Descriviamo un protocollo per l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e la loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico.
Articolo metodologico
Descriviamo un protocollo per l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano e la loro differenziazione nel lignaggio muscolare scheletrico.
L'esplorazione del potenziale terapeutico delle cellule staminali mesenchimali dipende dalla facilità di isolamento, dalla potenza verso la differenziazione e dall'affidabilità e dalla robustezza della fonte. Descriviamo qui un protocollo graduale per l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali dal tessuto del cordone ombelicale umano (uMSCs), la loro immunofenotipizzazione e la propagazione di tali colture su diversi passaggi. In questa procedura, la vitalità degli uMSC è elevata perché non vi è alcuna digestione enzimatica. Inoltre, la rimozione dei vasi sanguigni, comprese le arterie del cordone ombelicale e la vena, assicura che non vi sia contaminazione delle cellule di origine endoteliale. Utilizzando la citometria a flusso, le uMSC all'isolamento sono CD45−CD34−, indicando un'assenza di cellule dalla linea ematopoietica. È importante sottolineare che esprimono marcatori di superficie chiave, CD105, CD90 e CD73. Al momento della creazione di colture, questo documento descrive un metodo efficace per indurre la differenziazione in queste uMSC nel lignaggio del muscolo scheletrico. Un'analisi dettagliata della progressione miogenica nelle uMSC differenziate rivela che le uMSC esprimono Pax7, un marker per i progenitori miogeni nelle fasi iniziali della differenziazione, seguito dall'espressione di MyoD e Myf5 e, infine, un marcatore di differenziazione terminale, la catena pesante della miosina (MyHC).
Il cordone ombelicale umano è stato accreditato per possedere un robusto serbatoio di cellule staminali mesenchimali, che sono attualmente in fase di esplorazione per terapie rigenerative a causa dei loro robusti tassi di proliferazione e differenziazione, proprietà immunomodulatorie e capacità di generare cellule da tutti e tre gli strati germinali1. Il tessuto del cordone ombelicale è costituito da più compartimenti come il sangue del cordone ombelicale, il subendotelio della vena ombelicale e la gelatina di Wharton (WJ), che di per sé comprende tre regioni indistinte: la zona perivascolare, la zona intervascolare e il sub-amnione o il rivest....
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L'uso del tessuto del cordone ombelicale in questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la ricerca sulle cellule staminali (IC-SCR), dal Comitato etico istituzionale, dall'Istituto di scienza e tecnologia della salute traslazionale (IEC-THSTI), dal Comitato etico istituzionale dell'ospedale civile, Gurugram, Haryana e dal Comitato istituzionale per la biosicurezza, THSTI. Campioni di tessuto cordonale umano sono stati raccolti da parti a termine al momento della nascita. Il consenso scritto informato è stato ottenuto dai soggetti. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti.
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Il successo dell'isolamento delle uMSC dal tessuto del cordone ombelicale è >95%, a differenza degli scarsi tassi di successo del sangue del cordone ombelicale intero. Dopo aver isolato con successo le uMSC, l'analisi FACS rivela che tutte le cellule sono CD34−CD45−CD105+CD90+. Tuttavia, in analisi comparativa, le uMSC isolate dal sangue del cordone ombelicale mostrano popolazioni eterogenee, in cui una percentuale di cellule mostra CD34 + CD45 + CD105 .......
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Passaggi critici
Un passaggio critico in questo protocollo è la raccolta del tessuto in condizioni asettiche, dal momento della consegna al mantenimento di colture sterili, per l'intera durata della propagazione. Durante la raccolta del cavo, è essenziale che il cavo non tocchi alcuna superficie non sterilizzata e venga tamponato esternamente con etanolo al 70% prima della raccolta in tubi contenenti PBS integrati con antibiotici. È importante limitare il tempo tra la raccolta del cordone e l'elaboraz.......
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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamo il signor Ojas Tikoo per il loro aiuto con le riprese e la produzione video. Riconosciamo anche l'aiuto ricevuto dal personale GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), infermieri e funzionari di ricerca senior presso il Gurugram Civil Hospital e il Dr. Pallavi Kshetrapal per l'aiuto con la logistica. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni concesse a Suchitra Gopinath dal Dipartimento di Biotecnologie, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amfotericina B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Soluzione antibiotica 100x Liquido, testato per endotossine (10.000 U Penicillina e 10 mg di streptomicina/mL in soluzione fisiologica allo 0,9%) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anticorpo anti-GAPDH | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anticorpo anti-MyHC (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anticorpo anti-MyoD (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anticorpo anti-miogenina (clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anticorpo anti-Pax7 | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Clone CD90 anti-umano di topo 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagene di tipo 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucosio | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Desametasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II o FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Siero fetale bovino, qualificato Brasile | GIBCO | 10270106 | non essere inattivato |
| termicamente FITC Topo anti-umano Clone CD106 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Topo anti-umano CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Topo anti-umano CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Topo anti-umano CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Topo anti-umano CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Topo anti-umano CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Topo anti-umano CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Topo anti-umano HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Topo anti-umano IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicina | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Siero di cavallo | HiMedia | RM1239 | |
| Idrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminina | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modifica senza L-glutammina, ribo- e desossiribonucleosidi | Hyclone | SH30568. FS | Terreno basale per uMSCs |
| PE Topo anti-umano CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Topo anti-umano CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Topo anti-umano CD49E clone llA1 | BD Bioscience | 555617 | |
| PE PE Clone IgG anti-umano di topo G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Topo anti-umano CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH=7,4 | HiMedia | M1866 | |
| Soluzione di tripsina/EDTA (1x 0,25% di tripsina e 0,02% di EDTA in soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
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