La disregolazione proteomica svolge un ruolo importante nella diffusione dei gliomi diffusamente infiltranti, ma diverse proteine rilevanti rimangono non identificate. L'elaborazione spaziale digitale (DSP) offre un approccio efficiente e ad alto rendimento per caratterizzare l'espressione differenziale di proteine candidate che possono contribuire all'invasione e alla migrazione dei gliomi infiltrativi.
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Articolo metodologico
Profilazione spaziale digitale per la caratterizzazione del microambiente in gliomi diffusamente infiltranti di tipo adulto
In questo articolo
Sommario
Abstract
I gliomi diffusamente infiltranti sono associati ad elevata morbilità e mortalità a causa della natura infiltrativa della diffusione del tumore. Sono tumori morfologicamente complessi, con un alto grado di variabilità proteomica sia nel tumore stesso che nel suo microambiente eterogeneo. Il potenziale maligno di questi tumori è potenziato dalla disregolazione delle proteine coinvolte in diversi percorsi chiave, compresi i processi che mantengono la stabilità cellulare e preservano l'integrità strutturale del microambiente. Sebbene ci siano state numerose analisi di glioma bulk e monocellulari, c'è una relativa scarsità di stratificazione spaziale di questi dati proteomici. La comprensione delle differenze nella distribuzione spaziale dei fattori tumorigenici e delle popolazioni di cellule immunitarie tra il tumore intrinseco, il bordo invasivo e il microambiente offre preziose informazioni sui meccanismi alla base della proliferazione e della propagazione del tumore. La profilazione spaziale digitale (DSP) rappresenta una potente tecnologia che può costituire la base per queste importanti analisi multistrato.
DSP è un metodo che quantifica in modo efficiente l'espressione proteica all'interno di regioni spaziali specificate dall'utente in un campione di tessuto. La DSP è ideale per studiare l'espressione differenziale di più proteine all'interno e tra le regioni di distinzione, consentendo più livelli di analisi quantitativa e qualitativa. Il protocollo DSP è sistematico e facile da usare, consentendo un'analisi spaziale personalizzata dei dati proteomici. In questo esperimento, i microarray tissutali sono costruiti da biopsie del nucleo di glioblastoma archiviate. Successivamente, viene selezionato un pannello di anticorpi, mirando alle proteine di interesse all'interno del campione. Gli anticorpi, che sono preconiugati a oligonucleotidi del DNA fotoscisvivi UV, vengono quindi incubati con il campione di tessuto durante la notte. Sotto la visualizzazione al microscopio a fluorescenza degli anticorpi, le regioni di interesse (ROI) all'interno delle quali quantificare l'espressione proteica sono definite con i campioni. La luce UV viene quindi diretta ad ogni ROI, fendendo gli oligonucleotidi del DNA. Gli oligonucleotidi sono microaspirati e contati all'interno di ciascun ROI, quantificando la proteina corrispondente su base spaziale.
Introduzione
I gliomi diffusamente infiltranti sono il tipo più comune di tumore cerebrale maligno negli adulti e sono invariabilmente letali. La propensione delle cellule di glioma a migrare ampiamente nel cervello è una grande sfida terapeutica. Il meccanismo con cui si diffondono comporta la migrazione diretta e l'invasione incontrollata. Le cellule di glioma invasive hanno dimostrato di esibire tropismo e migrazione lungo i tratti di sostanza bianca1, con recenti ricerche che implicano la demielinizzazione di questi tratti come una caratteristica protumorigenica attiva2. L'invasione è mediata da una transizione epiteliale-mesench....
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Protocollo
Il protocollo descritto di seguito segue le linee guida del Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti i cui campioni di tessuto sono stati inclusi in questo studio. Vedere la sezione Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti, le apparecchiature e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione della diapositiva17
- Recuperare o preparare tessuto fissato in formalina, incorporato in paraffina da gliomi infiltranti diffusamente di tipo adulto umano.
NOTA: In questo....
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Risultati
La Figura 4 mostra i risultati rappresentativi di un esperimento DSP eseguito su campioni di glioblastoma. Viene presentata una mappa di calore, che illustra uno dei metodi con cui acquisire visivamente i dati utilizzando il software DSP. Le righe rappresentano i bersagli proteici e ogni colonna corrisponde a una regione di interesse. Una gamma di colori dal blu al rosso denota rispettivamente un'espressione da bassa ad alta. La variabilità del colore all'interno di una riga riflette l'etero.......
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Discussione
Data la diversità delle proteine che potrebbero potenzialmente influenzare l'aggressività dei gliomi e l'idea che molte di queste proteine rimangono sconosciute, un metodo di quantificazione delle proteine ad alto rendimento è un approccio tecnologico ideale. Inoltre, dato che i dati spaziali nei campioni oncologici sono spesso correlati con l'espressione differenziale18, incorporare la profilazione spaziale nell'approccio di quantificazione delle proteine consente un'analisi più efficace.
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il supporto del Laboratorio di genomica clinica e tecnologia avanzata nel Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio del Dartmouth Hitchcock Health System. Gli autori riconoscono anche la risorsa condivisa di patologia presso il Dartmouth Cancer Center con NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di rilevamento BOND Research Leica | Biosystems, Wetzlar, Germania | DS9455 | Sistema di rilevamento aperto contenente contenitori aperti in una vaschetta per reagenti |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germania | AR950 | Soluzione tampone concentrata 10X per il lavaggio di tessuti fissi |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | ||
| Abcam, Cambridge, Regno Unito | AB188287 | Kit di coniugazione di anticorpi fluorescenti Cy3 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | Sistema per l'imaging e la caratterizzazione di bersagli di proteine e RNA | |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Kit tampone per GeoMX DSP (inclusi tamponi per l'elaborazione e la preparazione dei campioni) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controlli per l'esecuzione di esperimenti GeoMX DSP |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Modulo proteico con bersagli per cellule immunitarie umane e bersagli immuno-oncologici |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Modulo proteico con bersagli per diversi tipi di tumore umano e per marcatori di transizione epitelio-mesenchimale |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Reagenti per la preparazione dei campioni per l'analisi delle proteine GeoMX DSP |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germania | contattare l'azienda | Coloratore IHC completamente automatizzato |
| Master Kit--12 reazioni | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materiali e reagenti per l'uso con il sistema di analisi |
| nCounter Sistema di analisi | nCounter NanoString, Seattle, WA | contattare l'azienda | Sistema automatizzato per la quantificazione dell'espressione target multiplex (da utilizzare con GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Ungheria | Per creare il blocco di microarray tissutale |
Riferimenti
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white ....
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Ristampe e permessi
