Articolo metodologico

Microscopia confocale per misurare tre modalità di dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini surrenali

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DOI:

10.3791/63569

⸱

16 marzo 2022

 ,  ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive una tecnica di imaging confocale per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule cromaffini surrenali bovine. Queste modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l'apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione termoretraibile, che coinvolge il restringimento delle vescicole fuse.

Abstract

L'apertura e la chiusura dinamica dei pori di fusione mediano l'esocitosi e l'endocitosi e ne determinano la cinetica. Qui, è dimostrato in dettaglio come la microscopia confocale è stata utilizzata in combinazione con la registrazione patch-clamp per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule surrenali surrenali bovine di coltura primaria. Le tre modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l'apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione di restringimento, che comporta il restringimento del profilo a forma di Ω generato dalla fusione fino a quando non si fonde completamente sulla membrana plasmatica.

Per rilevare queste modalità di fusione, la membrana plasmatica è stata etichettata sovraesprimendo mNeonGreen attaccato al dominio PH della fosfolipasi C δ (PH-mNG), che si lega al fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) sul foglietto rivolto verso il citosol della membrana plasmatica; le vescicole sono state caricate con il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 per rilevare il rilascio di contenuto vescicolare; e Atto 655 è stato incluso nella soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione. Queste tre sonde fluorescenti sono state fotografate simultaneamente a ~ 20-90 ms per fotogramma in cellule cromaffini vive per rilevare l'apertura dei pori di fusione, il rilascio di contenuto, la chiusura dei pori di fusione e la fusione dei cambiamenti delle dimensioni delle vescicole. Il metodo di analisi è descritto per distinguere tre modalità di fusione da queste misurazioni di fluorescenza. Il metodo qui descritto può, in linea di principio, applicarsi a molte cellule secretorie oltre le cellule cromaffini.

Introduzione

La fusione di membrana media molte funzioni biologiche, tra cui la trasmissione sinaptica, l'omeostasi della glicemia, la risposta immunitaria e l'ingresso virale 1,2,3. L'esocitosi, che coinvolge la fusione delle vescicole sulla membrana plasmatica, rilascia neurotrasmettitori e ormoni per ottenere molte funzioni importanti, come le attività della rete neuronale. La fusione apre un poro per rilasciare il contenuto vescicolare, dopo di che il poro può chiudersi per recuperare la vescicola di fusione, che è chiamata kiss-and-run 1,4. Sia l'apertura irreversibile che reversibile dei pori di fusione può essere misurata con registrazioni di capacità collegate a celle combinate con registrazioni di conduttanza dei pori di fusione di fusione di singole vescicole.

Questo è spesso interpretato come riflesso della fusione a collasso completo, che comporta la dilatazione della fusione fino all'appiattimento della vescicola di fusione, e il bacio e la corsa, che comporta l'apertura e la chiusura dei pori di fusione, rispettivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Recenti studi di imaging confocale e sted (STED) di emissioni confocali e stimolate in cellule cromaffini hanno osservato direttamente l'apertura e la chiusura dei pori di fusione (kiss-and-run, chiamata anche fusione ravvicinata), l'apertura dei pori di fusione che mantiene una forma Ω con un poro aperto per lungo tempo, definita fusione di soggiorno, e il restringimento della vescicola fondente fino a quando non si fonde completamente con la membrana plasmatica, che sostituisce la fusione della fusione delle vescicole con la membrana plasmatica4, 8,14,15,16,17.

Nei neuroni, l'apertura e la chiusura dei pori di fusione sono state rilevate con l'imaging che mostra il rilascio di punti quantici precaricati in vescicole più grandi del poro di fusione e con misurazioni della conduttanza dei pori di fusione sulla faccia di rilascio dei terminali nervosi 5,18,19. Le cellule cromaffini surrenali sono ampiamente utilizzate come modello per lo studio dell'eso- ed endocitosi20,21. Sebbene le cellule cromaffini contengano grandi vescicole a nucleo denso, mentre le sinapsi contengono piccole vescicole sinaptiche, le proteine di esocitosi ed endocitosi nelle cellule cromaffini e nelle sinapsi sono abbastanza analoghe 10,11,12,20,21,22,23.

Qui, viene descritto un metodo per misurare queste tre modalità di fusione utilizzando un metodo di imaging confocale combinato con l'elettrofisiologia nelle cellule cromaffini surrenali bovine (Figura 1). Questo metodo prevede il caricamento di falsi neurotrasmettitori fluorescenti (FFN511) nelle vescicole per rilevare l'esocitosi; aggiunta di Atto 655 (A655) nella soluzione bagno per riempire il profilo a forma di Ω generato dalla fusione ed etichettatura della membrana plasmatica con il dominio PH della fosfolipasi C δ (PH), che si lega a PtdIns(4,5)P2 alla membranaplasmatica 8,15,24. La dinamica dei pori di fusione può essere rilevata attraverso cambiamenti in diverse intensità fluorescenti. Sebbene descritto per le cellule cromaffini, il principio di questo metodo qui descritto può essere applicato ampiamente a molte cellule secretorie ben oltre le cellule cromaffini.

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Protocollo

NOTA: La procedura di utilizzo degli animali ha seguito le linee guida NIH ed è stata approvata dal NIH Animal Care and Use Committee.

1. Coltura cellulare cromaffini bovina

  1. Preparare la soluzione di Locke (Tabella 1) e gli strumenti in autoclave 1 giorno prima della coltura cellulare del cromaffinino.
  2. Ottenere ghiandole surrenali bovine da un mattatoio locale il giorno della coltura e tenerle immerse nella soluzione ghiacciata di Locke prima della dissezione.
    NOTA: Le ghiandole surrenali sono di 21-27 mesi, sano, Angus nero di entrambi i sessi (principalmente maschio) con peso corporeo di circa 1.400 libbre (~ 635 kg).
  3. Preparare 30 mL (per 3 ghiandole surrenali) di soluzione enzimatica fresca contenente collagenasi P, inibitore della tripsina e albumina sierica bovina (Tabella 1) prima della dissezione e mantenerla a temperatura ambiente.
  4. Scegli 3 ghiandole intatte senza tagli o sanguinamenti sulla superficie e rimuovi il tessuto adiposo con le forbici (Figura 1A). Lavare le ghiandole per perfusione con la soluzione di Locke fino a quando non esce sangue. Per raggiungere questo obiettivo, gonfiare la ghiandola attraverso la vena surrenale (Figura 1B) utilizzando una siringa da 30 ml attaccata con un filtro da 0,22 μm tutte le volte che è necessario25.
    NOTA: Circa 150 ml di soluzione di Locke sono solitamente necessari per lavare 3 ghiandole.
  5. Per la digestione, iniettare la soluzione enzimatica attraverso la vena surrenale utilizzando una siringa da 30 mL attaccata con un filtro da 0,22 μm fino a quando la ghiandola inizia a gonfiarsi. Quindi, lasciare le ghiandole a 37 °C per 10 minuti. Iniettare ancora una volta e lasciare le ghiandole a 37 °C per altri 10 minuti.
    NOTA: Sono necessari circa 30 ml di soluzione enzimatica per digerire 3 ghiandole.
  6. Dopo la digestione, tagliare la ghiandola longitudinalmente dalla vena all'altra estremità con le forbici per aprire la ghiandola (Figura 1C). Isolare i midollo estrapolando il midollo bianco in una capsula di Petri di 10 cm contenente la soluzione di Locke.
    NOTA: Il confronto dell'interno della ghiandola prima e dopo la digestione è mostrato nella Figura 1C. I dettagli della digestione e dell'isolamento dei midollo sono riportati in precedenza23,25.
  7. Tagliare e tritare il midollo in piccoli pezzi con le forbici (Figura 1D). Filtrare la sospensione del midollo con una rete di nylon da 80-100 μm in un becher. Quindi trasferire il filtrato in un tubo conico da 50 ml per la centrifugazione a 48 × g, temperatura ambiente, per 3 minuti con decelerazione di 3.
    NOTA: La tritatura delle nippe di solito richiede ~ 10 minuti. Per ottenere una buona resa di cellule, i pezzi tritati devono essere molto piccoli, fino a quando non possono essere intrecciati.
  8. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospescere il pellet cellulare con la soluzione di Locke mediante pipettaggio. Filtrare la sospensione cellulare con un filtro da 80-100 μm e centrifugare a 48 x g, temperatura ambiente, per 3 minuti con decelerazione di 3.
  9. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet cellulare con 30 ml di terreno di coltura (Tabella 1). Determinare il numero di cellule utilizzando le camere di conteggio dell'emacitometro25.

2. Trasfezione con elettroporazione

  1. Trasferire 2,8 × 106 celle in un tubo da 15 ml. Pellet le celle per centrifugazione a 48 × g per 2 min con decelerazione di 3. Aggiungere 100 μL di tampone di trasfezione (vedere la tabella dei materiali) fornita dal produttore al pellet cellulare, quindi aggiungere 2 μg del plasmide PH-mNG.
    NOTA: Il plasmide PH-mNG è stato creato sostituendo la proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) con mNG in PH-EGFP15 (vedere la tabella dei materiali).
  2. Mescolare delicatamente la sospensione pipettando la soluzione su e giù e trasferire la miscela in una cuvetta elettroporatoria senza indugio (Figura 1E). Trasferire immediatamente la cuvetta all'elettroporatore (vedere la tabella dei materiali), selezionare il programma O-005 nell'elenco delle schermate e premere Invio per eseguire l'elettroporazione.
    NOTA: Preparare la sospensione cellulare per la trasfezione in una cappa di coltura cellulare. Non introdurre bolle d'aria nella sospensione durante la fase di miscelazione. Procedere al passaggio successivo senza indugio.
  3. Dopo l'elettroporazione, aggiungere immediatamente 1,8 ml di mezzo alla cuvetta e mescolare delicatamente con un micropipetto dotato di una punta sterile. Quindi aggiungere 300 μL della sospensione delle celle elettroporate sopra il coverslip (vedi la tabella dei materiali) in ogni piatto, placcando 5-6 piatti in totale per una reazione di elettroporazione.
  4. Trasferire con cura i piatti in un incubatore umidificato a 37 °C con il 9% di CO2 per 30 minuti e aggiungere delicatamente 2 ml di terreno preriscaldato a ciascun piatto dopo 30 minuti.
  5. Mantenere le cellule trasfettate nell'incubatore umidificato a 37 °C con il 9% di CO2 per 2-3 giorni prima dell'esperimento.
    NOTA: Le cellule coltivate dureranno per una settimana. È meglio usare cellule coltivate nei giorni 2-3.

3. Preparazione per la registrazione patch-clamp e l'imaging confocale

NOTA: Questo protocollo è stato eseguito con un microscopio confocale a scansione laser e un amplificatore patch-clamp con registrazione voltage-clamp insieme a un amplificatore lock-in per la registrazione della capacità. Un'immagine confocale del piano XY su un piano Z fisso (scansionefissa XY / Z) è stata utilizzata per visualizzare tutti e tre i segnali fluorescenti contemporaneamente. Il piano Z era focalizzato sul fondo della cellula dove la membrana plasmatica stava aderendo alle coperture.

  1. Il giorno dell'esperimento patch-clamp e imaging, osserva le cellule al microscopio a fluorescenza. Utilizzare brightfield per assicurarsi che la coltura cellulare non sia contaminata (Figura 1F) e l'epifluorescenza per verificare la corretta espressione della proteina con tag fluorescente.
    NOTA: Ad esempio, PH-mNG è espresso sulla membrana plasmatica di ~ 20-30% delle cellule.
  2. Preparare pipette patch da capillari di vetro borosilicato. Per fare questo, tirare le pipette con un estrattore di pipette, rivestire le loro punte con cera liquida e lucidarle con una microforgia (vedere la Tabella dei materiali).
  3. Accendere l'amplificatore di registrazione patch-clamp e avviare il software di registrazione patch-clamp (vedere la tabella dei materiali). Impostare i parametri appropriati per la registrazione della corrente di calcio e della capacità nel software (vedere la tabella dei materiali).
    1. Impostare un protocollo di registrazione di 60 s di durata totale, dove la stimolazione inizia a 10 s.
    2. Impostare il potenziale di tenuta per la registrazione del morsetto di tensione su -80 mV. Impostare una depolarizzazione di 1 s da -80 mV a 10 mV come stimolo per indurre l'afflusso di calcio e il salto di capacità.
    3. Per le misurazioni della capacità, impostare la frequenza dello stimolo sinusoidale su un intervallo di 1.000-1.500 Hz con una tensione da picco a picco non superiore a 50 mV.
  4. Salvare il protocollo e creare un nuovo file per la registrazione.
  5. Accendere il sistema di microscopio confocale e impostare i parametri appropriati nel software (vedere la Tabella dei materiali).
    1. Accendere i laser, inclusi 458 nm, 514 nm e 633 nm, e impostare l'intervallo di raccolta delle emissioni per ciascun laser in base a ciascuna sonda di fluorescenza come di seguito. FFN511: lunghezza d'onda di eccitazione (EX), 458 nm; lunghezza d'onda di emissione (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
    2. Utilizzare l'imaging sequenziale per FFN511 e mNG per evitare la diafonia tra queste due sonde. Impostare un timelapse della durata di 1 min per la registrazione delle immagini (Figura 1G).

4. Registrazione patch-clamp e imaging confocale

  1. Scegli un piatto con un buon stato cellulare e una corretta espressione e aggiungi 2 μL di falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 (10 mM di stock, 1:1.000 soluzione di lavoro) nel mezzo. Rimettere il piatto nell'incubatrice per 20 minuti. In alternativa, caricare FFN511 dopo il passaggio 3.2 ed eseguire i passaggi 3.3-3.5 in attesa di risparmiare tempo.
  2. Al termine del caricamento di FFN511, preparare la camera di registrazione e aggiungere 2 μL di colorante fluorescente A655 in 500 μL della soluzione da bagno (Figura 2A e Tabella 1). Trasferire il coperchio dal piatto nella camera di registrazione (vedere la tabella dei materiali) con una pinzetta e aggiungere immediatamente la soluzione da bagno contenente A655 (Figura 2B).
    NOTA: L'A655 viene mantenuto a -20 °C con concentrazione di 10 mM e la concentrazione di lavoro è di 40 μM.
    ATTENZIONE: Indossare guanti per evitare il contatto diretto con la pelle con FFN511 o A655.
  3. Posizionare una goccia di olio (indice di rifrazione: 1,518; vedere la tabella dei materiali) sull'obiettivo di immersione dell'olio 100x (apertura numerica = 1,4). Montare la camera al microscopio e utilizzare la manopola di regolazione per fare in modo che l'olio entri in contatto con il fondo del coperchio, quindi immergere la punta del filo di terra nella soluzione del bagno (Figura 2C, D).
    NOTA: Scegliere un olio ad immersione adatto per lavorare a temperatura ambiente. Il passaggio tra l'obiettivo a basso e quello ad alto ingrandimento non è necessario. La temperatura ambiente viene mantenuta intorno ai 20-22 °C durante la registrazione.
  4. Metti a fuoco le cellule e usa l'imaging a campo luminoso e confocale per trovare una buona cellula con espressione mNG. Eseguite lo zoom avanti sulla cella selezionata e regolatela al centro della vista per ridurre al minimo le aree vuote.
    NOTA: il disegno schematico dell'etichettatura a fluorescenza è mostrato nella Figura 3A. Una buona cellula di solito ha una membrana liscia e un bordo pulito (Figura 3B). Con l'epifluorescenza o l'imaging confocale, una buona cellula sembra avere un fondo grande e piatto con espressione mNG brillante (Figura 3C).
    La dimensione dei pixel è ~ 50 nm, all'interno di un intervallo di ~ 40-80 nm in base alle diverse dimensioni della cella e al fattore di zoom.
  5. Impostare i parametri per l'imaging confocale del piano XY su un piano Z fisso (scansionefissa XY/Z) di FFN511, PH-mNG e A655, con un intervallo di tempo ridotto al minimo. Regolare la messa a fuoco nella parte inferiore della cella con la manopola di regolazione fine.
    NOTA: PH-mNG segnala il contorno della membrana plasmatica cellulare alla sezione trasversale confocale del piano XY (ad eccezione del fondo cellulare). Vicino al fondo della membrana cellulare, si possono osservare macchie A655, che riflettono invaginazioni di membrana a forma di Ω o Λ. Se il piano focale Z è inferiore al fondo della cella, l'intensità di tutta la fluorescenza diventerà più debole.
  6. Regolare la potenza del laser di eccitazione nel software per trovare un'impostazione per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore ed evitare significativi sbiancamenti a fluorescenza. Per fare ciò, iniziare con un valore di test iniziale di 2,5 mW di potenza per FFN511 eccitato a 458 nm e 1 mW per mNG eccitato a 514 nm. Per A655 eccitato a 633 nm con un laser HeNe, utilizzare un'elevata potenza laser, ~ 12-15 mW (cioè il 70% -80% del massimo), che, dopo l'eccitazione continua, può sbiancare tutti gli A655 fluorescenti all'interno di un profilo a forma di Ω quando il suo poro è chiuso.
    NOTA: se la potenza del laser è troppo elevata, la fluorescenza PH-mNG e FFN511 verrà sbiancata rapidamente. Se la potenza del laser è troppo bassa, i segnali saranno troppo deboli o rumorosi per essere analizzati.
  7. Aggiungere 9 μL di soluzione interna (Tabella 1) in una pipetta patch e collegare la pipetta al supporto nello stadio amplificatore patch-clamp (vedere la Tabella dei materiali).
  8. Applicare una piccola quantità di pressione positiva con una siringa e spostare la punta della pipetta per toccare la soluzione da bagno con un micromanipolatore. Assicurarsi che l'amplificatore mostri che la resistenza della pipetta è ~ 2-4 MΩ con un test di impulso di tensione. Premere LJ/Auto per annullare la giunzione del liquido.
  9. Spostare la pipetta verso la cella selezionata con il micromanipolatore. Per formare una modalità collegata alla cella, spostare la punta della pipetta per toccare la cella (la resistenza aumenterà); applicando delicatamente la pressione negativa con la siringa (la resistenza aumenterà a più di 1 GΩ), modificare il potenziale di tenuta da 0 a -80 mV.
  10. Una volta che la resistenza supera 1 GΩ, attendere ~ 30 s affinché la configurazione si stabilizzi. Premere C-fast/Auto per compensare la capacità veloce.
  11. Per formare una modalità a cellula intera, applicare una pressione negativa pulsata breve ma potente con la siringa per rompere la membrana (la forma dell'impulso corrente cambia con un condensatore a membrana carico e scaricato). Premere C-slow/Auto per compensare la capacità lenta.
  12. Regolare leggermente la messa a fuoco dell'immagine per mettere a fuoco il fondo della cella. Avviare contemporaneamente l'imaging timelapse confocale e la registrazione patch-clamp facendo clic contemporaneamente sui pulsanti Start nelle due diverse applicazioni software.
    NOTA: il software di imaging confocale crea un filmato ad una velocità di ~20-90 ms/fotogramma. La registrazione patch-clamp include lo stato di riposo per 10 s, la stimolazione di depolarizzazione 1 s e altri 49 s dopo la stimolazione. La configurazione patch-clamp consente la registrazione della corrente di calcio, del salto di capacità e del decadimento indotto dalla depolarizzazione di 1 s da -80 a +10 mV (Figura 3D).
  13. Una volta terminata la registrazione, assicurati che i dati vengano salvati. Modificare il potenziale di mantenimento a 0 mV. Spostare la pipetta fuori dalla soluzione del bagno e scartarla.
  14. Ripetere i passaggi 4.7-4.13 per registrare un'altra cella nel piatto. Dopo 1 ora di registrazione, passare a un altro piatto per la registrazione.
    NOTA: dopo 1 ora di registrazione, il tasso di successo della registrazione patch-clamp diminuisce in modo significativo. Per aumentare l'efficienza della raccolta dei dati, si consiglia la registrazione per solo 1 ora in ogni piatto.

5. Analisi dei dati patch-clamp

  1. Aprire un software appropriato (vedere la Tabella dei materiali) per l'analisi dei dati. Fare clic sul | PPT Carica | file PULSE Pulsanti File per caricare il file .dat. Fai clic su Fallo e quattro tracce verranno tracciate automaticamente in un grafico, incluse le tracce di corrente di calcio e capacità.
  2. Fare clic sul | Windows Nuovi pulsanti Grafico , scegliere il Pulse_1_1_1, la prima onda in Onda Y e fare clic su Esegui per tracciare il grafico corrente di calcio. Fare clic sul | Windows Pulsanti Nuova tabella , scegliere il Pulse_1_1_1 e fare clic su Esegui per visualizzare i dati grezzi della corrente di calcio, che potrebbero essere utilizzati per tracciare la traccia media di più celle.
  3. Disegna un quadrato di conseguenza nel grafico della corrente di calcio, fai clic con il pulsante destro del mouse ed espandi il segnale corrente per includere la linea di base e il picco della corrente di calcio. Fai clic su Grafico | Mostra info per mostrare i cursori A e B e spostarli rispettivamente sulla linea di base e sul picco. Le informazioni del grafico saranno mostrate in basso e i parametri possono essere stimati.
  4. Ripetete il passaggio 5.2, ma scegliete il Pulse_1_1_1_Cm, la seconda ondata in Onda Y, per tracciare la traccia di capacità. Ripetere il passaggio 5.3 e posizionare i cursori A e B nella posizione appropriata per misurare i parametri di capacità, ad esempio la linea di base, l'ampiezza e la velocità di decadimento.
  5. Copiare i dati grezzi nel passaggio 5.2 in un foglio di calcolo, calcolare l'errore medio e standard della media per un gruppo di celle registrate e tracciare le tracce medie di corrente di calcio e capacità della membrana (Figura 3E) in un software appropriato.

6. Analisi dei dati di imaging confocale

  1. Aprire i file di imaging grezzi con qualsiasi software fornito dal produttore (vedere la Tabella dei materiali).
    NOTA: Alcuni altri programmi gratuiti, come ImageJ o Fiji, potrebbero essere utilizzati per l'elaborazione dei dati e la quantificazione delle immagini ottenute nella sezione 4.
  2. Fai clic su | processo ProcessTools e utilizzare gli strumenti per generare file di media mobile (ad esempio, rolling average per ogni 4 immagini) per ogni immagine timelapse e salvare tali file.
    NOTA: Dopo la media mobile, è possibile eseguire un'appropriata regolazione della luminosità e dello sfondo per mostrare meglio i cambiamenti di fluorescenza di tre canali, il che può aiutare a identificare gli eventi di fusione. Controllare l'intensità fluorescente in alcune regioni senza evento di fusione può aiutare a distinguere il segnale fluorescente degli eventi di fusione dai segnali di fondo.
  3. Fai clic sui pulsanti Quantifica | Strumenti | Stack Profile, controlla i timepoint prima e dopo la stimolazione per identificare i cambiamenti di fluorescenza in ciascun canale. Fare clic sul pulsante Disegna ellisse per cerchiare le regioni di interesse (ROI) per gli eventi di fusione. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e fare clic su Salva ROI per salvare i ROI.
    NOTA: La dimensione del ROI, che copre tutti e tre i segnali fluorescenti, era simile alla dimensione delle vescicole nelle celle cromaffini24. Per l'analisi sono stati utilizzati dati grezzi, mentre i dati di rolling averageaging che aumentano il rapporto segnale-rumore sono stati forniti per mostrare chiaramente i tre segnali.
  4. Fare clic su Apri progetti per individuare il file raw, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e fare clic su Carica ROI per caricare il file ROI nei file di imaging raw per misurare le intensità di fluorescenza.
    NOTA: il segnale fluorescente grezzo verrà utilizzato per tracciare tracce di canali diversi. Per ogni ROI, la linea di base è definita come l'intensità prima della stimolazione e le tracce di intensità possono essere normalizzate alla linea di base.
  5. Fare clic su Strumenti | Ordina i ROI nel software e traccia le tracce per tutti e tre i canali di ciascun ROI. Fare clic su Report per salvare i dati ROI, inclusi i dati digitali e le tracce di imaging per ogni ROI, in una cartella di file.
    1. Identificare un evento di fusione mediante l'aumento simultaneo dell'intensità della fluorescenza spot PH-mNG (FPH) eA655 (F 655) (all'interno di un singolo fotogramma), accompagnata da una diminuzione della fluorescenza spot FFN511 (FFFN).
    2. Cerca l'aspetto di FPH e F655, che indica la formazione di spot PH-mNG/A655 a causa di un profilo Ω generato dalla fusione, consentendo la diffusione di PH-mNG dalla membrana plasmatica e la diffusione persistente di A655 dal bagno.
    3. Cerca la diminuzione di FFFN , che indica il suo rilascio da una vescicola a causa dell'apertura dei pori di fusione ed esclude la possibilità che l'aspetto di FPH e F655 possa derivare dall'invaginazione della membrana causata dall'endocitosi.
    4. Ispezionare le immaginifisse XY/Z timelapse che mostrano eventi di fusione che si verificano sul fondo della cella. Analizza tre modalità di eventi di fusione: 1) fusione ravvicinata, 2) fusione di permanenza e 3) fusione di restringimento.
      NOTA: gli eventi di fusione sono stati osservati raramente prima della depolarizzazione, mentre decine di eventi di fusione potrebbero essere osservati dopo la depolarizzazione. Dopo la fusione, il profilo Ω può chiudere i pori, mantenere i pori aperti o restringersi per fondersi nella membrana plasmatica.
      1. Per identificare la fusione ravvicinata, cercare l'oscuramento F655 perché la chiusura dei pori di fusione impedisce lo scambio del bagno A655, mentre FPH sostiene, riflettendo la continua conversione di PtdIns(4,5)P2 in PtdIns(4)P, o FPH decade con un ritardo, riflettendo il pizzicamento delle vescicole (close-fusion, Figura 4A,B).
      2. Cerca FPH e F655 sostenuti per identificare la fusione di soggiorno (Figura 4C).
      3. Cercare diminuzioni parallele di FPH e F655, indicando Ω restringimento del profilo per identificare la fusione di termoretrazione (Figura 4D).
        NOTA: controllare i file di imaging originali per ispezionare le tracce di imaging se non sono certi del tipo di evento. Il controllo dell'intensità fluorescente in alcune regioni senza evento di fusione può aiutare a distinguere il segnale fluorescente degli eventi di fusione dai segnali di fondo.
  6. Traccia tracce rappresentative delle variazioni di intensità per questi tre canali: FFN511, PH-mNG e A655. Quantificare la percentuale di diversi modi di fusione in ogni cella e tracciare le figure.

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Risultati

Seguendo le procedure sperimentali mostrate in Figura 1 e Figura 2, le cellule cromaffini delle ghiandole surrenali bovine sono state trasfettate con PH-mNG per etichettare la membrana plasmatica; A655 è stato aggiunto alla soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione; e il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 è stato caricato in vescicole per il rilevamento del rilascio. Successivamente, l'imaging timelapse confocale del piano XY di ...

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Discussione

Viene descritto un metodo di imaging microscopico confocale per rilevare la dinamica del rilascio dei pori di fusione e del trasmettitore, nonché tre modalità di fusione, fusione ravvicinata, fusione di permanenza e fusione di restringimento nelle cellule cromaffini surrenali bovine 4,24. Viene descritto un metodo elettrofisiologico per depolarizzare la cellula e quindi evocare l'eso- e l'endocitosi. L'elaborazione sistematica delle immagini confocali fornisce in...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i programmi di ricerca intramurale NINDS (ZIA NS003009-13 e ZIA NS003105-08) per aver sostenuto questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Adenosina 5'-trifosfato sale di magnesioSigmaA9187-500MGATP per la preparazione della soluzione interna
Atto 655ATTO-TEC GmbHAD 655-21Colorante Atto per etichettare la soluzione da bagno
Nucleofector di base per neuroni primariLonzaVSPI-1003Tampone di trasfezione per elettroporazione insieme al kit
Pipetta capillare in vetro BoroscilicateWarner Strumenti64-0795Parete standard con filamento OD=2,0 mm ID=1,16 mm Lunghezza=7,5 cm
Albumina sierica bovinaSigmaA2153-50GReagente per la digestione delle ghiandole
Cloruro di calcio 2 MQualità Biologica351-130-721Reagente per la preparazione della soluzione del bagno
Filtri cellulari, 100 &; mFalcon352360Materiale per filtrare la sospensione cellulare cromaffini
Soluzione di idrossido di cesioSigma232041Reagente per la preparazione della soluzione interna e del tampone madre Cs-glutammato/Cs-EGTA
Collagenasi PSigma11213873001Enzima per la digestione delle ghiandole
Vetrino coprioggettiNeuvitroGG-14-LamininaGG-14-Laminina, diametro 14 mm #1 spessore 60 pezzi Laminina vetrini coprioggetti tedeschi rivestiti
D-(+)-GlucosioSigmaG8270-1KGReagente per la preparazione di Locke' s soluzione e soluzione per il bagno
DMEMThermoFisher Scientific11885092Reagente per la preparazione del terreno di coltura
EGTASigma324626-25GMReagente per la preparazione del tampone madre Cs-EGTA per la soluzione del bagno
Elettroporazione e NucleofectorAmaxa BiosystemsNucleofector IITrasfetta i plasmidi in cellule
Siero fetale bovinoThermoFisher Scientific10082147Reagente per la preparazione del terreno di coltura
FFN511Abcamab120331Falso neurotrasmettitore fluorescente per marcare le vescicole
Guanosina 5'-trifosfato sale sodico idratoSigmaG8877-250MGGTP per la preparazione della soluzione interna
HEPESSigmaH3375-500GReagente per la preparazione di Locke'
Igor ProWaveMetricsIgor proSoftware per l'analisi patch-clamp e la presentazione dei dati di imaging
Software Leica Application Suite X SoftwareLeicaLAS X Softwareconfocale per la raccolta e l'analisi dei dati di imaging
Microscopio a scansione laser confocale Leica TCS SP5 MicroscopioLeicaTCS SP5per la raccolta
dei dati di imagingAcido L-glutammicoSigma49449-100GReagente per la preparazione del tampone stock Cs-glutammato per la soluzione del bagno
Amplificatore lock-inHekaSoftware Lock-inper la registrazione della capacità
Cloruro di magnesio 1 MQualità biologica351-033-721EAReagente per la preparazione della soluzione interna e della soluzione per il bagno
Ematocitometro metallizzato Hausser Bright-LineHausser Scientific3120Camera di conteggio
MicroforgeNarishigeMF-830Pipette polaccate per migliorare la formazione e la stabilità delle guarnizioni giga-ohm Unità
filtro siringa Millex-GP, 0,22 e micro; mMilliporeSLGPR33RBMateriale per il lavaggio e la digestione delle ghiandole
mNG(mNeonGreen)Allele BiotechnologyABP-FP-MNEONSBDima per la costruzione PH-mNeonGreen
Schermo filtrante in rete di nylon 100 micronEIKO filtrante co03-100/32Materiale per la sospensione del midollo filtrante
Patch clamp EPC-10HekaEPC-10Amplificatore per dati patch-clamp collezione
PH-EGFPAddgenePlasmide #51407Spina dorsale per PH-mNeonGreen
costruzione Estrattore di pipetteSutter StrumentoP-97Realizzare pipette per la registrazione patch-clamp
Cloruro di potassioSigmaP5404-500GReagente per la preparazione di Locke' s e la soluzione per il bagno
Software a impulsiHekaPulseper la raccolta dei dati patch-clamp
Camera di registrazioneWarner Instruments64-1943/QR-40LPcamera di vetrino coprioggetti, applicare pipetta patch-clamp su cellule vive
Cloruro di sodioSigmaS7653-1KGReagente per la preparazione di Locke' soluzione di s, soluzione di bagno e soluzione interna
Idrossido di sodioSigmaS5881-500GReagente per la preparazione di Locke' s soluzione
Sodio fosfato bibasicoSigmaS0876-500GReagente per la preparazione di Locke' s soluzione
Sodio fosfato monobasicoSigmaS8282-500GReagente per la preparazione di Locke' Piastra
riscaldante di agitazioneBarnsted/Thermolynetipo 10100Riscaldatore per il rivestimento di pipette con cera
Siringa, 30 mLBecton Dickinson302832Materiale per il lavaggio e la digestione delle ghiandole
Cloruro di tetraetilammonioSigmaT2265-100GTEA per la preparazione della soluzione per il bagno
Inibitore della tripsinaSigmaT9253-5GReagente per la digestione delle ghiandole
Tipo F Liquido da immersioneLeica195371-10-9Olio per montaggio confocale Leica
confocale Software

Riferimenti

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