Articolo metodologico

Standardizzazione e mantenimento di colture organoidi epatiche e intestinali canine 3D per l'uso nella ricerca biomedica

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DOI:

10.3791/63515

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31 gennaio 2022

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1Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 33D Health Solutions Inc., 4Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Vengono descritti metodi sperimentali per raccogliere cellule staminali adulte da tessuti intestinali ed epatici canini per stabilire colture organoidi 3D. Inoltre, vengono discusse le tecniche di laboratorio per garantire una crescita costante e fornire procedure operative standard per raccogliere, biobancare e far rivivere colture organoidi intestinali ed epatiche canine.

Abstract

I cani sviluppano malattie multifattoriali complesse analoghe agli esseri umani, tra cui malattie infiammatorie, malattie metaboliche e cancro. Pertanto, rappresentano modelli animali di grandi dimensioni rilevanti con il potenziale traslazionale della medicina umana. Gli organoidi sono strutture 3-dimensionali (3D), auto-assemblate derivate da cellule staminali che imitano la microanatomia e la fisiologia del loro organo di origine. Questi modelli traslazionali in vitro possono essere utilizzati per applicazioni di permeabilità e scoperta di farmaci, valutazione tossicologica e per fornire una comprensione meccanicistica della fisiopatologia delle malattie croniche multifattoriali. Inoltre, gli organoidi canini possono migliorare la vita dei cani da compagnia, fornendo input in varie aree della ricerca veterinaria e facilitando applicazioni di trattamento personalizzate in medicina veterinaria. Un piccolo gruppo di donatori può creare una biobanca di campioni di organoidi, riducendo la necessità di una raccolta continua di tessuti, poiché le linee cellulari organoidi possono essere sottocolturate a tempo indeterminato. Qui vengono presentati tre protocolli che si concentrano sulla coltura di organoidi canini intestinali ed epatici derivati da cellule staminali adulte. Il Canine Organoid Isolation Protocol delinea i metodi per elaborare il tessuto e l'incorporamento dell'isolato cellulare in una matrice di supporto (matrice di membrana extracellulare solubilizzata). Il canino Organoid Maintenance Protocol descrive la crescita e la manutenzione degli organoidi, compresa la pulizia e il passaggio insieme ai tempi appropriati per l'espansione. L'Organoid Harvesting and Biobanking Protocol descrive i modi per estrarre, congelare e conservare gli organoidi per ulteriori analisi.

Introduzione

I roditori sono il modello animale più comunemente utilizzato per la ricerca biomedica e traslazionale1. Sono eccezionalmente utili per studiare la patogenesi molecolare di base delle malattie, sebbene la loro rilevanza clinica per le malattie croniche multifattoriali sia stata recentemente messa in discussione2. Il modello canino presenta diversi vantaggi rispetto ai roditori3,4. Cani e umani condividono somiglianze nella metabolomica e nel microbioma intestinale che si sono sviluppati a causa del consumo di dieta umana durante vari periodi della loro domesticazione5,6,7. Le somiglianze tra anatomia e fisiologia gastrointestinale canina e umana sono un altro degli esempi8.

Inoltre, i cani spesso condividono ambienti e stili di vita simili con i loro proprietari9. La maggiore durata della vita dei cani rispetto ai roditori consente lo sviluppo naturale di numerose condizioni croniche10. La malattia infiammatoria intestinale o la sindrome metabolica sono esempi di malattie croniche multifattoriali che condividono importanti somiglianze tra esseri umani e cani11,12. Gli studi preclinici canini che coinvolgono cani con malattie naturali possono generare dati più affidabili di quelli ottenuti dai modelli di roditori13. Tuttavia, per ridurre al minimo l'uso della ricerca sugli animali vivi e rispettare i principi delle 3R (Ridurre, Raffinare, Sostituire)14, sono emerse alternative ai test in vivo che utilizzano organoidi canini 3D in vitro15.

Gli organoidi sono strutture derivate da cellule staminali 3D autoassemblate che ricapitolano la fisiologia e la microanatomia dei loro organi originali16,17. Questa tecnologia è stata descritta per la prima volta da Sato et al. nel 200917 e ha permesso studi in vitro più traducibili in linee cellulari epiteliali di quanto fosse possibile in precedenza utilizzando colture di cellule tumorali 2D18,19,20. Gli organoidi sono modelli utili in vitro in molte discipline biomediche come negli studi tossicologici preclinici21,22,23, di assorbimento o sul metabolismo24,25,26,27,28, nonché in approcci medici personalizzati29,30,31 . La coltura di successo di organoidi intestinali canini è stata descritta per la prima volta nel 201912, mentre gli organoidi epatici derivati da un cane sono stati segnalati per la prima volta da Nantasanti et al. nel 201532. Da allora gli organoidi canini sono stati utilizzati con successo in studi che studiano enteropatie croniche canine, tumori stromali gastrointestinali, adenocarcinoma colorettale12 e malattia di Wilson33,34.

Mentre le cellule staminali adulte possono essere raccolte tramite necropsie, la tecnologia organoide non richiede sempre il sacrificio degli animali. Le biopsie endoscopiche e laparoscopiche, o anche gli aspirati con ago sottile degli organi35, sono una valida fonte di cellule staminali adulte per l'isolamento degli organoidi epiteliali12. L'uso diffuso di tali tecniche non invasive nella pratica veterinaria facilita le opzioni per la ricerca traslazionale inversa (traduzione di informazioni dalla pratica clinica veterinaria alla pratica clinica umana e viceversa)15. Un ulteriore progresso della tecnologia degli organoidi può essere garantito dalla standardizzazione dei metodi di coltura e manutenzione degli organoidi. Il protocollo organoide qui presentato è parzialmente basato sul lavoro precedentemente pubblicato di Saxena et al. dal 201536 e i metodi sono stati adattati per adattarsi alle specifiche della coltura organoide intestinale ed epatica canina. Il flusso di lavoro complessivo dei protocolli organoidi canini è illustrato nella Figura 1.

Il protocollo di isolamento degli organoidi canini introduce metodi per ottenere campioni da biopsie endoscopiche, laparoscopiche e chirurgiche, nonché necropsie. Delinea il pretrattamento iniziale dei campioni di tessuto e le metodologie utilizzate per il trasporto in laboratorio. I materiali e i reagenti necessari per l'isolamento organoide sono riassunti nella sezione "Preparazione per l'isolamento". Il processo di isolamento delle cellule staminali adulte dai campioni di tessuto è ulteriormente descritto in dettaglio. Infine, viene discusso il processo di placcatura degli organoidi in strutture a cupola utilizzando una matrice di membrana extracellulare solubilizzata.

Il secondo protocollo, Canine Organoid Maintenance Protocol, descrive i metodi di documentazione e coltura degli organoidi. I cambiamenti dei media e la loro frequenza sono discussi in questa sezione. Inoltre, vengono descritte le procedure di laboratorio come il passaggio e la pulizia delle colture cellulari, essenziali per garantire il corretto mantenimento degli organoidi canini 3D. Il passaggio appropriato è un passaggio critico del protocollo e le possibili regolazioni e la risoluzione dei problemi di questo passaggio sono discussi ulteriormente nel manoscritto.

L'ultimo protocollo è Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol contenente metodi per la preparazione di organoidi adulti per l'incorporamento di paraffina e la conservazione dell'RNA. Qui vengono descritti anche i metodi di biobanking dei campioni organoidi nello stoccaggio dell'azoto liquido. Infine, vengono discussi i modi per scongelare i campioni congelati e sostenere la loro crescita.

In conclusione, questo articolo mira a fornire procedure coerenti di coltura di organoidi canini attraverso la standardizzazione di protocolli inter-laboratorio. In tal modo, il manoscritto mira a facilitare la riproducibilità dei dati derivati da modelli organoidi canini per aumentare la loro rilevanza nella ricerca biomedica traslazionale.

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Figura 1: Flusso di lavoro dei protocolli organoidi canini. Il Canine Organoid Isolation Protocol descrive la preparazione dei materiali necessari per l'isolamento organoide, la raccolta di un campione di tessuto (attraverso necropsie, biopsie endoscopiche, laparoscopiche e chirurgiche) e le linee guida sulla dissociazione cellulare e la placcatura della popolazione cellulare. Il Canine Organoid Maintenance Protocol discute la pulizia e il passaggio della coltura organoide. L'Organoid Harvesting and Biobanking Protocol discute la preparazione di campioni organoidi per l'incorporamento di paraffina e un'ulteriore caratterizzazione degli organoidi. Vengono inoltre discussi i metodi per biobancare le colture organoidi e farle rivivere dallo stoccaggio in azoto liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

La ricerca è stata approvata ed eseguita in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee della Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).

NOTA: nella sezione seguente (passaggi 1-3) viene descritto il protocollo di isolamento degli organoidi canini.

1. Preparazione all'isolamento

  1. Tubi di trasporto: prima dell'isolamento organoide (in genere 24 ore prima), riempire un tubo conico da 50 ml con 10 mL di Miscela Media/Nutriente Eagle Modificata F-12 (Advanced DMEM/F12) di Dulbecco arricchita con 0,2 mL di Pen Strep.
  2. Per biopsie laparoscopiche, incisionali o escissionali, preparare tre ulteriori tubi conici da 50 ml. Riempire questi tubi con 10 mL di soluzione chelante completa (1x CCS; vedere Tabella 1).
    NOTA: Per la fase 1.2, 2 mM N-acetilcisteina (NAC) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) possono anche essere utilizzati come soluzione tradizionale utilizzata per la raccolta di cellule staminali. Non sono state osservate differenze durante l'utilizzo di 1x CCS o NAC in PBS. Entrambe le soluzioni vengono aggiunte per rilasciare celle nella soluzione.
  3. Mantenere i tubi a 4 °C durante la notte e trasportare i tubi sul ghiaccio per il resto del protocollo.
  4. Preparare cinque tubi centrifuga da 15 mL con 5 mL di 1x CCS, un tubo centrifugo da 15 mL con 3 mL di 1x CCS, un tubo centrifugo vuoto da 15 mL (tubo surnatante) e un tubo centrifugo da 15 mL con 5 mL di 1x CCS e 2 mL di siero bovino fetale (FBS).
    NOTA: quanto sopra può essere preparato prima del giorno di isolamento se verranno elaborati più campioni. Per un'illustrazione, vedere il layout del tubo di isolamento nella Figura 2.
  5. Il giorno dell'isolamento, prepara una capsula di Petri, un bisturi, un secchiello per il ghiaccio e un DMEM / F12 avanzato freddo nell'armadio di biosicurezza. Posizionare il numero richiesto di piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti nell'incubatore (37 °C; 5% di CO2 atmosfera) per preriscaldarsi.
  6. Posizionare la matrice di membrana extracellulare solubilizzata (ECM; vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio per iniziare lo scongelamento.
    NOTA: L'immersione nel ghiaccio protegge dal rapido scongelamento e aiuta a evitare la solidificazione. Una scatola di punte per pipette può essere posizionata nel congelatore per aiutare a placcare l'ECM solubilizzato.
  7. Prechill una centrifuga a 4 °C.
  8. Spostare i supporti completi con fattori di crescita "CMGF+" o "organoidi" (vedere tabella 1 per la composizione) dal congelatore/frigorifero a un bagno d'acqua a 37 °C. Evitare l'esposizione diretta alla luce quando possibile.

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Figura 2: Layout del tubo di isolamento. La configurazione consigliata per la raccolta dei tessuti include 10 mL di Advanced DMEM/F12 e 0,2 mL di Pen Strep in un tubo centrifugo da 50 mL. Inoltre, tre tubi da 50 mL riempiti con 10 mL di 1x CCS sono necessari per biopsie chirurgiche o necropsie. Il layout del tubo consigliato per le fasi di isolamento include cinque tubi contenenti 5 mL di 1x CCS da utilizzare durante le fasi di lavaggio CCS. Il primo tubo viene utilizzato come provetta contenente il tessuto tritato e i tubi rimanenti fungono da serbatoi di 1x CCS da aggiungere al primo tubo. Il sesto tubo contiene 3 mL di 1x CCS per lavare il tessuto rimanente dalla provetta del campione durante il trasferimento su una piastra a 6 pozzetti. Questi sei tubi saranno utilizzati prima della fase di incubazione EDTA. Un tubo con 5 mL di 1x CCS e 2 mL di FBS funge da provetta campione dopo l'incubazione di EDTA, e il surnatante da questo tubo viene trasferito con cellule staminali in un tubo vuoto per il resto dell'isolamento. Tenere i tubi a 4 °C prima di iniziare l'isolamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Raccolta dei tessuti

  1. Le biopsie endoscopiche e laparoscopiche intestinali (diametro 2,8 mm) possono essere acquisite utilizzando una grande pinza per biopsia. Raccogliere almeno otto campioni endoscopici per sito intestinale.
  2. Raccogliere i campioni direttamente in tubi di trasporto e metterli sul ghiaccio.
  3. Per le biopsie chirurgiche e le necropsie, raccogliere pezzi di tessuto con una dimensione di 0,5 cm x 0,5 cm e posizionarli nel primo tubo CCS 1x.
    NOTA: Per le biopsie intestinali, rimuovere qualsiasi contenuto intestinale rimanente e raschiare lo strato mucoso con un bisturi per rimuovere i villi. Se i campioni sono abbondanti, ulteriori biopsie possono essere raccolte in crioviali contenenti reagente di stoccaggio di RNA (1 mL) o paraffina incorporata per un futuro confronto tra organoidi e il loro tessuto di origine. In caso di assunzione di biopsie per l'analisi TEM, non raschiare i villi e conservare il campione in conservante (3% paraformaldeide e glutaraldeide al 3% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)) e conservare a 4 °C.
  4. Agitare vigorosamente il tubo CCS 1x per ~ 30 s, quindi trasferire il campione su un nuovo tubo CCS 1x usando una pinza. Ripeti questo processo due volte.
  5. Trasferire il campione dall'ultimo tubo CCS 1x al tubo di trasporto (Advanced DMEM/F12 + Pen Strep) e riportare il campione in laboratorio.
    NOTA: i campioni pretrattati in questo modo possono anche essere spediti durante la notte sul ghiaccio (non spedire su ghiaccio secco).

3. Isolamento organoide

NOTA: eseguire l'isolamento utilizzando tecniche asettiche in un armadio di biosicurezza. Vedere la Figura 3 per il flusso di lavoro di isolamento degli organoidi canini.

  1. Agitare il campione di tessuto nel tubo di trasporto per ~ 30 s e rimuovere il surnatante in eccesso fino a quando non rimangono 0,5 ml nel tubo mediante pipettaggio lento vicino alla superficie del fluido. Assicurati di non scartare alcun tessuto.
  2. Trasferire il tessuto e il surnatante rimanente in una capsula di Petri sterile. Usando un bisturi monouso (o pinze e forbici sterilizzate), tagliare e tritare il tessuto in pezzi più piccoli (dimensioni di 1 mm2) simili a una consistenza di poltiglia per circa 5 minuti.
  3. Pipettare il tessuto tritato con liquido dalla capsula di Petri al primo tubo CCS. Aggiungere 2 ml di DMEM/F12 avanzato alla capsula di Petri, lavare il tessuto rimanente e trasferirlo al primo tubo CCS.
  4. Vortice il tubo CCS 1x per 5 s circa cinque volte. Lasciare che le biopsie si depositino sul fondo del tubo da 15 ml (circa 1 minuto) e rimuovere il surnatante fino a quando non rimangono 5 mL nel tubo. Trasferire il CCS 1x dalla nuova provetta alla provetta campione.
  5. Ripetere il passaggio precedente per i due tubi successivi. Negli ultimi due lavaggi, rimuovere il surnatante fino a 3 ml rimanenti nel tubo.
  6. Trasferire le biopsie e 1x CCS dalla provetta del campione a un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Quindi, aggiungere 3 ml di 1x CCS alla provetta del campione, ruotare delicatamente per raccogliere il tessuto rimanente e trasferire nello stesso pozzetto della piastra.
  7. Aggiungere 150 μL di 0,5 M EDTA (per ottenere un volume totale di 6,15 ml in un pozzo). Posizionare la piastra a 6 pozzetti su un miscelatore/bilanciere a 20°, 24 giri/min a 4°C. Incubare i campioni di fegato per 10 minuti e i campioni intestinali per 1 ora sul bilanciere in movimento.
  8. Trasportare la piastra a 6 pozzetti nell'armadio di biosicurezza. Trasferire il tessuto e il liquido tritati in un tubo CCS/FBS 1x e consentire ai tessuti di depositarsi. Trasportare il surnatante (questa porzione ora include cellule staminali libere) e circa 0,2 ml della porzione superiore del tessuto al tubo vuoto.
  9. Girare verso il basso la provetta contenente il campione (700 x g per 5 minuti a 4 °C). Le cellule staminali sono ora pellettate insieme al tessuto tritato. Rimuovere ed eliminare il surnatante con attenzione per non disturbare il pellet.
  10. Sospendere il pellet in Advanced DMEM/F12 e ruotare nuovamente il tubo (700 x g per 5 minuti a 4 °C). Aspirare il surnatante e non disturbare il pellet.
  11. Calcolare il volume di ECM solubilizzato necessario per seminare le cellule e i tessuti dissociati. Utilizzare 30 μL di ECM solubilizzato per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti per ottenere una corretta densità di semina.
    NOTA: Incorporare un campione post isolamento in 4-6 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti (cioè in base alla quantità di tessuto tritato nel campione).
  12. Aggiungere il volume calcolato di ECM solubilizzato alla provetta del campione e pipettare lentamente su e giù per evitare la formazione di bolle. Seminare la sospensione nel mezzo dei pozzetti in modo che l'ECM solubilizzato possa formare una struttura a cupola.
    NOTA: l'uso di punte di pipette da un congelatore a -20 °C aiuta a placcare ECM solubilizzato. Se i pezzi di tessuto sono più grandi della punta della pipetta P200, utilizzare punte fredde larghe o punte P1000 fredde tagliate per facilitare la placcatura. Conservare il campione con l'ECM solubilizzato su ghiaccio quando possibile.
  13. Trasportare la piastra in un incubatore (37 °C; 5% di CO2 atmosfera) e consentire all'ECM solubilizzato di solidificarsi per ~ 30 min.
  14. Mescolare l'inibitore ROCK e GSK3β in CMGF+ (concentrazioni nella Tabella 1). Aggiungere 500 μL di questa soluzione (CMGF+ R/G) ad ogni pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C; 5% di CO2 atmosfera).

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Figura 3: Flusso di lavoro di isolamento degli organoidi canini. Il campione di tessuto raccolto viene trasferito in una capsula di Petri e tritato correttamente. Il campione viene quindi trasferito in un tubo CCS 1x e vengono eseguite le fasi di lavaggio. Per l'incubazione edta in una piastra a 6 pozzetti, il campione viene quindi trasferito in una provetta contenente 1x CCS e FBS. Dopo che il tessuto si è depositato, il surnatante con una piccola quantità di tessuto viene trasferito in un tubo vuoto. Di conseguenza, il campione viene filato, il surnatante viene rimosso e il pellet viene risospeso in Advanced DMEM/F12. Il tubo viene nuovamente filato e il surnatante viene aspirato e scartato. L'ECM solubilizzato viene aggiunto al tubo, miscelato, e il campione viene placcato in una piastra a 24 pozzetti. La piastra viene quindi incubata (37 °C; 5% di CO2 atmosfera) per 30 minuti e viene quindi aggiunto il fluido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOTA: nella sezione seguente (passaggi 4 e 5) viene descritto il protocollo di manutenzione degli organoidi canini. Cambiare i mezzi secondo la Tabella 2 e controllare quotidianamente gli organoidi per segni di apoptosi, contaminazione, sovraffollamento e distacco di ECM solubilizzato. Gli appunti giornalieri devono essere presi secondo la Figura 4 per monitorare accuratamente le condizioni e gli effetti sperimentali sulle colture. Vedere la tabella supplementare 1 per un modello che consente di prendere appunti accurati e riproducibili relativi alla coltura di organoidi. Per gli organoidi epatici, utilizzare CMGF+ potenziato con inibitore ROCK e GSK3β.

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Figura 4: Guida al dimensionamento e alla densità degli organoidi. (A) Tabella delle dimensioni degli organoidi per un monitoraggio accurato della crescita degli organoidi. La Guida al dimensionamento include categorie extra-small (XS), small (S), medium (M), large (L) ed extra-large (XL). (B) La Guida alla densità è costituita da categorie a densità molto bassa (VLD), bassa densità (LD), media densità (MD), alta densità (HD) e ad altissima densità (VHD). (C) Immagini rappresentative della contaminazione batterica e fungina del campione organoide. (D) Immagini rappresentative del sovraffollamento organoide e dell'apoptosi. L'ingrandimento oggettivo è indicato in ogni pannello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Raccomandazione per la modifica dei media
LunedìMartedìMercoledìGiovedìVenerdìSabatoDomenica
500 μLN/D500 μLN/D750 μLN/DN/D

Tabella 2: Raccomandazione per la modifica dei media. Una sequenza temporale consigliata per il cambio settimanale dei media. Si raccomanda di cambiare a giorni alterni i mezzi (500 μL di CMGF+ per gli organoidi intestinali o 500 μL di CMGF+ R/G per gli organoidi epatici). Per tenere conto delle ore extra in un fine settimana, 750 μL di media vengono aggiunti il venerdì pomeriggio, con i media che vengono aggiornati il lunedì mattina.

4. Pulizia organoide

NOTA: La pulizia o il passaggio degli organoidi devono essere eseguiti regolarmente per mantenere la salute della coltura organoide. Eseguire la procedura di pulizia ogni volta che si nota apoptosi in coltura, presenza di detriti, sovraffollamento degli organoidi o distacco di ECM solubilizzato. Fare riferimento alla Figura 4D.

  1. Rimuovere il fluido dai pozzetti mentre si inclina la piastra per evitare la distruzione dell'ECM solubilizzato.
    NOTA: Se il distacco di ECM solubilizzato è considerevole, si consiglia di trasferire il fluido al tubo da 15 ml per evitare di perdere frammenti di ECM solubilizzato contenenti il campione.
  2. Aggiungere 0,5 mL di DMEM/F12 avanzato prechilled a ciascun pozzetto per dissolvere le cupole della matrice mediante pipettaggio ripetuto utilizzando una punta P1000 (evitare di creare bolle eccessive). Trasferire la matrice disciolta contenente organoidi in un tubo centrifugo da 15 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio e se il volume è inferiore a 6 mL, riempire lentamente il tubo con Advanced DMEM/F12 per raggiungere un volume totale di 6 mL.
  3. Far girare il tubo (700 x g per 5 min a 4 °C) e rimuovere tutto il surnatante assicurandosi di non disturbare il pellet.
  4. Aggiungere il volume richiesto di ECM solubilizzato (30 μL per pozzetto per ottenere una corretta densità di semina) e risospese lentamente il pellet mediante miscelazione a pipetta. Placcare la sospensione nel mezzo della piastra a 24 pozzetti per formare una cupola.
  5. Posizionare la piastra in un incubatore (37 °C; 5% di CO2 atmosfera) per ~ 30 minuti, quindi aggiungere il volume appropriato di supporto (Tabella 2).

5. Passaggio organoide

NOTA: il passaging viene in genere eseguito 5-7 giorni dopo la coltura iniziale per espandere la linea cellulare organoide. Le colture organoidi possono tipicamente essere espanse in un rapporto 1:3. Immagini di culture sane pronte per il passaggio possono essere viste nella Figura 4. Gli organoidi devono essere di dimensioni almeno medie.

  1. Eseguire i passaggi da 4.1 a 4.3.
  2. Rimuovere il surnatante lasciando 0,5 ml nel tubo. Assicurati di non disturbare il pellet.
  3. Aggiungere 0,5 ml di proteasi simile alla tripsina (vedere Tabella dei materiali), mescolare correttamente aspirando con una pipetta e incubare a bagnomaria a 37 °C (incubare gli organoidi intestinali per 8 minuti o gli organoidi epatici per 10 minuti). Continuare a mescolare la soluzione facendo scorrere il tubo più volte nel punto di metà tempo dell'incubazione.
  4. Spostare la provetta contenente il campione in un armadio di biosicurezza e aggiungere lentamente 6 ml di DMEM avanzato / F12 prechilled per inattivare la proteasi simile alla tripsina e fermare la dissociazione delle cellule.
  5. Ruotare il tubo (700 x g per 5 minuti a 4 °C) e rimuovere il surnatante. Assicurati di non disturbare il pellet.
  6. Eseguire i passaggi 4.4. e 4.5.
    NOTA: la sezione seguente (passaggi 6-9) descrive il protocollo di raccolta e biobanca degli organoidi. Le colture organoidi devono essere prive di tessuto che è stato rimosso durante i passaggi precedenti. Le colture dovrebbero anche essere sane, almeno di grandi dimensioni e di densità medio-alta. Immagini di colture sane pronte per applicazioni a valle possono essere visualizzate nella Figura 4. Spostarsi a valle con la conservazione e la raccolta di colture organoidi sub-ottimali può avere un impatto negativo sui risultati della caratterizzazione e sulla redditività della biobanca. Esaminare il layout della piastra a 24 pozzetti consigliato nella Figura 5.

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Figura 5: Layout della piastra a 24 pozzetti consigliato. Il layout consigliato della piastra a 24 pozzetti per la caratterizzazione di base dopo l'espansione della coltura organoide. L'incorporamento di paraffina di sei pozzetti (organoidi medio-grandi di densità medio-alta) consentirà in genere un'alta concentrazione di organoidi in un blocco istologico. Quattro pozzetti di organoidi possono essere raggruppati in un crioviale con reagente di stoccaggio dell'RNA per applicazioni a valle. Quattordici pozzi sono utilizzati per il biobanking dei campioni organoidi e forniscono materiale per un massimo di sette fiale crioconservate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Fissazione degli organoidi

  1. Rimuovere i supporti dal pozzetto e assicurarsi di non disturbare la cupola ECM solubilizzata.
  2. Aggiungere 500 μL di soluzione di formalina-acido acetico-alcol che funge da fissativo (FAA; composizione nella Tabella 1).
  3. Conservare gli organoidi a temperatura ambiente. Dopo 24 ore, aspirare FAA e riempire il pozzo con etanolo al 70%. Avvolgere le lastre con un nastro flessibile da laboratorio (vedere Tabella dei materiali) per evitare una rapida evaporazione. Gli organoidi sono ora pronti per l'incorporamento di paraffina. L'incorporazione di paraffina della coltura organoide viene eseguita in stampi tradizionali a base metallica.

7. Conservazione dell'RNA

  1. Rimuovere i fluidi dai pozzetti e assicurarsi di non disturbare la cupola ECM solubilizzata.
  2. Utilizzare 0,5 mL di DMEM/F12 avanzato prechilled per pozzetto per sciogliere le cupole ECM solubilizzate pipettando ripetutamente su e giù (evitare di creare bolle eccessive). Trasferire gli organoidi in un tubo centrifugo da 15 ml. Tenere il tubo sul ghiaccio e se il volume è inferiore a 6 mL, riempire lentamente il tubo con Advanced DMEM/F12 per raggiungere 6 mL di volume totale.
  3. Ruotare il tubo (700 x g per 5 min a 4 °C) e rimuovere tutto il surnatante. Assicurati di non disturbare il pellet.
  4. Aggiungere 100 μL di PBS alla provetta del campione e risospescere il pellet mediante un pipettaggio delicato. Trasferire il contenuto della provetta campione in una crioviale.
  5. Aggiungere 900 μL di reagente di stoccaggio dell'RNA (vedere Tabella dei materiali) alla provetta del campione e mescolare per raccogliere eventuali organoidi rimanenti. Trasferire questi organoidi residui alla crioviale e conservarli a -80 °C (in genere quattro pozzetti raggruppati in un crioviale saranno sufficienti per le applicazioni a valle, tra cui qPCR e sequenziamento dell'RNA).
    NOTA: Una crioviale produce tipicamente un totale di 4.000 ng di RNA (misurato tramite analisi spettrofotometrica).

8. Biobanking organoide

NOTA: Il biobanking di solito si verifica 3-4 giorni dopo il passaggio. I segni di apoptosi non dovrebbero essere presenti nella cultura per eseguire questo metodo. Fare riferimento alla Figura 4 per fare riferimento alle dimensioni e alla densità appropriate per il congelamento. Biobanca di organoidi medio-grandi a densità medio-molto alte. Una fase di congelamento di emergenza può essere seguita se una linea cellulare organoide è particolarmente rara o non è garantita un'ulteriore vitalità. Seguire gli stessi passaggi per il normale biobanking organoide (passaggi da 8.1 a 8.4). Il congelamento di emergenza viene eseguito con colture più piccole e meno dense. Raggruppare il maggior numero di pozzetti di organoidi in crescita in un unico crioviale seguendo i passaggi da 8.1 a 8.4. Tieni presente che un numero sufficiente di organoidi deve essere mantenuto in vita nel tentativo di espandere la coltura (il congelamento di emergenza è semplicemente una procedura di backup per proteggersi da possibili perdite di coltura dovute a contaminazione o altri eventi imprevisti).

  1. Seguire i passaggi da 7.1 a 7.3.
  2. Aggiungere 1 mL di mezzo di congelamento per crioviale (composizione nella Tabella 1) alla provetta del campione e risospesciare delicatamente il pellet mediante pipettaggio su e giù.
  3. Trasferire 1 mL della soluzione in un crioviale (rapporto due pozzetti/crioviale) e mantenere le crioviali sul ghiaccio.
  4. Trasferire le crioviali dal ghiaccio a un contenitore di congelamento (riempire regolarmente il serbatoio con isopropanolo) e trasferirle immediatamente a -80 °C. Spostare i campioni in azoto liquido (-196 °C) per la conservazione a lungo termine dopo 24 ore.
    NOTA: al posto di uno tradizionale è possibile utilizzare anche un contenitore di congelamento delle celle senza alcool. Assicurarsi che i campioni non si scongelino durante il trasporto da -80 °C allo stoccaggio a lungo termine dell'azoto liquido. Lo scongelamento ripetuto diminuisce la vitalità della coltura cellulare.

9. Rinascita dallo stoccaggio di azoto liquido

NOTA: Quando si sceglie di scongelare una linea organoide, un sottoinsieme degli organoidi rianimati deve essere ricongelato e sostituito nella biobanca il più rapidamente possibile con almeno uno (preferibilmente più) criovelali.

  1. Posizionare l'ECM solubilizzato sul ghiaccio per scongelare lentamente, mettere una piastra a 24 pozzetti nell'incubatore (37 ° C; 5% di CO2 atmosfera) e preparare i reagenti richiesti come un tubo da 15 ml e Advanced DMEM / F12.
  2. Recuperare un campione crioviale contenente un organoide dallo stoccaggio di azoto liquido e trasferirlo immediatamente in un bagno di calore (37 °C) per 2 min.
  3. Trasferire il contenuto della crioviale in un tubo di centrifuga da 15 ml in un armadio di biosicurezza. Aggiungere lentamente DMEM/F12 avanzato prechilled per raggiungere un volume totale di 6 ml.
  4. Ruotare il tubo (700 x g per 5 minuti a 4 °C). Rimuovere il surnatante e assicurarsi di non disturbare il pellet.
  5. Aggiungere 180 μL (30 μL per pozzetto) di ECM solubilizzato al pellet e placcare questa sospensione nella piastra preriscaldata a 24 pozzetti. Un crioviale può essere placcato a sei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
  6. Posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore (37 °C; 5% di CO2 atmosfera) per ~ 30 minuti e aggiungere CMGF + R / G (per gli organoidi intestinali, passare a CMGF + in 24-48 ore).
    NOTA: Quando un campione è placcato e cresce nella piastra a 24 pozzetti, deve essere lasciato recuperare per almeno 2 giorni prima del passaggio per aumentare la vitalità.

Risultati

Il protocollo organoide canino genera tipicamente da ~ 50.000 a ~ 150.000 cellule intestinali o epatiche per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Gli organoidi rappresentativi possono essere visti nella Figura 6.

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Figura 6: Immagini rappresentative di organoidi canini. Sono raffigurate immagini di organoidi isolati utilizzando questo protocollo. (A,B) Organoidi intestinali derivati dal duodeno (presi a ingrandimento obiettivo 10x e 5x). Si noti la presenza di organoidi budded più vecchi e sferoidi più giovani. (C,D) Enteroidi canini dalla parte inferiore del digiuno (presi a ingrandimento obiettivo 10x e 20x). (E,F) Enteroidi ileali (presi a ingrandimento obiettivo 20x e 5x) e colonidi (G,H) (presi a ingrandimento obiettivo 10x). (I) Un'immagine rappresentativa di organoidi epatici presi con ingrandimento obiettivo 20x. La maggior parte degli organoidi sono nella loro forma in erba. Nella foto si possono vedere anche sferoidi epatici più giovani. (J) Immagine rappresentativa che mostra un organoide rareepatico che forma una struttura simile a un condotto (presa con ingrandimento obiettivo 10x). La barra della scala (500 μm) è presente nell'angolo in alto a sinistra di ogni immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Enteroidi e colonidi derivati utilizzando questo protocollo sono stati caratterizzati in precedenza da Chandra et al. nel 201912. Gli organoidi intestinali canini sono composti da una popolazione cellulare regolare dell'epitelio intestinale. Utilizzando l'ibridazione di RNA in situ , l'espressione di biomarcatori di cellule staminali (Leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5 - LGR5 e SRY-Box Transcription Factor 9 - SOX9), Paneth Cell Biomarker (Ephrin type-B receptor 2 - EPHB2), marcatori di cellule epiteliali assorbenti (fosfatasi alcalina - ALP) e marcatore enteroendocrino (Neurogenin-3 - Neuro G3)12 è stato confermato. La colorazione Alcian Blue è stata eseguita su vetrini incorporati in paraffina per confermare la presenza di cellule di calice. Inoltre, sono stati eseguiti saggi funzionali come l'imaging metabolico ottico (OMI) o il test del gonfiore del regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) per confermare l'attività metabolica degli organoidi. Anche gli organoidi canini di cani con diagnosi di malattia infiammatoria intestinale, tumori stromali gastrointestinali (GIST) o adenocarcinoma del colon-retto sono stati isolati utilizzando questo protocollo12.

Dopo l'isolamento delle cellule staminali, gli organoidi canini epatici iniziano il loro ciclo di vita come sferoidi in espansione e, dopo ~ 7 giorni, si trasformano in organoidi in erba e differenzianti. Gli sferoidi epatici canini isolati e coltivati secondo questo protocollo sono stati misurati per quantificare la loro crescita e determinare il tempo ideale per il passaggio. Gli sferoidi derivati da biopsie epatiche laparoscopiche di cani adulti sani (n = 7) sono stati misurati durante i loro primi 7 giorni di coltura. Sono state scattate immagini rappresentative e il raggio longitudinale (a) e diagonale (b) degli sferoidi (n = 845) è stato misurato in tutta la cultura. Sono stati calcolati il volume (V), la superficie (P), l'area dell'ellisse 2D (A) e la circonferenza (C) degli sferoidi. I calcoli e i risultati dell'esperimento sono riassunti nella Figura 7. L'area dell'ellisse 2D e la circonferenza sono state utilizzate per valutare la salute della coltura organoide utilizzando la microscopia ottica. Questi valori possono servire da guida per le decisioni di manutenzione della cultura.

In breve, gli sferoidi si espansero rapidamente in volume, superficie, area dell'ellisse 2D e circonferenza. I dati di misurazione dei sette beagle sono stati calcolati in media per i seguenti calcoli. Il volume è aumentato del 479% (±6%) dal giorno 2 al 3. Allo stesso tempo, la superficie sferoidale e l'area dell'ellisse 2D sono aumentate rispettivamente del 211% (±208%) e del 209% (±198%). La circonferenza dell'ellisse 2D è aumentata dal giorno 2 al 3 del 73% (±57%). L'aumento del volume complessivo degli organoidi epatici dai giorni 2-7 è stato più di 365 volte, la superficie e l'area dell'ellisse 2D sono aumentate di 49 volte e la circonferenza dell'ellisse 2D è aumentata di sei volte.

Successivamente, gli sferoidi derivati da due campioni canini adulti sono stati ulteriormente coltivati dopo il passaggio e raccolti ogni giorno (giorno 2-7) per l'ibridazione dell'RNA in situ (RNA ISH). Sono state progettate sonde canine (l'elenco delle sonde è fornito come Tabella supplementare 2) ed è stata valutata l'espressione di mRNA per i marcatori delle cellule staminali (LGR5), i marcatori specifici per i colangiociti (citocheratina 7 - KRT-7 e acquaporina 1 - AQP1), nonché i marcatori epatocitari (proteina A1 - FOXA1 della scatola della testa a forcella E il citocromo P450 3A12 - CYP3A12). L'espressione dei marcatori è stata valutata in modo semi-quantitativo (immagini rappresentative nella Figura 8). Gli sferoidi esprimevano preferenzialmente il marcatore colangiocitario KRT-7 che va dall'1% al 26% nell'area del segnale / area totale delle cellule. AQP1 non è stato espresso nei campioni organoidi, probabilmente perché la sua presenza nei campioni epatici canini è scarsa. L'espressione del marcatore delle cellule staminali (LGR5) variava tra lo 0,17% e lo 0,78%, mentre i marcatori epatocitari erano espressi in misura inferiore allo 0,05%-0,34% per FOXA1 e allo 0,03%-0,28% per il CYP3A12.

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Figura 7: Misurazioni degli sferoidi epatici. (A) La crescita epatica degli sferoidi è stata osservata ogni giorno di colture dal giorno 2 al giorno 7. Gli sferoidi si sono formati per la prima volta il giorno 2 e gli ultimi sferoidi hanno iniziato il processo di germogliamento il giorno 7. Un esperimento successivo ha utilizzato due linee organoidi canine dopo il passaggio per raccogliere sferoidi ogni giorno per l'incorporamento di paraffina per eseguire l'RNA ISH (l'immagine del giorno 2 è stata scattata a 40x, l'immagine del giorno 6 a 10x e il resto delle immagini sono state scattate con ingrandimento 20x). (B) Un cluster sferoide epatico è mostrato attaccato a un pezzo di tessuto incorporato in ECM solubilizzato 4 giorni dopo l'isolamento. Sono stati misurati i raggi longitudinali e diagonali degli sferoidi (immagine scattata a 10x). Il pannello (C) illustra la formula utilizzata per i calcoli per ricavare volume (V), superficie (P), area dell'ellisse 2D (A) e circonferenza (C). Per questi calcoli, si presumeva che gli sferoidi epatici canini fossero sferoidi ideali. I risultati delle misurazioni del volume, della superficie, dell'area dell'ellisse 2D e della circonferenza dell'ellisse 2D degli sferoidi epatici per i singoli giorni di crescita sono rappresentati nel pannello (D). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). (E) L'espressione di mRNA di KRT-7, LGR5, FOXA1 e CYP3A12 è stata misurata in campioni di sferoidi epatici canini dopo il passaggio dal giorno 2 al giorno 7. AQP1 non è stato espresso in questi campioni. Una barra di scala (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) è presente in alto a sinistra di ogni immagine. Ingrandimento oggettivo notato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli organoidi raramente non si rompono durante il processo di passaggio seguendo questa tecnica standardizzata. Se la dissociazione non si verifica, i tempi di passaggio possono essere regolati per ottenere una disintegrazione ottimale del cluster cellulare. Tuttavia, l'esposizione prolungata alla proteasi simile alla tripsina può avere un impatto negativo sulla crescita degli organoidi. Gli organoidi epatici sono stati utilizzati in un esperimento successivo per studiare il tempo di dissociazione ottimale e stabilire un metodo di passaggio adeguato. In breve, gli organoidi epatici di due cani sani (6 ben replicati ciascuno) sono stati sottoposti a proteasi simile alla tripsina per 12 minuti e 24 minuti. I campioni sono stati agitati ogni 6 minuti. Alla fine del timepoint di dissociazione, 6 mL di Advanced DMEM/F12 ghiacciato sono stati aggiunti alla soluzione e i campioni sono stati filati (700 x g per 5 minuti a 4 °C). Il surnatante (Advanced DMEM/F12 con proteasi diluita simile alla tripsina) è stato rimosso e i pellet sono stati incorporati in ECM solubilizzato come descritto sopra (passaggi 4.4-4.5). Dopo 12 ore di coltura in ECM solubilizzato e CMGF+ R/G, sono state osservate differenze in entrambi i campioni. Un'incubazione di 12 minuti con proteasi simile alla tripsina non ha inibito la crescita degli organoidi. Tuttavia, la crescita degli organoidi è stata influenzata negativamente (vedi Figura 9) utilizzando un'incubazione di 24 minuti.

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Figura 9: Esperimento di passaggio organoide epatico canino. Immagini rappresentative di organoidi derivati da due cani (D_1 e D_2) sono state passate utilizzando il metodo di incubazione della proteasi simile alla tripsina per 12 minuti o 24 minuti. I campioni di controllo sono stati passati con proteasi simile alla tripsina per 10 minuti. Una barra di scala (μm) è presente in alto a sinistra di ogni immagine e rappresenta 500 μm (ingrandimento obiettivo 5x). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Successivamente, è stata eseguita l'indagine sulla sopravvivenza degli organoidi epatici canini derivati da questo protocollo in un ambiente sfavorevole (privazione di supporto strutturale e nutrizione). L'indagine si è concentrata sulla determinazione del volume di mezzi organoidi e della matrice basale necessari per la crescita e la sopravvivenza di successo dell'organoide epatico e anche sulla determinazione dell'influenza di tali condizioni sulla coltura di organoidi. La sopravvivenza è stata misurata in una piastra a 96 pozzetti con un numero limitato di organoidi. Gli organoidi di due cani sono stati passati come descritto sopra e incorporati (12 repliche) in diversi volumi di ECM solubilizzato (10 μL o 15 μL). Le cellule sono state placcate in una concentrazione di 400 cellule/10 μL di pozzetto e 600 cellule/15 μL di pozzetto corrispondenti a 40.000 cellule/mL. Due tipi di supporti (CMGF+ o CMGF+ R/G) sono stati aggiunti in volumi diversi (25 μL, 30 μL o 35 μL). Il supporto non è mai stato modificato e non sono state eseguite procedure di manutenzione. La sopravvivenza degli organoidi è stata monitorata ogni giorno. La morte organoide è stata definita come la dissoluzione di oltre il 50% delle strutture organoidiche. Il tasso di sopravvivenza degli organoidi in queste condizioni variava da 12,9 (±2,3) giorni a 18 (±1,5) giorni e i risultati sono riassunti nella Tabella 3. I due campioni sopravvissuti più a lungo erano organoidi derivati da cani incorporati in 15 μL di ECM solubilizzato e 30 μL di mezzi CMGF+. Entrambi i campioni sono stati incorporati in ECM solubilizzato (30 μL) e mezzi freschi (500 μL) in una piastra standard a 24 pozzetti dopo 18 giorni di privazione per garantire che l'espansione degli organoidi fosse ancora possibile (Figura 10).

Tipo di supportoMedia (giorni sopravvissuti)MedianoCV%Media (giorni sopravvissuti)MedianoCV%Media (giorni sopravvissuti)MedianoCV%Media (giorni sopravvissuti)MedianoCV%
Fluidi (μL)30253530
ECM (μL)10101015
D_1CMGF+ R/G12.501311.5712.83134.5011.8311.512.9112.081312.46
CMGF+17.081716.2618.50194.8918.421914.5417.82198.99
D_2CMGF+ R/G13.671413.3613.001312.7014.0014.517.2313.08138.90
CMGF+15.501518.5617.501810.4817.501920.8917.001714.41
TOTALECMGF+ R/G13.081313.1312.92139.3912.921317.5212.581311.22
CMGF+16.2916.517.6918.0018.58.3517.961917.6517.431711.70
morte= più del 50% della massa organoide non è vitale

Tabella 3: Risultati degli esperimenti di sopravvivenza. L'esperimento si basava sulla privazione del supporto strutturale o della nutrizione di due colture organoidiche. I risultati includono la media, la mediana e la deviazione standard (CV%) delle singole concentrazioni di ECM solubilizzata e media nei singoli cani.

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Figura 10: Deprivazione nutrizionale e strutturale degli organoidi. Gli organoidi sono stati riprodotti in piastre a 24 pozzetti per confermare la capacità di espansione post-privazione (A). Le immagini rappresentative del giorno 4 e del giorno 7 dopo la ripaplating mostrano l'espansione degli organoidi, confermando la capacità di identificare visivamente gli organoidi vitali (le immagini sono prese con ingrandimento obiettivo 5x). Immagini rappresentative di organoidi considerati vivi o morti sono visibili in (B). Le immagini vengono scattate con un ingrandimento obiettivo 5x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Immagini rappresentative di ibridazione in situ di sferoidi epatici dell'RNA. Immagini rappresentative dei marcatori LGR5, KRT7, FOXA1 e CYP3A12 sono state prese con un ingrandimento obiettivo di 60 volte dei campioni dal giorno 2-7 dopo il passaggio. Le molecole di mRNA positive si colorano di rosso. AQP1 non è stato espresso nei campioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Composizione incompleta della soluzione chelante (ICS)Concentrazione finale
500 ml H2ONA
2,49 g Na2HPO4-2H2O4,98 mg/ml
2,7 g DI KH2PO4 5,4 mg/ml
14 g di NaCl28 mg/mL
0,3 g KCl0,6 mg/ml
37,5 g Saccarosio75 mg/ml
25 g di D-Sorbitolo50 mg/ml
Composizione completa della soluzione chelante (CCS)V/V % o concentrazione finale
Soluzione di chelazione incompleta20%
H2O sterile80%
DTT ·520 μM
Penna StrepPenna: 196 U/mL; Streptococco 196 ug/mL
Composizione di organidiConcentrazione finale
DMEM/F12 avanzatoNA
FBS ·8%
Glutamax2 mM
HEPES ·10 mM
Primocin ·100 μg/ml
Supplemento B271x
Supplemento N21x
N-acetil-L-cisteina1 mM
Murino FEG50 ng/ml
Murine Noggin100 ng/ml
Umano R-Spondin-1500 ng/ml
Murino Wnt-3a100 ng/ml
[Leu15]-Gastrina I umano10 nM
Nicotinammide10 mM
A-83-01500 nM
SB202190 (inibitore P38)10 μM
TMS (trimetoprim sulfametossazolo)10 μg/mL
Componenti aggiuntiviConcentrazione finale
Inibitore ROCK (Y-27632)10 μM
Stemolecola CHIR99021 (GSK3β)2,5 μM
Congelamento della composizione dei supportiPercentuale V/V
Fluidi organoidi e inibitori ROCK50%
FBS ·40%
Dimetilsolfossido (DMSO)10%
Composizione FAAPercentuale V/V
Etanolo (100%)50%
Acido acetico glaciale5%
Formaldeide (37%)10%
Acqua distillata35%

Tabella 1: Composizione delle soluzioni e dei media. Un elenco di componenti e concentrazioni di soluzioni chelanti incomplete e complete, CMGF+ (mezzi organoidi), mezzi di congelamento e FAA.

Tabella supplementare 1: Modello di cura degli organoidi. Questo modello consente di prendere appunti organoidi accurati e riproducibili per ogni giorno. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 2: Sonde di ibridazione dell'RNA in situ. Elenco delle sonde specificamente progettate per bersagli di mRNA canino da un produttore della tecnologia per eseguire la tecnica di ibridazione dell'RNA in situ. Sono elencate informazioni sul significato dei singoli marcatori, il nome di una sonda, il suo numero di riferimento e la regione di destinazione. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Attualmente mancano protocolli standardizzati per l'isolamento e il mantenimento degli organoidi epatici e intestinali canini. È necessario stabilire procedure operative standard per le colture organoidi affinché questo modello sia applicabile in diversi ambienti di laboratorio. In particolare, fornire protocolli operativi standardizzati per la coltura di questi modelli di organoidi canini è la chiave per caratterizzare la normale crescita degli organoidi durante la coltura e il passaggio per ricavare punti temporali ottimali per l'espansione e la manutenzione. Gli organoidi intestinali canini coltivati utilizzando il protocollo sono stati precedentemente caratterizzati da Chandra et al.12.

Uno dei passaggi più critici del protocollo è il passaggio degli organoidi. Il momento ottimale per il primo passaggio degli sferoidi epatici è stato determinato il giorno 7 dopo l'isolamento in base alle misurazioni dello sferoide epatico. Il volume massimo di sferoidi è stato raggiunto entro il giorno 7 e, allo stesso tempo, gli sferoidi hanno iniziato a germogliare e formare organoidi epatici. L'aumento del volume complessivo degli organoidi dal giorno 2-7 dopo l'isolamento è stato di oltre 365 volte, suggerendo che il tempo di passaggio ottimale è più lungo della coltura di organoidi intestinali canini. Dopo 7 giorni in coltura, non sono stati osservati segni grossolani di apoptosi cellulare nello sferoide epatico, anche senza pulizia o passaggio (Figura 7). Il passaggio degli organoidi intestinali ed epatici può essere impegnativo in quanto la procedura può portare alla perdita di cellule e all'alterazione della vitalità. I risultati indicano che l'incubazione prolungata di organoidi epatici con proteasi simile alla tripsina (fino a 12 min) non influenza negativamente la sottocoltura. L'incubazione degli organoidi in proteasi simile alla tripsina per più di 24 minuti può essere dannosa per la successiva sottocoltura degli organoidi.

In caso di rottura non ottimale nei cluster cellulari con il passaggio organoide, la dissociazione meccanica invece dell'incubazione prolungata con proteasi simile alla tripsina potrebbe essere più vantaggiosa. Se si riscontrano problemi con una corretta dissociazione degli organoidi, si può tentare di allungare brevemente i campioni per migliorare la resa di passaggio. D'altra parte, il vortice ha il potenziale per rovinare una coltura e danneggiare le cellule, quindi dovrebbe essere usato solo quando altre procedure hanno fallito ripetutamente. Rompere gli organoidi epatici in singole cellule abbassa il tasso di crescita degli organoidi, mentre romperli in gruppi di cellule può migliorare notevolmente la loro vitalità. Dieci minuti sono stati scelti come tempo di incubazione per il protocollo organoide. Un timepoint di incubazione di 12 minuti è stato ritenuto non citotossico rispetto a un'incubazione di 24 minuti nell'esperimento di proteasi simile alla tripsina.

L'esperimento di sopravvivenza ha confermato che gli organoidi epatici canini potrebbero sopravvivere fino a 19,5 giorni in condizioni sfavorevoli (esaurimento strutturale e nutrizionale). Gli organoidi che sono sopravvissuti a queste condizioni più a lungo sono stati coltivati con mezzi CMGF +. Questa osservazione potrebbe essere stata causata dalla crescita più lenta di organoidi epatici in mezzi non integrati con inibitore di Rock e GSK3β. Le colture organoidiche con CMGF+ R/G sono cresciute più velocemente e potrebbero aver esaurito le loro risorse più velocemente. Questo esperimento apre la possibilità di miniaturizzare la coltura di organoidi canini per ottenere una conversione del sistema ad alto rendimento. Tale tecnologia mostra il potenziale per facilitare la scoperta di farmaci o studi tossicologici a un costo sostanzialmente ridotto.

Alcuni problemi comuni riscontrati durante la manutenzione della coltura organoide canina sono la solidificazione impropria del campione durante la placcatura, la contaminazione della coltura e la determinazione della corretta densità e dimensione degli organoidi. Se l'ECM solubilizzato si solidifica prematuramente durante la placcatura, metterlo immediatamente sul ghiaccio per 10 minuti. Se l'ECM solubilizzato non forma strutture a cupola, è probabile che non siano stati rimossi abbastanza mezzi dal campione. In questo caso, diluire il campione con un ECM più solubilizzato fino a formare delle cupole.

Quando la contaminazione fungina o batterica si trova in un'intera piastra (vedere la Figura 4), la soluzione migliore è scartare la piastra. Il trattamento con farmaci antifungini o antibiotici può essere tentato, ma il successo di tale tentativo è estremamente basso. Se un singolo pozzo è contaminato in una piastra, i pozzi vitali e non interessati possono essere puliti (seguire i passaggi da 4.1 a 4.5) su una nuova piastra e monitorati attentamente. Se il campione è già stato congelato di emergenza, è consigliabile scartare l'intero campione, poiché lo scongelamento del campione espone l'incubatore a un ulteriore rischio di contaminazione.

La coltura di organoidi sani dovrebbe essere almeno nella categoria di medie dimensioni e media densità o superiore. La densità ottimale è fondamentale per la crescita della coltura di organoidi. La densità inferiore deve essere corretta pulendo gli organoidi a media densità. Se si verifica la situazione di densità estrema (sovraffollamento), gli organoidi dovrebbero essere espansi a più pozzi. Segni grossolani di apoptosi cellulare spesso accompagnano sia il sovraffollamento che la bassa densità della coltura organoide. Se questi problemi non vengono corretti in tempo, l'intera coltura organoide diventerà apoptotica nel giro di pochi giorni. Se gli organoidi raggiungono dimensioni extra large o densità molto elevate, la coltura deve essere utilizzata per un esperimento, congelamento o fissazione.

Il mezzo organoide contiene attualmente 17 componenti e l'aggiunta di fattori di crescita necessari per la manutenzione e l'espansione degli organoidi può quindi essere costosa. Questo problema può essere risolto coltivando colture cellulari 2D che sintetizzano i fattori di crescita per produrre CMGF+ condizionato. La coltura cellulare L-WRN produce fattori di crescita Wnt-3a, R-Spondin-3 e Noggin37. La colonia cellulare utilizza il 90% di DMEM/F12 e il 10% di terreni di coltura FBS. Quando la cultura raggiunge il 90% di confluenza, i media vengono raccolti ogni giorno per 1 settimana. Il mezzo raccolto viene quindi miscelato con 2x CMGF+ (senza questi fattori di crescita). Mentre le colture 2D possono produrre i fattori di crescita necessari a una frazione del costo, è necessario prevedere il tempo e la preparazione aggiunti per produrre i supporti. Anche le concentrazioni di fattori di crescita tra lotti di mezzi condizionati possono differire37,38.

Le colture organoidi derivate da cellule staminali adulte canine sono un modello biomedico unico che può aiutare a raggiungere gli obiettivi della One Health Initiative39. La tecnologia organoide può essere utilizzata in molte aree di ricerca di base e biomedica, che vanno dalla biologia dello sviluppo, alla fisiopatologia, alla scoperta e ai test di farmaci, alla tossicologia allo studio delle malattie infettive e alla medicina rigenerativa40. La ricerca traslazionale e traslazionale inversa sono entrambe aree in cui sono applicabili gli organoidi canini15. I cani sono stati usati per secoli in contesti sperimentali traslazionali e il loro status di animale da compagnia ha anche facilitato la loro posizione come una delle specie più esplorate in medicina veterinaria.

In conclusione, questo manoscritto fornisce protocolli operativi standardizzati per l'isolamento, la manutenzione, la raccolta e il biobanking di organoidi epatici e intestinali canini per facilitare l'applicazione di questo modello in vari campi biomedici. Questo modello è particolarmente adatto a promuovere la ricerca traslazionale inversa come strumento dell'iniziativa One Health per promuovere la condivisione interdisciplinare e intradisciplinare delle conoscenze.

Dichiarazioni

K. Allenspach è co-fondatore di LifEngine Animal Health e 3D Health Solutions. È consulente per Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics e Mars. J. P. Mochel è co-fondatore di LifEngine Animal Health e 3D Health Solutions. Il Dr. Mochel è consulente per Ceva Animal Health ed Ethos Animal Health. Altri autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori vogliono esprimere gratitudine ai dipendenti del Veterinary Diagnostic Laboratory della Iowa State University, vale a dire, Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green e Jennifer M. Groeltz-Thrush, per la tempestiva elaborazione dei campioni forniti. Gli autori desiderano riconoscere il supporto di Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award e NSF SBIR sub-award a ISU # 1912948.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione chelante
D-SorbitoloFisher ChemicalBP439-500
DTTPromegaV3151
KClFisher ChemicalP217-500
KH2PO4SigmaP5655-100G
Na2HPO4-2H2OSigma S5136-100G
NaClFisher ChemicalS271-500
Pen StrepGibco15140-122
SaccarosioFisher ChemicalS5-500
Organoid media
[Leu15]-gastrina I umanaSigmaG9145-.5MG
A-83-01PeproTech9094360
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B27 supplementoGibco17504-044
FBSCorning35-010-CV
GlutamaxGibco35050-061
HEPESVWR Life ScienceJ848-500ML
Umano R-Spondin-1PeproTech120-38-500UG
Murino EGFPeproTech315-09-1MG
Murino NogginPeproTech250-38-250UG
Murino Wnt-3aPeproTech315-20-10UG
N2 supplementoGibco17502-048
N-acetil-L-cisteinaSigmaA9165-25G
NicotinamideSigmaN0636-100G
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ROCK inibitore (Y-27632)EMD Millipore Corp.SCM 075
SB202190 (inibitore di P38)SigmaS7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)Reprocell04-0004-base
TrimetoprimSigmaT7883-5G
SulfametossazoloSigma-AldrichS7507-10G
Reagents
Acido acetico, GlacialeFisher ChemicalA38-500
Dimetil solfossido (DMSO)Fisher ChemicalsD128-500
EDTA, pH 8,0, 0,5 MInvitrogen15575-038
Formaldeide (37%)Fisher ChemicalF79P-4
Soluzione di glutaraldeideSigmaG5882
Matrice Matrigel per coltura di organoidiCorning356255Matrice di membrana extracellulare
Paraformaldeide, 97%Alfa AesarA11313
PBS, 1X (soluzione salina tamponata con fosfato)Corning21-040-CM
PBS, 1X (soluzione salina tamponata con fosfato)Corning21-040-CM
RNAlater Soln.InvitrogenAM7021Reagente per la conservazione dell'RNA
TrypLE ExpressGibco12604-021Proteasi simile alla tripsina
Altro
6 pozzetti Piastra per colture cellulariCorning3516
ACD Hybez II Sistema di ibridazioneACD a biotechne marca321710
Provetta da centrifuga, 15 mLCorning430766
CoolCell LXCorningBCS-405MC
Fiale criogenicheCorning430488
Provetta da centrifuga monouso (50 mL)Fisherbrand05-539-13
GyroMini Miscelatore nutante (bilanciere)LabnetS0500-230V-EU
Bagno di caloreLab-Line Instruments3000
Mr. Frosty Contenitore di congelamentoThermoFisher Scientific5100-0001
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificND2000CLAPTOP SpettrofotometroAnalisi
Incubatore PanasonicPanasonicMCO-170ML-PA
Parafilm M Film di avvolgimentoBemis Company IncPM996/EMDNastro in film flessibile
da laboratorio protetto monouso BisturiBard-Parker239844
RNAscope 2.5 HD Saggio – REDACD un marchio biotechne322350
RNAscope H2O2 & Reagenti Protease PlusACD un marchio biotechne322330
RNAscope Target Retrieval ReagentsACD un marchio biotechne322000
RNAscope Wash Buffer ReagentsACD un marchio biotechne310091
Tissue Culture Dish DotScientific6676621
Piastra per coltura tissutale 24 pozzettiFisherbrandFB012929

Riferimenti

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