Questo protocollo descrive un metodo facile da usare per esaminare l'ossidazione del substrato monitorando la produzione di 14CO2 in vitro.
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Articolo metodologico
Valutazione dell'ossidazione del substrato energetico in vitro con 14INtrappolamento di CO 2
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri ospitano i macchinari per il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e la catena di trasporto degli elettroni (ETC), che generano adenosina trifosfato (ATP) per mantenere l'omeostasi energetica. Glucosio, acidi grassi e amminoacidi sono i principali substrati energetici che alimentano la respirazione mitocondriale nella maggior parte delle cellule somatiche. L'evidenza mostra che diversi tipi di cellule possono avere una netta preferenza per determinati substrati. Tuttavia, l'utilizzo del substrato da parte di varie cellule nello scheletro non è stato studiato in dettaglio. Inoltre, poiché il metabolismo cellulare è in sintonia con i cambiamenti fisiologici e fisiopatologici, le valutazioni dirette della dipendenza dal substrato nelle cellule scheletriche possono fornire importanti informazioni sulla patogenesi delle malattie ossee.
Il seguente protocollo si basa sul principio del rilascio di anidride carbonica dalle molecole del substrato dopo fosforilazione ossidativa. Utilizzando substrati contenenti atomi di carbonio marcati radioattivamente (14C), il metodo fornisce un saggio sensibile e facile da usare per il tasso di ossidazione del substrato in coltura cellulare. Un caso di studio con preosteoblasti calvariali primari rispetto a macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) dimostra un diverso utilizzo dei substrati principali tra i due tipi di cellule.
Introduzione
La fosforilazione ossidativa (OXPHOS) negli eucarioti è il processo attraverso il quale i nutrienti vengono scomposti all'interno dei mitocondri per rilasciare energia chimica sotto forma di ATP attraverso il consumo di ossigeno. Il catabolismo di vari substrati all'interno dei mitocondri attraverso il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) genera direttamente poche molecole di ATP, ma piuttosto immagazzina energia attraverso la riduzione dei portatori di elettroni nicotinamide adenina dinucleotide (NAD +) e flavina adenina dinucleotide (FAD +). I portatori ridotti vengono quindi ossidati da ETC situati sulla membrana interna dei mitocondri per ....
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Protocollo
L'uso di materiali radioattivi (RAM) richiede l'approvazione preventiva di un comitato di sicurezza designato presso ciascuna istituzione. Le RAM utilizzate in questo protocollo sono state approvate da Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) presso l'Università della Pennsylvania. L'uso di animali richiede l'approvazione preventiva da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'istituzione di origine. Il seguente studio è stato approvato dalla IACUC presso il Children's Hospital di Philadelphia.
1. Preparazione di soluzioni stock per 14substrati con etichetta C
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Risultati
In questo esempio, il metodo di intrappolamento della CO2 viene utilizzato per confrontare l'ossidazione del substrato da parte dei preosteoblasti calvariali primari rispetto ai BMM, che vengono spesso utilizzati rispettivamente per la differenziazione in vitro degli osteoblasti o degli osteoclasti. Dopo che le cellule primarie sono passate e coltivate in cMEMα durante la notte, in genere raggiungono l'80-90% della confluenza e mostrano la loro morfologia caratteristica. I preosteoblasti calvariali so.......
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Discussione
Il protocollo fornisce un metodo facile da usare per determinare il tasso di ossidazione dei principali substrati energetici. È un'alternativa più semplice ad altri protocolli che utilizzano palloni contenenti un pozzo centrale e ricoperti da tappi di gomma 14,15,16. Sebbene lo studio di esempio qui sia eseguito con coltura cellulare, il metodo può essere facilmente adattato per espianti tissutali o omogeneizzati tissutali conte.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione NIH R01 AR060456 (FL). Ringraziamo il Dr. Michael Robinson ed Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) per il loro generoso aiuto con il contatore di scintillazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m filtri | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Utilizzato per filtrare la soluzione BSA |
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociare le cellule da piastre per colture cellulari |
| Provette Eppendorf da 1,5 mL | PR1MA | PR MCT17 RB | Utilizzato per l'incubazione di reazione |
| Piastre da 10 cm | TPP | 93100 | Utilizzato per colture cellulari |
| Siringa da 10 mL | BD | 302995 | Utilizzato per lavare il midollo dalle ossa lunghe |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | Per la preparazione di terreni di coltura cellulare |
| 14C-glucosio | PerkinElmer | NEC042X050UC | Utilizzato per produrre terreni caldi |
| 14C-glutammina | PerkinElmer | NEC451050UC | Utilizzato per produrre terreni caldi |
| 14C-oleato | PerkinElmer | NEC317050UC | Utilizzato per realizzare terreni caldi |
| Ago da 23 G | BD | 305120 | Utilizzato per lavare il midollo dalle ossa lunghe Piastre a |
| 24 pozzetti | TPP | 92024 | Utilizzato per colture cellulari |
| 70 μ filtri cellulari m | MIDSCI | 70CELL | Utilizzato per filtrare il surnatante durante la digestione cavalleresca |
| Colorante Acridina Arancio/Propidio Ioduro (AO/PI) | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Colora le cellule vive per determinare la densità dei semi |
| Siero bovino Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Utilizzato per la coniugazione degli acidi grassi |
| Cellometro Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determinare il numero di cellule vitali | |
| Centrifuga | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Utilizzato per pellettare le cellule |
| Collagenasi di tipo II | Worthington | LS004176 | Dissociare le cellule dal tessuto |
| MEM alfa | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Utilizzato per creare terreni caldi personalizzati |
| Gibco | tamponato con fosfato di Dulbecco | 10010023 | Utilizzato per sciogliere e diluire i reagenti e lavare le stoviglie di coltura |
| Carta da filtro | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Trappole CO2 con idrossido di sodio |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | g7528 | Utilizzato per realizzare terreni personalizzati |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Trappole CO2 durante la coltura cellulare |
| L-carnitina | Sigma-Aldrich | C0283 | Integrato per l'ossidazione degli acidi grassi |
| L-Glutammina | Sigma-Aldrich | g3126 | Utilizzato per realizzare terreni personalizzati |
| MEM alfa | Thermo | A10490 | Terreno di coltura cellulare |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Utilizzato per sigillare le piastre di coltura cellulare |
| Penicillina-Streptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | Previene la contaminazione nelle colture cellulari |
| Acido perclorico | Sigma-Aldrich | 244252 | Rilascia CO2 durante il saggio metabolico |
| Piruvato | Sigma-Aldrich | p5280 | Utilizzato per realizzare terreni personalizzati |
| Contatore di scintillazione Beckman | Coulter | LS6500 | Determina la radioattività dalla carta da filtro |
| Fluido di scintillazione | MP Biomedicals | 882453 | Assorbe l'energia emessa dai RAM e la riemette sotto forma di lampi di luce |
| Fiala di scintillazione | Fisher Scientific | 03-337-1 | Contenitori di reazione per fluido di scintillazione |
| Carbonato di sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | Tampone di equilibrio per |
| idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 58045 | Intrappola CO2 durante il saggio metabolco |
| Oleato di | sodioSANTA CRUZ | SC-215879 | Preparazione di acidi grassi coniugati BSA |
| Filtrazione sottovuoto 1000 | TPP | 99950 | Filtro cMEMα |
Riferimenti
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
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Ristampe e permessi
