L'esaurimento extracellulare del glucosio marcato fluorescentemente è correlato all'assorbimento del glucosio e potrebbe essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento dell'assorbimento del glucosio negli organi asportati e nelle colture cellulari.
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Articolo metodologico
Deplezione extracellulare di glucosio come misura indiretta dell'assorbimento di glucosio nelle cellule e nei tessuti Ex Vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'epidemia mondiale in corso di diabete aumenta la domanda per l'identificazione di fattori ambientali, nutrizionali, endocrini, genetici ed epigenetici che influenzano l'assorbimento del glucosio. La misurazione della fluorescenza intracellulare è un metodo ampiamente utilizzato per testare l'assorbimento di glucosio marcato fluorescentemente (FD-glucosio) nelle cellule in vitro o per l'imaging di tessuti che consumano glucosio in vivo. Questo test valuta l'assorbimento del glucosio in un punto temporale scelto. L'analisi intracellulare presuppone che il metabolismo del glucosio FD sia più lento di quello del glucosio endogeno, che partecipa alle reazioni cataboliche e anaboliche e alla segnalazione. Tuttavia, il metabolismo dinamico del glucosio altera anche i meccanismi di assorbimento, che richiederebbero misurazioni cinetiche dell'assorbimento del glucosio in risposta a diversi fattori. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio e convalida la sua correlazione con l'assorbimento intracellulare di FD-glucosio in cellule e tessuti ex vivo. La deplezione extracellulare del glucosio può essere potenzialmente applicabile per studi cinetici e dose-dipendenti ad alto rendimento, nonché per l'identificazione di composti con attività glicemica e dei loro effetti specifici per i tessuti.
Introduzione
La domanda di misurazione dell'assorbimento di glucosio aumenta insieme alla necessità critica di affrontare un aumento epidemico di una moltitudine di malattie dipendenti dal metabolismo del glucosio. I meccanismi alla base delle malattie metaboliche degenerative, dei disturbi neurologici e cognitivi1, delle malattie infiammatorie2 e infettive3, del cancro 4,5, così come dell'invecchiamento6, dipendono dal metabolismo del glucosio per l'energia e il suo stoccaggio, i processi anabolici, le proteine e la modificazione genica, la segnalazio....
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Protocollo
Gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Ohio State University (OSU, protocollo 2007A0262-R4).
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe II con il ventilatore acceso e le luci spente.
1. Preparazione dei materiali
NOTA: Tutti i materiali sono elencati nella Tabella dei materiali.
- Preparare il mezzo 1, il mezzo di centrifugazione 2 e le soluzioni di stoccaggio e di lavoro fluorescenti 2-deossi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-il) ammino]-....
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Risultati
L'assunzione intracellulare e la deplezione extracellulare di glucosio sono state misurate nei preadipociti 3T3-L1, in risposta a diverse concentrazioni di FD-glucosio (Figura 2) con e senza stimolazione insulinica. La Figura 2A mostra un aumento dose-dipendente dell'assorbimento intracellulare di FD-glucosio, che è stato significativamente aumentato in presenza di insulina. La concomitante diminuzione del fd-glucosio extracellulare nelle stesse cellule è mostra.......
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Discussione
Il confronto diretto della deplezione extracellulare di FD-glucosio con l'assorbimento di glucosio intracellulare normalizzato nella coltura cellulare ha mostrato un'alta correlazione, suggerendo che l'esaurimento extracellulare del glucosio potrebbe essere una misura surrogata per la valutazione dell'assorbimento del glucosio. La misurazione del glucosio FD extracellulare può utilizzare una vasta gamma di concentrazioni di glucosio FD, anche 0,5-2,5 μg FD-glucosio / mL sembrano fornire l'intervallo ottimale. Il glucosio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno problemi a rivelare e non hanno conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Il progetto è stato sostenuto da Ralph e Marian Falk Medical Research Catalyst Award e Kathleen Kelly Award. Altri supporti includevano il National Center for Research Resources UL1RR025755 e NCI P30CA16058 (OSUCCC), la roadmap NIH per la ricerca medica. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta le opinioni ufficiali del National Center for Research Resources o del NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibroblasti di topo 3T3-L1 | ATCC | CL-173 | Linea cellulare |
| Piastre a 96 pozzetti | Falcon | 353227 | Articoli in plastica |
| B6. Topi maschi V-Lepob/J | Jackson Laboratory | codice 000632 | Topi Lettore |
| micropiastre multimodale modulare BioTek Synergy H1 (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | Dispositivo B-SHT | |
| Siero bovino | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Coltura cellulare |
| Siero di vitello | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Coltura cellulare |
| Incubatore cellulare | Forma | Serie II Water Jacket | Device |
| Diet (dieta per topi/ratti, irradiata) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Reagente LifeScience | D2650-100mL | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Coltura cellulare |
| Etanolo | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagente |
| Fluorescente 2-deossi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzossadiazol-4-il) ammino]-D-glucosio) | Sigma | 72987-1MG | Test |
| DMEM senza glucosio e fenolo rosso DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Coltura cellulare |
| Insulina umana 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagente |
| Isoflurano, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestetico |
| Penicillina/streptomicina (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Coltura cellulare |
| Soluzione tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Coltura cellulare |
| Saggio delle proteine dell'acido bicinconnico (BCA) Pierce | Saggio ThermoFisher | Cat N23225 | |
| tampone per test di radioimmunoprecipitazione tampone per lisi | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Test |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Colture cellulari |
Riferimenti
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568(2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al.
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Ristampe e permessi
