Microscopia confocale per misurare tre modalità di dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini surrenali

La fusione di membrana media molte funzioni biologiche, tra cui la trasmissione sinaptica, l'omeostasi della glicemia, la risposta immunitaria e l'ingresso virale ^1,2,3. L'esocitosi, che coinvolge la fusione delle vescicole sulla membrana plasmatica, rilascia neurotrasmettitori e ormoni per ottenere molte funzioni importanti, come le attività della rete neuronale. La fusione apre un poro per rilasciare il contenuto vescicolare, dopo di che il poro può chiudersi per recuperare la vescicola di fusione, che è chiamata kiss-and-run ^1,4. Sia l'apertura irreversibile che reversibile dei pori di fusione può essere misurata con registrazioni di capacità collegate a celle combinate con registrazioni di conduttanza dei pori di fusione di fusione di singole vescicole.

Questo è spesso interpretato come riflesso della fusione a collasso completo, che comporta la dilatazione della fusione fino all'appiattimento della vescicola di fusione, e il bacio e la corsa, che comporta l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, rispettivamente ^{5,6,7,8,9,10,11,12,13} . Recenti studi di imaging confocale e sted (STED) di emissioni confocali e stimolate in cellule cromaffini hanno osservato direttamente l'apertura e la chiusura dei pori di fusione (kiss-and-run, chiamata anche fusione ravvicinata), l'apertura dei pori di fusione che mantiene una forma Ω con un poro aperto per lungo tempo, definita fusione di soggiorno, e il restringimento della vescicola fondente fino a quando non si fonde completamente con la membrana plasmatica, che sostituisce la fusione della fusione delle vescicole con la membrana plasmatica^4, 8,14,15,16,17.

Nei neuroni, l'apertura e la chiusura dei pori di fusione sono state rilevate con l'imaging che mostra il rilascio di punti quantici precaricati in vescicole più grandi del poro di fusione e con misurazioni della conduttanza dei pori di fusione sulla faccia di rilascio dei terminali nervosi ^5,18,19. Le cellule cromaffini surrenali sono ampiamente utilizzate come modello per lo studio dell'eso- ed endocitosi^20,21. Sebbene le cellule cromaffini contengano grandi vescicole a nucleo denso, mentre le sinapsi contengono piccole vescicole sinaptiche, le proteine di esocitosi ed endocitosi nelle cellule cromaffini e nelle sinapsi sono abbastanza analoghe 10,11,12,20,21,22,23.

Qui, viene descritto un metodo per misurare queste tre modalità di fusione utilizzando un metodo di imaging confocale combinato con l'elettrofisiologia nelle cellule cromaffini surrenali bovine (Figura 1). Questo metodo prevede il caricamento di falsi neurotrasmettitori fluorescenti (FFN511) nelle vescicole per rilevare l'esocitosi; aggiunta di Atto 655 (A655) nella soluzione bagno per riempire il profilo a forma di Ω generato dalla fusione ed etichettatura della membrana plasmatica con il dominio PH della fosfolipasi C δ (PH), che si lega a PtdIns(4,5)P₂ alla membrana^{plasmatica 8,15,24}. La dinamica dei pori di fusione può essere rilevata attraverso cambiamenti in diverse intensità fluorescenti. Sebbene descritto per le cellule cromaffini, il principio di questo metodo qui descritto può essere applicato ampiamente a molte cellule secretorie ben oltre le cellule cromaffini.

NOTA: La procedura di utilizzo degli animali ha seguito le linee guida NIH ed è stata approvata dal NIH Animal Care and Use Committee.

1. Coltura cellulare cromaffini bovina

1. Preparare la soluzione di Locke (Tabella 1) e gli strumenti in autoclave 1 giorno prima della coltura cellulare del cromaffinino.
2. Ottenere ghiandole surrenali bovine da un mattatoio locale il giorno della coltura e tenerle immerse nella soluzione ghiacciata di Locke prima della dissezione.
   NOTA: Le ghiandole surrenali sono di 21-27 mesi, sano, Angus nero di entrambi i sessi (principalmente maschio) con peso corporeo di circa 1.400 libbre (~ 635 kg).
3. Preparare 30 mL (per 3 ghiandole surrenali) di soluzione enzimatica fresca contenente collagenasi P, inibitore della tripsina e albumina sierica bovina (Tabella 1) prima della dissezione e mantenerla a temperatura ambiente.
4. Scegli 3 ghiandole intatte senza tagli o sanguinamenti sulla superficie e rimuovi il tessuto adiposo con le forbici (Figura 1A). Lavare le ghiandole per perfusione con la soluzione di Locke fino a quando non esce sangue. Per raggiungere questo obiettivo, gonfiare la ghiandola attraverso la vena surrenale (Figura 1B) utilizzando una siringa da 30 ml attaccata con un filtro da 0,22 μm tutte le volte che è necessario²⁵.
   NOTA: Circa 150 ml di soluzione di Locke sono solitamente necessari per lavare 3 ghiandole.
5. Per la digestione, iniettare la soluzione enzimatica attraverso la vena surrenale utilizzando una siringa da 30 mL attaccata con un filtro da 0,22 μm fino a quando la ghiandola inizia a gonfiarsi. Quindi, lasciare le ghiandole a 37 °C per 10 minuti. Iniettare ancora una volta e lasciare le ghiandole a 37 °C per altri 10 minuti.
   NOTA: Sono necessari circa 30 ml di soluzione enzimatica per digerire 3 ghiandole.
6. Dopo la digestione, tagliare la ghiandola longitudinalmente dalla vena all'altra estremità con le forbici per aprire la ghiandola (Figura 1C). Isolare i midollo estrapolando il midollo bianco in una capsula di Petri di 10 cm contenente la soluzione di Locke.
   NOTA: Il confronto dell'interno della ghiandola prima e dopo la digestione è mostrato nella Figura 1C. I dettagli della digestione e dell'isolamento dei midollo sono riportati in precedenza^23,25.
7. Tagliare e tritare il midollo in piccoli pezzi con le forbici (Figura 1D). Filtrare la sospensione del midollo con una rete di nylon da 80-100 μm in un becher. Quindi trasferire il filtrato in un tubo conico da 50 ml per la centrifugazione a 48 × g, temperatura ambiente, per 3 minuti con decelerazione di 3.
   NOTA: La tritatura delle nippe di solito richiede ~ 10 minuti. Per ottenere una buona resa di cellule, i pezzi tritati devono essere molto piccoli, fino a quando non possono essere intrecciati.
8. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospescere il pellet cellulare con la soluzione di Locke mediante pipettaggio. Filtrare la sospensione cellulare con un filtro da 80-100 μm e centrifugare a 48 x g, temperatura ambiente, per 3 minuti con decelerazione di 3.
9. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 30 ml di terreno di coltura (Tabella 1). Determinare il numero di cellule utilizzando le camere di conteggio dell'emacitometro²⁵.

2. Trasfezione con elettroporazione

1. Trasferire 2,8 × 10⁶ celle in un tubo da 15 ml. Pellet le celle per centrifugazione a 48 × g per 2 min con decelerazione di 3. Aggiungere 100 μL di tampone di trasfezione (vedere la tabella dei materiali) fornita dal produttore al pellet cellulare, quindi aggiungere 2 μg del plasmide PH-mNG.
   NOTA: Il plasmide PH-mNG è stato creato sostituendo la proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) con mNG in PH-EGFP¹⁵ (vedere la tabella dei materiali).
2. Mescolare delicatamente la sospensione pipettando la soluzione su e giù e trasferire la miscela in una cuvetta elettroporatoria senza indugio (Figura 1E). Trasferire immediatamente la cuvetta all'elettroporatore (vedere la tabella dei materiali), selezionare il programma O-005 nell'elenco delle schermate e premere Invio per eseguire l'elettroporazione.
   NOTA: Preparare la sospensione cellulare per la trasfezione in una cappa di coltura cellulare. Non introdurre bolle d'aria nella sospensione durante la fase di miscelazione. Procedere al passaggio successivo senza indugio.
3. Dopo l'elettroporazione, aggiungere immediatamente 1,8 ml di mezzo alla cuvetta e mescolare delicatamente con un micropipetto dotato di una punta sterile. Quindi aggiungere 300 μL della sospensione delle celle elettroporate sopra il coverslip (vedi la tabella dei materiali) in ogni piatto, placcando 5-6 piatti in totale per una reazione di elettroporazione.
4. Trasferire con cura i piatti in un incubatore umidificato a 37 °C con il 9% di CO₂ per 30 minuti e aggiungere delicatamente 2 ml di terreno preriscaldato a ciascun piatto dopo 30 minuti.
5. Mantenere le cellule trasfettate nell'incubatore umidificato a 37 °C con il 9% di CO₂ per 2-3 giorni prima dell'esperimento.
   NOTA: Le cellule coltivate dureranno per una settimana. È meglio usare cellule coltivate nei giorni 2-3.

3. Preparazione per la registrazione patch-clamp e l'imaging confocale

NOTA: Questo protocollo è stato eseguito con un microscopio confocale a scansione laser e un amplificatore patch-clamp con registrazione voltage-clamp insieme a un amplificatore lock-in per la registrazione della capacità. Un'immagine confocale del piano XY su un piano Z fisso (scansione_fissa XY / Z) è stata utilizzata per visualizzare tutti e tre i segnali fluorescenti contemporaneamente. Il piano Z era focalizzato sul fondo della cellula dove la membrana plasmatica stava aderendo alle coperture.

1. Il giorno dell'esperimento patch-clamp e imaging, osserva le cellule al microscopio a fluorescenza. Utilizzare brightfield per assicurarsi che la coltura cellulare non sia contaminata (Figura 1F) e l'epifluorescenza per verificare la corretta espressione della proteina con tag fluorescente.
   NOTA: Ad esempio, PH-mNG è espresso sulla membrana plasmatica di ~ 20-30% delle cellule.
2. Preparare pipette patch da capillari di vetro borosilicato. Per fare questo, tirare le pipette con un estrattore di pipette, rivestire le loro punte con cera liquida e lucidarle con una microforgia (vedere la Tabella dei materiali).
3. Accendere l'amplificatore di registrazione patch-clamp e avviare il software di registrazione patch-clamp (vedere la tabella dei materiali). Impostare i parametri appropriati per la registrazione della corrente di calcio e della capacità nel software (vedere la tabella dei materiali).
   1. Impostare un protocollo di registrazione di 60 s di durata totale, dove la stimolazione inizia a 10 s.
   2. Impostare il potenziale di tenuta per la registrazione del morsetto di tensione su -80 mV. Impostare una depolarizzazione di 1 s da -80 mV a 10 mV come stimolo per indurre l'afflusso di calcio e il salto di capacità.
   3. Per le misurazioni della capacità, impostare la frequenza dello stimolo sinusoidale su un intervallo di 1.000-1.500 Hz con una tensione da picco a picco non superiore a 50 mV.
4. Salvare il protocollo e creare un nuovo file per la registrazione.
5. Accendere il sistema di microscopio confocale e impostare i parametri appropriati nel software (vedere la Tabella dei materiali).
   1. Accendere i laser, inclusi 458 nm, 514 nm e 633 nm, e impostare l'intervallo di raccolta delle emissioni per ciascun laser in base a ciascuna sonda di fluorescenza come di seguito. FFN511: lunghezza d'onda di eccitazione (EX), 458 nm; lunghezza d'onda di emissione (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
   2. Utilizzare l'imaging sequenziale per FFN511 e mNG per evitare la diafonia tra queste due sonde. Impostare un timelapse della durata di 1 min per la registrazione delle immagini (Figura 1G).

4. Registrazione patch-clamp e imaging confocale

1. Scegli un piatto con un buon stato cellulare e una corretta espressione e aggiungi 2 μL di falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 (10 mM di stock, 1:1.000 soluzione di lavoro) nel mezzo. Rimettere il piatto nell'incubatrice per 20 minuti. In alternativa, caricare FFN511 dopo il passaggio 3.2 ed eseguire i passaggi 3.3-3.5 in attesa di risparmiare tempo.
2. Al termine del caricamento di FFN511, preparare la camera di registrazione e aggiungere 2 μL di colorante fluorescente A655 in 500 μL della soluzione da bagno (Figura 2A e Tabella 1). Trasferire il coperchio dal piatto nella camera di registrazione (vedere la tabella dei materiali) con una pinzetta e aggiungere immediatamente la soluzione da bagno contenente A655 (Figura 2B).
   NOTA: L'A655 viene mantenuto a -20 °C con concentrazione di 10 mM e la concentrazione di lavoro è di 40 μM.
   ATTENZIONE: Indossare guanti per evitare il contatto diretto con la pelle con FFN511 o A655.
3. Posizionare una goccia di olio (indice di rifrazione: 1,518; vedere la tabella dei materiali) sull'obiettivo di immersione dell'olio 100x (apertura numerica = 1,4). Montare la camera al microscopio e utilizzare la manopola di regolazione per fare in modo che l'olio entri in contatto con il fondo del coperchio, quindi immergere la punta del filo di terra nella soluzione del bagno (Figura 2C, D).
   NOTA: Scegliere un olio ad immersione adatto per lavorare a temperatura ambiente. Il passaggio tra l'obiettivo a basso e quello ad alto ingrandimento non è necessario. La temperatura ambiente viene mantenuta intorno ai 20-22 °C durante la registrazione.
4. Metti a fuoco le cellule e usa l'imaging a campo luminoso e confocale per trovare una buona cellula con espressione mNG. Eseguite lo zoom avanti sulla cella selezionata e regolatela al centro della vista per ridurre al minimo le aree vuote.
   NOTA: il disegno schematico dell'etichettatura a fluorescenza è mostrato nella Figura 3A. Una buona cellula di solito ha una membrana liscia e un bordo pulito (Figura 3B). Con l'epifluorescenza o l'imaging confocale, una buona cellula sembra avere un fondo grande e piatto con espressione mNG brillante (Figura 3C).
   La dimensione dei pixel è ~ 50 nm, all'interno di un intervallo di ~ 40-80 nm in base alle diverse dimensioni della cella e al fattore di zoom.
5. Impostare i parametri per l'imaging confocale del piano XY su un piano Z fisso (scansione_fissa XY/Z) di FFN511, PH-mNG e A655, con un intervallo di tempo ridotto al minimo. Regolare la messa a fuoco nella parte inferiore della cella con la manopola di regolazione fine.
   NOTA: PH-mNG segnala il contorno della membrana plasmatica cellulare alla sezione trasversale confocale del piano XY (ad eccezione del fondo cellulare). Vicino al fondo della membrana cellulare, si possono osservare macchie A655, che riflettono invaginazioni di membrana a forma di Ω o Λ. Se il piano focale Z è inferiore al fondo della cella, l'intensità di tutta la fluorescenza diventerà più debole.
6. Regolare la potenza del laser di eccitazione nel software per trovare un'impostazione per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore ed evitare significativi sbiancamenti a fluorescenza. Per fare ciò, iniziare con un valore di test iniziale di 2,5 mW di potenza per FFN511 eccitato a 458 nm e 1 mW per mNG eccitato a 514 nm. Per A655 eccitato a 633 nm con un laser HeNe, utilizzare un'elevata potenza laser, ~ 12-15 mW (cioè il 70% -80% del massimo), che, dopo l'eccitazione continua, può sbiancare tutti gli A655 fluorescenti all'interno di un profilo a forma di Ω quando il suo poro è chiuso.
   NOTA: se la potenza del laser è troppo elevata, la fluorescenza PH-mNG e FFN511 verrà sbiancata rapidamente. Se la potenza del laser è troppo bassa, i segnali saranno troppo deboli o rumorosi per essere analizzati.
7. Aggiungere 9 μL di soluzione interna (Tabella 1) in una pipetta patch e collegare la pipetta al supporto nello stadio amplificatore patch-clamp (vedere la Tabella dei materiali).
8. Applicare una piccola quantità di pressione positiva con una siringa e spostare la punta della pipetta per toccare la soluzione da bagno con un micromanipolatore. Assicurarsi che l'amplificatore mostri che la resistenza della pipetta è ~ 2-4 MΩ con un test di impulso di tensione. Premere LJ/Auto per annullare la giunzione del liquido.
9. Spostare la pipetta verso la cella selezionata con il micromanipolatore. Per formare una modalità collegata alla cella, spostare la punta della pipetta per toccare la cella (la resistenza aumenterà); applicando delicatamente la pressione negativa con la siringa (la resistenza aumenterà a più di 1 GΩ), modificare il potenziale di tenuta da 0 a -80 mV.
10. Una volta che la resistenza supera 1 GΩ, attendere ~ 30 s affinché la configurazione si stabilizzi. Premere C-fast/Auto per compensare la capacità veloce.
11. Per formare una modalità a cellula intera, applicare una pressione negativa pulsata breve ma potente con la siringa per rompere la membrana (la forma dell'impulso corrente cambia con un condensatore a membrana carico e scaricato). Premere C-slow/Auto per compensare la capacità lenta.
12. Regolare leggermente la messa a fuoco dell'immagine per mettere a fuoco il fondo della cella. Avviare contemporaneamente l'imaging timelapse confocale e la registrazione patch-clamp facendo clic contemporaneamente sui pulsanti Start nelle due diverse applicazioni software.
    NOTA: il software di imaging confocale crea un filmato ad una velocità di ~20-90 ms/fotogramma. La registrazione patch-clamp include lo stato di riposo per 10 s, la stimolazione di depolarizzazione 1 s e altri 49 s dopo la stimolazione. La configurazione patch-clamp consente la registrazione della corrente di calcio, del salto di capacità e del decadimento indotto dalla depolarizzazione di 1 s da -80 a +10 mV (Figura 3D).
13. Una volta terminata la registrazione, assicurati che i dati vengano salvati. Modificare il potenziale di mantenimento a 0 mV. Spostare la pipetta fuori dalla soluzione del bagno e scartarla.
14. Ripetere i passaggi 4.7-4.13 per registrare un'altra cella nel piatto. Dopo 1 ora di registrazione, passare a un altro piatto per la registrazione.
    NOTA: dopo 1 ora di registrazione, il tasso di successo della registrazione patch-clamp diminuisce in modo significativo. Per aumentare l'efficienza della raccolta dei dati, si consiglia la registrazione per solo 1 ora in ogni piatto.

5. Analisi dei dati patch-clamp

1. Aprire un software appropriato (vedere la Tabella dei materiali) per l'analisi dei dati. Fare clic sul | PPT Carica | file PULSE Pulsanti File per caricare il file .dat. Fai clic su Fallo e quattro tracce verranno tracciate automaticamente in un grafico, incluse le tracce di corrente di calcio e capacità.
2. Fare clic sul | Windows Nuovi pulsanti Grafico , scegliere il Pulse_1_1_1, la prima onda in Onda Y e fare clic su Esegui per tracciare il grafico corrente di calcio. Fare clic sul | Windows Pulsanti Nuova tabella , scegliere il Pulse_1_1_1 e fare clic su Esegui per visualizzare i dati grezzi della corrente di calcio, che potrebbero essere utilizzati per tracciare la traccia media di più celle.
3. Disegna un quadrato di conseguenza nel grafico della corrente di calcio, fai clic con il pulsante destro del mouse ed espandi il segnale corrente per includere la linea di base e il picco della corrente di calcio. Fai clic su Grafico | Mostra info per mostrare i cursori A e B e spostarli rispettivamente sulla linea di base e sul picco. Le informazioni del grafico saranno mostrate in basso e i parametri possono essere stimati.
4. Ripetete il passaggio 5.2, ma scegliete il Pulse_1_1_1_Cm, la seconda ondata in Onda Y, per tracciare la traccia di capacità. Ripetere il passaggio 5.3 e posizionare i cursori A e B nella posizione appropriata per misurare i parametri di capacità, ad esempio la linea di base, l'ampiezza e la velocità di decadimento.
5. Copiare i dati grezzi nel passaggio 5.2 in un foglio di calcolo, calcolare l'errore medio e standard della media per un gruppo di celle registrate e tracciare le tracce medie di corrente di calcio e capacità della membrana (Figura 3E) in un software appropriato.

6. Analisi dei dati di imaging confocale

1. Aprire i file di imaging grezzi con qualsiasi software fornito dal produttore (vedere la Tabella dei materiali).
   NOTA: Alcuni altri programmi gratuiti, come ImageJ o Fiji, potrebbero essere utilizzati per l'elaborazione dei dati e la quantificazione delle immagini ottenute nella sezione 4.
2. Fai clic su | processo ProcessTools e utilizzare gli strumenti per generare file di media mobile (ad esempio, rolling average per ogni 4 immagini) per ogni immagine timelapse e salvare tali file.
   NOTA: Dopo la media mobile, è possibile eseguire un'appropriata regolazione della luminosità e dello sfondo per mostrare meglio i cambiamenti di fluorescenza di tre canali, il che può aiutare a identificare gli eventi di fusione. Controllare l'intensità fluorescente in alcune regioni senza evento di fusione può aiutare a distinguere il segnale fluorescente degli eventi di fusione dai segnali di fondo.
3. Fai clic sui pulsanti Quantifica | Strumenti | Stack Profile, controlla i timepoint prima e dopo la stimolazione per identificare i cambiamenti di fluorescenza in ciascun canale. Fare clic sul pulsante Disegna ellisse per cerchiare le regioni di interesse (ROI) per gli eventi di fusione. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e fare clic su Salva ROI per salvare i ROI.
   NOTA: La dimensione del ROI, che copre tutti e tre i segnali fluorescenti, era simile alla dimensione delle vescicole nelle celle cromaffini²⁴. Per l'analisi sono stati utilizzati dati grezzi, mentre i dati di rolling averageaging che aumentano il rapporto segnale-rumore sono stati forniti per mostrare chiaramente i tre segnali.
4. Fare clic su Apri progetti per individuare il file raw, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e fare clic su Carica ROI per caricare il file ROI nei file di imaging raw per misurare le intensità di fluorescenza.
   NOTA: il segnale fluorescente grezzo verrà utilizzato per tracciare tracce di canali diversi. Per ogni ROI, la linea di base è definita come l'intensità prima della stimolazione e le tracce di intensità possono essere normalizzate alla linea di base.
5. Fare clic su Strumenti | Ordina i ROI nel software e traccia le tracce per tutti e tre i canali di ciascun ROI. Fare clic su Report per salvare i dati ROI, inclusi i dati digitali e le tracce di imaging per ogni ROI, in una cartella di file.
   1. Identificare un evento di fusione mediante l'aumento simultaneo dell'intensità della fluorescenza spot PH-mNG (F_PH) e_{A655 (F 655}) (all'interno di un singolo fotogramma), accompagnata da una diminuzione della fluorescenza spot FFN511 (F_FFN).
   2. Cerca l'aspetto di F_PH e F₆₅₅, che indica la formazione di spot PH-mNG/A655 a causa di un profilo Ω generato dalla fusione, consentendo la diffusione di PH-mNG dalla membrana plasmatica e la diffusione persistente di A655 dal bagno.
   3. Cerca la diminuzione di F_FFN , che indica il suo rilascio da una vescicola a causa dell'apertura dei pori di fusione ed esclude la possibilità che l'aspetto di F_PH e F₆₅₅ possa derivare dall'invaginazione della membrana causata dall'endocitosi.
   4. Ispezionare le immagini_fisse XY/Z timelapse che mostrano eventi di fusione che si verificano sul fondo della cella. Analizza tre modalità di eventi di fusione: 1) fusione ravvicinata, 2) fusione di permanenza e 3) fusione di restringimento.
      NOTA: gli eventi di fusione sono stati osservati raramente prima della depolarizzazione, mentre decine di eventi di fusione potrebbero essere osservati dopo la depolarizzazione. Dopo la fusione, il profilo Ω può chiudere i pori, mantenere i pori aperti o restringersi per fondersi nella membrana plasmatica.
      1. Per identificare la fusione ravvicinata, cercare l'oscuramento F₆₅₅ perché la chiusura dei pori di fusione impedisce lo scambio del bagno A655, mentre F_PH sostiene, riflettendo la continua conversione di PtdIns(4,5)P₂ in PtdIns(4)P, o F_PH decade con un ritardo, riflettendo il pizzicamento delle vescicole (close-fusion, Figura 4A,B).
      2. Cerca F_PH e F₆₅₅ sostenuti per identificare la fusione di soggiorno (Figura 4C).
      3. Cercare diminuzioni parallele di F_PH e F₆₅₅, indicando Ω restringimento del profilo per identificare la fusione di termoretrazione (Figura 4D).
         NOTA: controllare i file di imaging originali per ispezionare le tracce di imaging se non sono certi del tipo di evento. Il controllo dell'intensità fluorescente in alcune regioni senza evento di fusione può aiutare a distinguere il segnale fluorescente degli eventi di fusione dai segnali di fondo.
6. Traccia tracce rappresentative delle variazioni di intensità per questi tre canali: FFN511, PH-mNG e A655. Quantificare la percentuale di diversi modi di fusione in ogni cella e tracciare le figure.

Seguendo le procedure sperimentali mostrate in Figura 1 e Figura 2, le cellule cromaffini delle ghiandole surrenali bovine sono state trasfettate con PH-mNG per etichettare la membrana plasmatica; A655 è stato aggiunto alla soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione; e il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 è stato caricato in vescicole per il rilevamento del rilascio. Successivamente, l'imaging timelapse confocale del piano XY di FFN511, PH-mNG e A655 è stato eseguito ogni 20-90 ms sul fondo della cellula (piano focale Z ~ 100-200 nm sopra la membrana cellulare). La registrazione patch-clamp a cellula intera e l'applicazione di una depolarizzazione di 1 s da -80 a +10 mV è stata eseguita per evocare eso- ed endocitosi (Figura 3A-C). Questa depolarizzazione ha indotto una corrente di calcio verso l'interno, un salto di capacità che indica l'esocitosi e un decadimento della capacità dopo il salto che indica l'endocitosi (Figura 3D, E).

Con l'imagingfisso timelapse XY/Z sul fondo cellulare, molti eventi di fusione individuali sono stati osservati 8,24 dopo la depolarizzazione (Figura 4A), mentre rari eventi di fusione sono stati osservati prima della depolarizzazione. Gli eventi di fusione indotti dal protocollo di depolarizzazione 1 s sono stati identificati come diminuzione della fluorescenza spot FFN511 (FFFN) che riflette il rilascio di FFN511, accompagnata da FPH e aumento della fluorescenza spotA655 (F 655) che riflette la diffusione di PH-mNG e A655 dalla membrana plasmatica e dalla soluzione del bagno nella vescicola di fusione (il profilo Ω generato dalla fusione)15.

Dopo la fusione, il Ω-profilo generato dalla fusione delle vescicole con la membrana plasmatica può 1) chiudere il suo poro, chiamato fusione ravvicinata, 2) mantenere un poro di fusione aperto, chiamato fusione di soggiorno, o 3) restringersi per fondersi nella membrana plasmatica, chiamata fusione termoretraibile. La fusione ravvicinata è stata identificata come F655 dimming mentre FPH ha sostenuto o decaduto con un ritardo (Figura 4B). La fusione stay-fusion è stata rilevata come presenza sostenuta di spot PH-mNG e A655 (Figura 4C). La fusione termoretraibile è stata rilevata come decadimento parallelo FPH e F655 accompagnato da una riduzione parallela delle dimensioni dello spot PH-mNG e dello spot A655 (Figura 4D)8,15,16,24.

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale. (A, B) Le ghiandole surrenali bovine sono tagliate con forbici per rimuovere il tessuto adiposo (A), lavate con la soluzione di Locke e digerite attraverso la vena surrenale (B). (C) L'interno di una ghiandola surrenale senza digestione (a sinistra) o dopo una corretta digestione (a destra). (D) Dopo essere stati lavati e digeriti, i midollo vengono isolati e tritati in piccoli pezzi e le cellule cromaffini vengono separate dai midollo tritati dopo il filtraggio e la centrifugazione. (E) Le celle cromaffini sono elettroporate e placcate su coverslip per l'incubazione. (F) Nei giorni 2-3, controllare le cellule cromaffini al microscopio prima della sperimentazione. (G) Il campione cellulare è incorporato nella camera per la registrazione patch-clamp e l'imaging confocale. Le variazioni di corrente e capacità del calcio vengono registrate, amplificate e visualizzate sul monitor. I cambiamenti di fluorescenza al momento della stimolazione vengono rilevati e visualizzati sul monitor. Barre di scala = 40 mm (A), 20 mm (B-D), 20 μm (F). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Patch-clamp e configurazione confocale. (A) Il giorno della sperimentazione, le cellule cromaffini cresciute su coverslip vengono incubate con FFN511 per 20 min. Il colorante A655 viene aggiunto alla soluzione del bagno. (B) Le cellule cromaffini sul coperchio vengono trasferite in una camera di registrazione e la soluzione da bagno con A655 viene aggiunta alla camera. (C) Dopo aver aggiunto una goccia di olio sull'obiettivo di immersione in olio 100x, la camera viene montata sullo stadio di un microscopio confocale invertito. La punta del filo di terra è immersa nella soluzione del bagno. La pipetta viene portata in posizione dopo il caricamento con soluzione di pipetta e tenuta da un supporto per pipetta, che è fissato a un palco di testa. L'headstage è controllato da un micromanipolatore motorizzato. (D) Dopo aver trovato una buona cella, spostare la punta della pipetta nella soluzione da bagno con il micromanipolatore per avviare la registrazione del patch-clamp a cellula intera e l'imaging confocale. Barre di scala = 10 mm (A), 5 mm (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Registrazioni a morsetto di tensione a cella intera di correnti di calcio e variazioni di capacità indotte dalla depolarizzazione. (A) Disegno di configurazione delle celle cromaffini durante la registrazione del morsetto di tensione dell'intera cella. La cellula cromaffini è immersa in una soluzione bagnosa contenente A655 (rosso) e la membrana cellulare e le vescicole sono etichettate rispettivamente con PH-mNG (verde) e FFN511 (ciano). Questa immagine è stata modificata con il permesso di 24. (B) Un'immagine rappresentativa di una cellula cromaffini a patch-clamped osservata da brightfield. (C) Immagini rappresentative di PH-mNG (verde), A655 (rosso) e FFN511 (ciano) in una cella con una buona messa a fuoco all'impronta della cella. (D) Un esempio di variazioni di corrente e capacità del calcio indotte dalla depolarizzazione di 1 s da -80 a +10 mV. (E) Le tracce medie di correnti di calcio (ICa) e variazioni di capacità (Cm) raccolte da 20 cellule cromaffini. Questa immagine è stata modificata con il permesso di 26. Barre di scala = 5 μm (B, C). Abbreviazioni: ICa = corrente di calcio; Cm = capacità; Depol = depolarizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Visualizzazione degli eventi di fusione al microscopio confocale. (A) Molti punti di fusione possono essere rilevati con l'imaging confocale del piano XY di PH-mNG (verde), A655 (rosso) e FFN511 (ciano) sul fondo della cellula. La fusione è stata evocata da una depolarizzazione di 1 s da -80 a +10 mV (depol1s). Le macchie FFN sono state sottoposte a rilascio e fusione ravvicinata (cerchi). Vengono mostrate le immagini prima (-1 s) e dopo (+1 s e +10 s) la depolarizzazione. (B) Un esempio di fusione ravvicinata. (C) Un esempio di stay-fusion. (D) Un esempio di fusione termoretraibile. Questa immagine è stata modificata con il permesso di 24. Barre di scala = 1 μm (A), 0,5 μm (B-D). Abbreviazioni: Depol = depolarizzazione; F = intensità fluorescente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Dettagli riguardanti la composizione del mezzo culturale e le soluzioni.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.