Il presente protocollo descrive il modello di lembo fascio-cutaneo suino e il suo potenziale utilizzo nella ricerca sui tessuti compositi vascolarizzati.
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Articolo metodologico
Un modello affidabile di lembo fascio-cutaneo suino per studi di bioingegneria di allotrapianti compositi vascolarizzati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli allotrapianti compositi vascolarizzati (VCA) come il trapianto di mano, viso o pene rappresentano il trattamento all'avanguardia per i difetti devastanti della pelle, falliti dai primi passi della scala ricostruttiva. Nonostante i risultati estetici e funzionali promettenti, il principale fattore limitante rimane la necessità di un'immunosoppressione permanente drasticamente applicata e i suoi ben noti rischi medici, prevenendo indicazioni più ampie. Pertanto, sollevare la barriera immunitaria nella VCA è essenziale per ribaltare la scala etica e migliorare la qualità della vita dei pazienti utilizzando le tecniche chirurgiche più avanzate. La creazione de novo di un innesto specifico per il paziente è l'imminente svolta nel trapianto ricostruttivo. Utilizzando tecniche di ingegneria tissutale, i VCA possono essere liberati dalle cellule donatrici e personalizzati per il ricevente attraverso perfusione-decellularizzazione-ricellularizzazione. Per sviluppare queste nuove tecnologie, è necessario un modello VCA animale su larga scala. Quindi, i lembi fascio-cutanei suini, composti da pelle, grasso, fascia e vasi, rappresentano un modello ideale per studi preliminari in VCA. Tuttavia, la maggior parte dei modelli VCA descritti in letteratura includono muscoli e ossa. Questo lavoro riporta una tecnica affidabile e riproducibile per la raccolta di lembo fascio-cutaneo safeno nei suini, uno strumento pratico per vari campi di ricerca, in particolare l'ingegneria dei tessuti compositi vascolarizzati.
Introduzione
Gli allotrapianti compositi vascolarizzati (VCA) hanno rivoluzionato il trattamento delle perdite di parti del corpo difficili da riparare, come mani, viso e pene 1,2,3. Sfortunatamente, i primi risultati a lungo termine4 hanno dimostrato che la somministrazione permanente di agenti immunosoppressori ad alte dosi può portare a gravi condizioni mediche collaterali, tra cui diabete, infezioni, neoplasie e disfunzione reno-vascolare5. Ultimamente, team esperti di VCA hanno dovuto gestire il rischio di rigetto cronico che porta alla perdita del trapianto ed eseguire i primi casi di trapianto facciale 6,7. Sono state descritte diverse strategie per superare i limiti dell'immunosoppressione nella VCA. Il primo si basa sulla determinazione della tolleranza all'innesto a lungo termine inducendo uno stato di chimerismo misto immunitario nel ricevente di allotrapianto 8,9. Il secondo prevede la creazione de novo di un innesto specifico per il paziente tramite ingegneria tissutale.
Recentemente, la decellularizzazione per perfusione di tessuti biologici ha generato scaffold nativi della matrice extracellulare (ECM), consentendo la conservazione della rete vascolare e dell'architettura tissutale di interi organi10. Quindi, la ricellularizzazione di queste ECM con cellule specifiche del ricevente creerebbe un innesto personalizzato privo di vincoli immunitari. Nella ricerca sulla bioingegneria VCA, più team hanno decellularizzato e ottenuto tale ECM preservando l'intera architettura11,12,13. Tuttavia, il processo di ricellularizzazione rimane impegnativo e non ha avuto successo nei modelli animali di grandi dimensioni14,15. Lo sviluppo di queste tecnologie innovative crea la necessità di modelli di tessuti compositi animali affidabili e riproducibili. I modelli suini rappresentano la scelta massima nella pipeline di sviluppo della bioingegneria, poiché la pelle suina presenta le caratteristiche anatomiche e fisiologiche più vicine alla pelle umana16. L'utilizzo dei lembi fascio-cutanei (FCF) è ideale durante i primi passi verso la creazione di innesti di tessuto composito vascolarizzato "su misura". Infatti, FCF è un modello elementare VCA contenente pelle, grasso, fascia e cellule endoteliali. Una descrizione dei lembi miocutanei suini17 e dei lembi osteomiocutanei18 può essere trovata in letteratura. Tuttavia, vi è una mancanza di attenzione alle tecniche di raccolta dei lembi fascio-cutanei.
Pertanto, questo studio mira a fornire ai ricercatori una descrizione dettagliata di una tecnica di approvvigionamento FCF safena suina e descrivere tutte le caratteristiche del lembo per il suo utilizzo in molti campi di ricerca, in particolare nell'ingegneria dei tessuti compositi vascolarizzati.
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Protocollo
Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane seguendo la Guida del National Institute of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali ha approvato il protocollo sperimentale (protocollo IACUC #2020N000015). Sette femmine di maiali dello Yorkshire (20-25 kg) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti.
1. Cure preoperatorie
- Digiunare l'animale per il cibo solido 12 ore prima dell'intervento.
- Sedare l'animale con 4,4 mg/kg di telazolo, 2,2 mg/kg di xilazina e 0,04 mg/kg (IM) di atropina solfato (vedere Tabella dei materiali).
- Posizionare un catetere endovenoso periferico da 18 G in una vena dell'orecchio.
- Intubare i suini con un tubo endotracheale appropriato (6-15 mm possono essere utilizzati per suini da 10-200 kg) e collegare il tubo a un ventilatore. Somministrare l'analgesia preoperatoria con buprenorfina (0,05 mg/kg, IM) (vedere Tabella dei materiali).
2. Monitoraggio intraoperatorio
- Mantenere l'anestesia con una miscela per inalazione di isoflurano all'1,5%-3% con flusso di ossigeno di 1,5 L/min.
- Monitorare continuamente la frequenza cardiaca, la pulsossimetria e la CO2 di fine marea. Valutare la pressione sanguigna e la temperatura corporea ogni 5 minuti.
NOTA: L'intervallo target per la frequenza cardiaca è compreso tra 90-100 battiti / min, la saturazione di ossigeno deve essere superiore al 93% e l'intervallo CO 2 di fine marea è compreso tra il 5% -6% di CO2. - Somministrare 5-10 ml/kg all'ora di soluzione salina allo 0,9% durante tutta la procedura per regolare la pressione arteriosa media tra 60 mmHg e 90 mmHg.
3. Approvvigionamento bilaterale safeno FCF
- Metti l'animale in posizione supina. Rasare e strofinare sia l'inguine che gli arti posteriori, includere l'intero arto posteriore nel sito chirurgico e drappeggiare in modo sterile.
- Palpare il polso dell'arteria safena ~ 3 dita di larghezza mediale dalla rotula e taggarlo.
- Identificare e disegnare i limiti del lembo.
NOTA: Il limite superiore è un asse parallelo alla piega inguinale 3 cm sotto di esso. Il limite laterale è un asse dalla spina iliaca superiore anteriore alla parte mediale della rotula. - Disegnare un lembo ovale di 10 cm di diametro centrato sul peduncolo safeno e contenuto nei limiti del lembo precedentemente descritti (punto 3.3).
- Fare un'incisione cutanea di 1,5 cm per quanto riguarda la porzione distale del peduncolo sul punto di riferimento del lembo.
- Aprire la fascia e sezionare smussata per esporre l'arteria safena e le sue due vene comitanti. Eseguire una doppia legatura e separare in un fascio.
- Incidi la pelle rimanente del lembo con una lama.
- Utilizzare cauterizzazione per aprire il tessuto sottocutaneo e la fascia circostante. Eseguire un'emostasi completa utilizzando una pinza bipolare (vedere la tabella dei materiali).
- Attaccare la componente cutanea del lembo alla fascia sottostante con punti di sutura 3-0 non assorbibili per evitare la trazione involontaria e l'interruzione dei vasi perforanti.
- Liberare il lembo dal gracile sezionando la fascia lontano dal muscolo.
NOTA: La parte distale del peduncolo safeno corre su un piano tra il muscolo gracile e la fascia. Una tensione appropriata e una cauta emostasi bipolare dei rami laterali sono elementi cruciali per facilitare la dissezione del peduncolo. - Utilizzare un bisturi per fare un'incisione di 12 cm nella piega inguinale. Eseguire un'incisione perpendicolare unendo la piega inguinale alla parte prossimale del lembo. Sollevare la pelle di collegamento e aprire lo strato sottocutaneo usando la cauterizzazione.
- Continuare la dissezione del peduncolo seguendo i vasi safeni verso i vasi femorali.
NOTA: La porzione prossimale del peduncolo safeno può attraversare il setto intermuscolare o immergersi nel muscolo gracili. - Scheletrizzare i vasi femorali e ligarli distalmente al ramo safeno in due fasci separati. Continuare la dissezione dei vasi femorali da distale a prossimale fino a raggiungere il livello del legamento inguinale. Usa una pinza bipolare per cauterizzare o clip vascolari e cravatte di seta 2-0 per legare i vasi femorali profondi, quindi tagliare.
NOTA: Le clip vascolari possono essere utilizzate anche prima di tagliare i vasi. - Ripetere i passaggi 3.2-3.13 sull'arto posteriore controlaterale per raccogliere il secondo lembo safeno.
- Eparinizzare l'animale con un'iniezione endovenosa (IV) di eparina (100 UI/kg) 5 minuti prima del punto 3.16.
- Ligare il peduncolo femorale (arteria e vena) il più possibile prossimale al legamento inguinale e separare il lembo dal maiale donatore.
- Dilatare le estremità del vaso femorale e inserire un angiocatetere da 20 G sia nell'arteria che nella vena. Utilizzare cravatte di seta 3-0 per fissare il catetere ai vasi.
- Lavare lentamente l'arteria del lembo fascio-cutaneo con 10 ml di soluzione salina di eparina (100 UI/ml) fino a quando non si osserva un chiaro deflusso venoso (Figura 1).
Figura 1: Lembo fascio-cutaneo safeno nativo e decellularizzato. (A) Lembo cutaneo isolato con un angiocatetere da 20 G inserito nell'arteria femorale, che permette di lavare il lembo dal sangue e procedere con diversi esperimenti (angiografia, decellularizzazione di perfusione). (B) Lembo cutaneo decellularizzato. Decellularizzazione della perfusione che produce scaffold bianchi acellulari dopo 10 giorni di perfusione detergente. Sezioni trasversali a tutto spessore colorate con H&E di lembo cutaneo nativo (C) e lembo cutaneo decellularizzato (D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
- Eutanasia dell'animale con un'iniezione endovenosa di fenobarbital di sodio (100 mg/kg). Confermare la morte per l'assenza di battito cardiaco e movimenti respiratori.
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Risultati
Questo lavoro su animali vivi è stato preceduto dalla determinazione del perforasoma safeno su tre campioni cadaverici (Figura 2). Una soluzione di riempimento colorata è stata iniettata nell'arteria safena per opacizzare la specifica rete vascolare proveniente dall'arteria. La soluzione è composta da 10 mL di agente glicerina di colore blu miscelato con 10 mL di agente diluente (vedere Tabella dei materiali). Ciò ha generato una mappa colorata della pelle vascolarizzata dal...
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Discussione
Questo articolo descrive un lembo fasciocutaneo affidabile e riproducibile raccolto sugli arti posteriori dei suini. Seguendo questo protocollo chirurgico passo-passo sarà possibile l'approvvigionamento di due lembi su un solo animale in meno di 2 ore. Il passo più critico dell'intervento chirurgico è la scheletrizzazione del peduncolo vascolare all'interno delle fibre muscolari gracili, che richiede una dissezione approfondita da parte di un chirurgo esperto. Fissare la pelle alla fascia utilizzando suture cutanee è un ...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni Shriners Hospitals for Children #85127 (BEU e CLC) e #84702 (AA). Gli autori desiderano ringraziare la fondazione "Gueules Cassées" per il sostegno salariale ai borsisti coinvolti in quel progetto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Angiocatheter 18 G | BD Insyte Autoguard | 381409 | |
| Angiocatheter 20 G | BD Insyte Autoguard | 381411 | |
| pinza per tessuti Adson, 11 cm, 1 x 2 denti con piattaforma di legatura | ASSI | ASSI. | |
| Atropina solfato | AdvaCare | 212-868 | |
| Cordoni bipolari | ASSI | 228000C | |
| Buprenorfina HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| Pinze dilatatrici | Strumenti per la scienza fine (FST) | 18131-12 | |
| Tubo endotrachelico | Jorgensen Labs | JO615X | dimensioni da 6 a 15 mm a seconda del peso del maiale |
| Ethilon 3-0 16 mm 3/8 | Ethicon | MPVCP683H | |
| Euthasol | Virbac AH | 200-071 | |
| Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 unità/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Pinza bipolare per gioiellieri antiaderente 11 cm, punta dritta, diametro della punta di 0,25 mm | ASSI | ASSI. | |
| Forbici Metzenbaum 180 mm | B Braun | BC606R | |
| Microfil blu | Flow tech | LMV-120 | |
| Diluizione Microfil | Flow tech | LMV-112 | soluzione di limatura colorata |
| Coltello monopolare | ASSI | 221230C | |
| N° 15 lama bisturi | Swann Morton | NS11 | |
| Omnipaque | General Electric | 4080358 | prodotto a contrasto |
| Perma-Hand Silk 3-0 | Ethicon | A184H | |
| Small Ligaclip | Ethicon | MCM20 | |
| Stevens forbici 115 mm | B Braun | BC008R | |
| Telazol | Zoetis | 106-111 | |
| Xilamed (xilazina) | Bimeda | 200-529 |
Riferimenti
- Dubernard, J. M., et al. Human hand allograft: Report on first 6 months. The Lancet. 353 (9161), 1315-1320 (1999).
- Meningaud, J. P., et al. Procurement of total human face graft for allotransplantation: A preclinical study and the first clinical case. Plastic and Reconstructive Surgery. 126 (4), 1181-1190 (2010).
- Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: First US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: Long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388 (10052), London, England. 1398-1407 (2016).
- Derek, E., Dhanireddy, K. Immunosuppression. Current Opinion in Organ Transplantation. 17 (6), 616-618 (2012).
- Lantieri, L., et al. First human facial retransplantation: 30-month follow-up. Lancet. 396 (10264), London, England. 1758-1765 (2020).
- Kauke, M., et al. Full facial retransplantation in a female patient-Technical, immunologic, and clinical considerations. American Journal of Transplantation. 21 (10), 3472-3480 (2021).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. American Journal of Transplantation. 14 (2), 343-355 (2014).
- Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. The New England Journal of Medicine. 368 (19), 1850-1852 (2013).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Lupon, E., et al. Engineering Vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 9 (2), 66-76 (2001).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475(2013).
- Rosh, E. H., Vistnes, L. M., Ksander, G. A. The panniculus carnosus in the domestic pic. Plastic and Reconstructive Surgery. 59 (1), 94-97 (1977).
- Alessa, M. A., et al. Porcine as a training module for head and neck microvascular reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (139), e58104(2018).
- Minqiang, X., Jie, L., Dali, M., Lanhua, M. Transmidline abdominal skin flap model in pig: Refinements and advancements. Journal of Reconstructive Microsurgery. 28 (02), 111-118 (2012).
- Bodin, F., et al. Porcine model for free-flap breast reconstruction training. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 68 (10), 1402-1409 (2015).
- Kadono, K., Gruszynski, M., Azari, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Vascularized composite allotransplantation versus solid organ transplantation: Innate-adaptive immune interphase. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (6), 714-720 (2019).
- Kruit, A. S., et al. Rectus Abdominis flap replantation after 18 h hypothermic extracorporeal perfusion-A Porcine Model. Journal of Clinical Medicine. 10 (17), 3858(2021).
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Ristampe e permessi
