Articolo metodologico

Profilazione a livello di genoma delle interazioni di legame tra fattore di trascrizione e DNA in Candida albicans: un metodo CUT&RUN completo e un flusso di lavoro di analisi dei dati

DOI:

10.3791/63655

⸱

1 aprile 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, 4Health Sciences Research Institute, University of California, Merced

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un metodo sperimentale e un flusso di lavoro di analisi dei dati per la scissione sotto bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi (CUT & RUN) nel patogeno fungino umano Candida albicans.

Abstract

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I fattori di trascrizione regolatori controllano molti importanti processi biologici, tra cui la differenziazione cellulare, le risposte alle perturbazioni e agli stress ambientali e le interazioni ospite-patogeno. Determinare il legame genome-wide dei fattori di trascrizione regolatori al DNA è essenziale per comprendere la funzione dei fattori di trascrizione in questi processi biologici spesso complessi. La scissione sotto bersagli e il rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN) è un metodo moderno per la mappatura a livello di genoma delle interazioni di legame proteina-DNA in vivo che è un'alternativa interessante all'immunoprecipitazione della cromatina tradizionale e ampiamente utilizzata seguita dal metodo di sequenziamento (ChIP-seq). CUT&RUN è suscettibile di una configurazione sperimentale a throughput più elevato e ha una gamma dinamica sostanzialmente più elevata con costi di sequenziamento per campione inferiori rispetto a ChIP-seq. Qui, vengono descritti un protocollo CUT&RUN completo e un flusso di lavoro di analisi dei dati di accompagnamento su misura per l'analisi a livello di genoma delle interazioni di legame tra fattore di trascrizione e DNA nel patogeno fungino umano Candida albicans . Questo protocollo dettagliato include tutte le procedure sperimentali necessarie, dall'epitopo tagging dei geni codificanti il fattore di trascrizione alla preparazione della libreria per il sequenziamento; inoltre, include un flusso di lavoro computazionale personalizzato per l'analisi dei dati CUT&RUN.

Introduzione

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La Candida albicans è un patogeno fungino umano polimorfico clinicamente rilevante che esiste in una varietà di diverse modalità di crescita, come la modalità di crescita planctonica (fluttuante) e come comunità di cellule strettamente aderenti protette da una matrice extracellulare, nota come modalità di crescita del biofilm 1,2,3. Simile ad altri processi di sviluppo e cellulari, lo sviluppo del biofilm è un importante tratto di virulenza di C. albicans che è noto per essere controllato a livello trascrizionale da fattori di trascrizione regolatori (TF) ch....

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Protocollo

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1. Epitopo Tagging di ceppi di C. albicans

  1. Carica il gene di interesse, insieme alle sue sequenze di fiancheggiamento a monte e a valle di 1 kb, dal Candida Genome Database allo strumento di progettazione del primer (vedi la Tabella dei materiali). Progettare un RNA guida (gRNA) evidenziando 50 bp a monte e a valle del codone di arresto e fare clic sullo strumento di selezione del gRNA a destra. Selezionare Progetta e analizza guide. Utilizzare il genoma Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) e un motivo adiacente protospacer NGG (SpCas9, 3' side) pe....

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Risultati

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Questo robusto protocollo CUT&RUN è stato adattato e ottimizzato per studiare la localizzazione a livello di genoma di TF specifici in biofilm e colture planctoniche di C. albicans (vedere la Figura 2 per una panoramica dell'approccio sperimentale). È inoltre inclusa una pipeline di analisi dei dati approfondita per facilitare l'analisi dei dati di sequenziamento CUT&RUN risultanti e richiede agli utenti di avere competenze minime nella codifica o nella bioinformatica (veder.......

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Discussione

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Questo protocollo presenta una pipeline sperimentale e computazionale completa per la localizzazione a livello di genoma di TF regolatori in C. albicans. È progettato per essere altamente accessibile a chiunque abbia una formazione standard in microbiologia e biologia molecolare. Sfruttando l'elevata gamma dinamica e i bassi requisiti di input del campione del test CUT&RUN e includendo ottimizzazioni per la localizzazione delle interazioni di legame TF-DNA nel biofilm di C. albicans e nelle colture plan.......

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Dichiarazioni

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Clarissa J. Nobile è cofondatrice di BioSynesis, Inc., una società che sviluppa diagnostica e terapie per le infezioni da biofilm.

Ringraziamenti

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Ringraziamo tutti i membri passati e presenti dei laboratori Nobile ed Hernday per il feedback sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) numero di premio R35GM124594 e dalla famiglia Kamangar sotto forma di una cattedra dotata di C.J.N. Questo lavoro è stato supportato anche dal numero di premio del NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) R15AI137975 ad A.D.H.C.L.E. è stato supportato dal numero di borsa di studio del NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) F31DE028488. Il contenuto è di esclusiva responsabilità deg....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 μ Millipore SigmaSLGPM33RS
provette a bassa aderenza da 0,65 mLVWR490003-190
1 M CaCl2Fisher Scientific50-152-341
1 M PIPESFisher ScientificAAJ61224AK
piastre per colture cellulari non trattate a 12 pozzettiCorning351143
2-mercaptoetanoloSigma-Aldrich60-24-2
2% DigitoninFisher Scientific CHR103MI
50 mL provette conicheVWR89039-658
5x tampone HF phusionFisher ScientificF530SArticolo parte della DNA polimerasi ad alta fedeltà Phusion; indicato nel testo come "tampone DNA polimerasi"
AgarCriterionC5001
Perle magnetiche Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880
Bioanalizzatore AgilentAgilentG2939BA indicato nel testo come "strumento per elettroforesi capillare";
strisce di reazione Amplitube PCR dipendenti dall'utente con tappi attaccati, Simport ScientificVWR89133-910
Bacto peptoneBD Biosciences211677
Strumento di progettazione di primer per panchineBenchlinghttps://www.benchling.com/molecular-biology/; Indicato nel testo come "lo strumento di progettazione del primer"
BetaineFisher ScientificAAJ77507AB
Calcofluor macchia biancaSigma-Aldrich18909-100ML-F
Candida Genome Databasehttp://www.candidagenome.org/
Perle paramagnetiche coniugate Concanavalin A (ConA)Poliscienze  86057-3
Softwarehttps://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
arricciaturahttp://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT& Kit di esecuzioneEpicypher14-1048Indicato nel testo come "il CUT& Kit RUN"
Miscela di soluzioni di deossinucleotide (dNTP) (10 mM)New England BiolabsN0447S
Destrosio (D-glucosio)Fisher ScientificD163
Difco D-mannitolo  BD Biosciences217020
Cuvette monousoFisher Scientific14-955-127
Pipette di trasferimento monousoFisher Scientific13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)Fisher ScientificR0611
DreamTaq DNA polimerasi verdeFisher ScientificEP0713Indicato nel testo come "cPCR DNA polimerasi"
DreamTaq tampone DNA polimerasi verdeFisher ScientificEP0713Articolo parte della DNA polimerasi verde DreamTaq; indicato nel testo come "tampone DNA polimerasi cPCR"
E. coli spike-in DNAEpicypher18-1401
ELMI Incubatore per micropiastreELMITRMS-04Indicato nel testo come "incubatore per micropiastre"
End Prep MiscelaArticolo parte del NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit di preparazione
Prep Reaction BufferArticolo parte del NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit
Ethanol 200 proofVWR89125-170
FastDigest MssIFisher ScientificFD1344Indicato nel testo come "enzima di restrizione"
FastDigest MssI BufferFisher ScientificFD1344Articolo parte del kit FastDigest MssI; indicato nel testo come "tampone enzimatico di restrizione"
Ficoll 400Fisher BioReagentsBP525-25
Microscopio
elettroforesi su gel
GeneRuler scala DNA a basso rangeUser-dependent Fisher Scientific
flusso di lavoro
https://gitforwindows.org/ codicehttps://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5Boston BioProductsBBH-75-K
Centrifugadipendente dall'utente
Sigma-AldrichPX1830-4
Carta per lentiVWR52846-001
PotenziatoreArticolo parte del NEBNext Ultra II Kit di preparazione della libreria di DNA
Acetato di litio diidratoMP Biomedicals215525683
Living Colors Anticorpo policlonale GFP a lunghezza interaTakara632592MACS2
dipendente dall'utentehttps://pypi.org/project/MACS2/
Rack di separazione magnetica, provette da 0,2 mLEpicypher10-0008
Rack di separazione magnetica, provette da 1,5 mLFisher ScientificMR02
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Provette per microcentrifuga 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Micropiastra e cuvetta spettrofotometroBioTekEPOCH2TCindicato nel testo come "spettrofotometro"; dipendente dall'utente
MochiViewhttp://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPSSigma-AldrichM3183
NaClVWR470302-522
NaOHFisher ScientificS318-500
NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for IlluminaItem parte del NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); indicato nel testo come "Adapter"
NEBNext Index X Primer for IlluminaItem parte del NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); indicato nel testo come "Reverse UniqueIndex Library Primer di amplificazione"
NEBNext Multiplex Oligos per Illumina (Index Primers Set 1)New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kitNew England BiolabsE7645SIndicato nel testo come "kit di preparazione della libreria"
NEBNext Universal PCR Primer per IlluminaArticolo parte del NEBNext Multiplex Oligos per Illumina (Index Primers Set 1); indicato nel testo come "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin solfato (NAT)GoldbioN-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 pozzettiFisher ScientificEC62755BOX
Miscelatore nutanteVWR82007-202
Brodo nutrienteCriterioC6471
pADH110Addgene90982Indicato nel testo come "repository di plasmidi ID# 90982"
pADH119Addgene90985Indicato nel testo come "repository di plasmidi ID# 90985"
pADH137Addgene90986Indicato nel testo come "repository di plasmidi ID# 90986"
pADH139Addgene90987Indicato nel testo come "repository di plasmidi ID# 90987"
pADH140Addgene90988Indicato nel testo come "repository di plasmidi ID# 90988"
pAG-MNaseEpicypher15-1016 o 15-111650 rxn o 250 rxn
pCE1Addgene174434Indicato nel testo come "plasmid repository ID# 174434"
Piastre di Petri con coperchio trasparenteFisher ScientificFB0875712
Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltàFisher ScientificF530SIndicato nel testo come "DNA polimerasi"
Polietilenglicole (PEG) 3350VWR10791-816
Fosfato di potassio monobasicoFisher ScientificP285-500
Qubit 1x kit di test dsDNA HSInvitrogenQ33230
Qubitfluorimetro Life TechnologiesQ33216Indicato nel testo come "fluorimetro";
anticorpo di controllo negativo IgG di coniglioEpicypher13-0042
RNasi ASigma-Aldrich10109169001
Roche Inibitore completo della proteasi (senza EDTA) compresseSigma-Aldrich5056489001
RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
Incubatore a scuotimentoEppendorfM12820004dipendente dall'utente
Sigma-AldrichS1876-500G
Filtri per provette da centrifuga Spin-XFisher Scientific07-200-385
Anse di inoculazione steriliVWR30002-094
SYBR Gold colorante in gel per acidi nucleiciFisher ScientificS11494
Colorazione per acido nucleico SYTO 13Fisher ScientificS7575Indicato nel testo come "colorazione in gel per acido nucleico"
Thermocyclerdall'utente
ThermoMixer CEppendorf5382000023
Tris (idrossimetil) aminometanoSigma-Aldrich252859-100G
Ultra II Ligation Master MixArticolo parte del kit di preparazione della libreria DNA NEBNext Ultra II; indicato nel testo come "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master MixArticolo parte del NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; indicato nel testo come "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix"
di DNA di sperma di salmone UltraPureInvitrogen15632011
USER EnzymeArticolo parte del kit di preparazione della libreria DNA NEBNext Ultra II; indicato nel testo come "Enzima di escissione dell'uracil"
Miscelatore a vorticeVWR10153-834
strumentowget http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Estratto di lievitoCriterioC7341
Zimoliasi 100T (liticasi, enzima litico di lievito)Fisher ScientificNC0439194
Conda di enzimi End a fluorescenza Apparecchio per User-dependent FERSM1192 GitBash sorgente GitHub ad alta velocità Isopropanolo di legatura dipendente dall'utente Sorbitolo Termodipendente Soluzione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regula....

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CUT and Runlegame dei fattori di trascrizioneinterazioni proteina DNAtagging dell epitopopreparazione della libreriamicroscopia a fluorescenzaformazione del biofilm

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