenere la sonda con un angolo di 30° rispetto all'asse orizzontale lungo la linea ascellare anteriore destra. Ruotare gli assi x e y della piattaforma per visualizzare il camper.
    1. Premere il pulsante M-mode e individuare la linea dell'indicatore nel punto iperecoico del setto per ottenere l'immagine in modalità M dell'interfaccia RV. Premere il pulsante Cine Store per salvare l'immagine.
  10. Aprire l'immagine in modalità M dell'interfaccia RV, premere il pulsante Misura per accedere alla modalità di misurazione. Misurare la distanza interna del camper alla fine della diastole (RVIDd), della frazione di eiezione RV (RVEF) e dell'accorciamento della frazione RV (RVFS) utilizzando lo strumento di misurazione integrato del sistema ecocardiografico.
  11. Smettere di somministrare isoflurano e posizionare il mouse sulla piastra riscaldante per 3-5 minuti fino a quando non riprende conoscenza. Successivamente, riportare il mouse nella sua gabbia con un ciclo di luce / buio di 12 ore.

4. Misure invasive di RV emodinamica

NOTA: L'emodinamica RV viene valutata attraverso il cateterismo cardiaco destro 4 settimane dopo RVI. Viene applicato un catetere da 1,0 F insieme a un sistema di monitoraggio.

  1. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital di sodio (vedere Tabella dei materiali).
  2. Dopo aver confermato la scomparsa del riflesso di astinenza del pedale, tenere il mouse in posizione supina e immobilizzarlo con del nastro adesivo.
  3. Radere i peli del torace dall'angolo sternale allo xifoide. Disinfettare l'area operativa con alcool al 75%.
  4. Eseguire l'intubazione tracheale e impostare il parametro del ventilatore animale come descritto nei passaggi 1.5.2-1.5.3.
  5. Fai un'incisione bilaterale di 1 cm sulla pelle sopra il processo xifoide e trascorri il diaframma e la costola con forbici oftalmiche per esporre il cuore.
  6. Forare la parete libera ventricolare destra con un ago da 32 G. Rimuovere l'ago e premere la ferita con il cotone per fermare il sanguinamento.
  7. Inserire la punta del catetere nel ventricolo destro attraverso il sito di puntura e spingere lentamente il catetere in avanti. Regolare la posizione della punta per ottenere una tipica forma d'onda di pressione RV mostrata su un monitor e un sistema di registrazione.
    NOTA: La vena giugulare destra è anche una via appropriata per la misurazione emodinamica.
  8. Dopo 10 minuti di stabilizzazione, registrare i dati della pressione arteriosa sistolica RV (RVSBP), della pressione diastolica finale RV (RVEDP) e RV dP / dt. Fare clic sul pulsante Seleziona per selezionare i cicli cardiaci per il calcolo e quindi fare clic sul pulsante Analizza per calcolare i valori medi dei cicli selezionati.
  9. Rimuovere il catetere dopo il completamento della registrazione e quindi posizionarlo all'interno della normale soluzione salina.
  10. Eutanasizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di sovradosaggio di pentobarbital sodico (150 mg/kg) e poi sacrificarlo per lussazione cervicale.
  11. Raccogliere il cuore e la tibia per l'analisi istologica.

5. Cast vascolare coronarico utilizzando un agente di colata vascolare

  1. Eparinoilizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 200 UI/mL di eparina sodica a 2000 UI/kg (vedere Tabella dei materiali).
  2. Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital di sodio.
  3. Posizionare l'animale supino sul tampone e intubare per la ventilazione artificiale seguendo i passaggi 1.5.2-1.5.3.
  4. Aprire il torace con le forbici chirurgiche come descritto nel passaggio 4.5 ed esporre il cuore.
  5. Fai una tacca di 3 mm con forbici oftalmiche sugli atri destro e perfondi il cuore con 5 ml di soluzione salina normale attraverso l'apice cardiaco con un iniettore.
  6. Bloccare il sangue dall'aorta con un morsetto aortico e perfondere 0,1 ml di nitroglicerina (1 mg / mL) attraverso l'apice cardiaco con un iniettore per dilatare l'arteria coronaria.
  7. Preparare il reagente fuso mescolando gli ingredienti nel kit secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    NOTA: Si raccomanda di preparare contemporaneamente il reagente fuso e la perfusione con soluzione salina e nitroglicerina normali per prevenire la chiusura microvascolare.
  8. Perfondere il cuore con 1 mL di reagente fuso attraverso l'apice cardiaco e attendere 2-3 ore.
  9. Erodere il cuore con idrossido di sodio al 50% per 2-3 giorni e rimuovere il tessuto muscolare o il tessuto connettivo risciacquando con soluzione salina normale.
  10. Scatta foto sotto una fotocamera.
    ATTENZIONE: Il reagente cast è dannoso per gli occhi, la pelle e le vie respiratorie. L'idrossido di sodio è corrosivo. È necessario indossare guanti protettivi, occhiali e un cappotto da laboratorio. Il reagente fuso deve essere preparato in una cappa aspirante.

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Risultati

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In questo studio, i topi sono stati assegnati in modo casuale al gruppo RVI (n = 11) o all'operazione fittizia (n = 11). Il cast coronarico in 2 cuori di topo normali è mostrato nella Figura 1A. In risposta alla legatura RCA, l'elevazione del segmento ST è stata osservata nel piombo III dell'ECG (Figura 1B). Inoltre, la colorazione del cloruro di tetrazolio 2,3,5-trifenil tetrazolio (TTC) ha mostrato che l'area dell'infarto rappresenta il 45% della parete libera...

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Discussione

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Sicard e colleghi francesi hanno riportato per la prima volta un modello murino di RVI nel 2019, che descriveva il processo chirurgico e si concentrava sull'interazione tra LV e RV dopo RVI9. Tuttavia, ad oggi, nessuno studio ha riportato l'utilizzo di questo modello per ulteriori studi. Una procedura più dettagliata sarebbe utile per i ricercatori per utilizzare il modello murino di RVI per l'indagine. In contrasto con il rapporto di Sicard et al.9, abbiamo fornito informa...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82073851 to Sun) e della National China Postdoctoral Science Foundation (2021M690074 a Lin).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolioSigmaT8877per colorazione TTC
Mini ventilatore per animaliHavardtipo 845per ventilazione artificiale
Sistema ad ultrasuoni per animali VEVO2100del VEVO2100sonico per la velocità del flusso Doppler e la placca AS
Batson' s #17 Kit anatomico per la corrosionePolyscience Inc7349Per la colata vascolare
di buprenorfinaIsoreag1134630-70-8Per ridurre il dolore dei topi dopo l'intervento chirurgico
Topi C57BL / 6J + D29A1A2: D27Animal Center of South MedicalUniversity-Perla generazione di modelli RVI di topi
FotocameraSangnondper scattare fotografie
Luce fredda illuminatoreOlympusILD-2Luce per il funzionamento
elettrocardiografoADI StrumentoPer la registrazione dell'elettrocardiogramma
depilatoriaReckitt BenchiserRQ/B 33 Tipo 2Rimozione dei peli del mouse
Termoforo - sistema chirurgico termostatico (ALC-HTP-S1)SHANGHAI ALCOTT BIOTECH COALC-HTP-S1Riscaldamento
Ematossilina-eosina coloranteLeageneDH0003Colorazione con ematossilina-eosina
Eparina sale sodicoMacklinPer l'eparizzazione
IsofluranoRWD scienze della vitaR510-22Anestesia inalante
SpatolaFunziona come laringoscopio
CannulaPer l'intubazione
Matrx VIP 3000 Vaporizzatore di isofuranoMidmark CorporationVIP 3000Anesthetization
Medical nylon suture (5-0)Ningbo Medical Needle Co.5-0Per la chiusura del torace
Pinzette microchirurgiche a gomitoRWD scienze della vitaF11021-11Per
chirurgia Forbici microchirurgicheNAPOXMB-54-1Per arteriotomia
Catetere MillarAD Instruments, Shanghai1.0FMisurazione del gradiente di pressione
MS400D Sonda ultrasonicaVisual SonicMS400DMisurazione per il flusso Doppler velocità e pinze per aghi per placca AS
Visual SonicF31006-12per chirurgia
nitroglicerinaBEIJING YIMIN MEDICINE Coper dilatazione dell'arteria coronarica
Forbici oftalmicheRWD scienze della vitaS11022-14Per chirurgia
Pentobarbital sale sodicoMerck25MGAnestesia
PowerLab multidirezionale Sistema di registrazione fisiologicaStrumenti AD, Shanghai4/35Registrazione della pressione
Bilancia elettronica di precisioneDenver InstrumentTB-114Bilancia
Sutura di seta (8-0)Ningbo Medical Needle Co.Legatura dell'arteria coronarica6-0
microchirurgia di piccoli animaliNapoxMA-65Strumenti chirurgici
Pinze per tessutiVisual SonicF-12007-10Per la chirurgia
forbice tissutaleVisual SonicS13052-12Torace aperto per la misurazione emodinamica
Gel di trasmissioneGuang Gong pai250MLpreparazione per Misurazione ecocardiografica
Pinze vascolariVisual SonicR31005-06Per bloccare il sangue dall'aorta
Misurazione visiva ADAS1000 crema H837056 fatta in laboratorio tracheale fatta in laboratorio Attrezzatura per

Riferimenti

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