Questo protocollo descrive l'analisi morfologica degli organoidi rettali (ROMA), un nuovo test diagnostico per la fibrosi cistica (FC). Le caratteristiche morfologiche, vale a dire la rotondità (indice di circolarità, CI) e la presenza di un lume (rapporto di intensità, IR), sono una misura della funzione CFTR. L'analisi di 189 soggetti ha mostrato una perfetta discriminazione tra FC e non CF.
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Articolo metodologico
Analisi della morfologia organoide rettale (ROMA): un saggio diagnostico nella fibrosi cistica
In questo articolo
Sommario
Abstract
La diagnosi di fibrosi cistica (FC) non è sempre semplice, specialmente quando la concentrazione di cloruro nel sudore è intermedia e/o possono essere identificate meno di due mutazioni CFTR che causano la malattia. I saggi fisiologici CFTR (differenza di potenziale nasale, misurazione della corrente intestinale) sono stati inclusi nell'algoritmo diagnostico, ma non sono sempre prontamente disponibili o fattibili (ad esempio, nei neonati). Gli organoidi rettali sono strutture 3D che crescono da cellule staminali isolate da cripte di una biopsia rettale quando coltivate in condizioni specifiche. Gli organoidi di soggetti non CF hanno una forma rotonda e un lume pieno di liquido, poiché il trasporto di cloruro mediato da CFTR guida l'acqua nel lume. Gli organoidi con funzione CFTR difettosa non si gonfiano, mantenendo una forma irregolare e non avendo lume visibile. Le differenze nella morfologia tra organoidi CF e non CF sono quantificate nell'"Analisi della morfologia degli organoidi rettali" (ROMA) come nuovo test fisiologico CFTR. Per il test ROMA, gli organoidi sono placcati in lastre a 96 pozzetti, colorati con calceina e ripresi in un microscopio confocale. Le differenze morfologiche sono quantificate utilizzando due indici: l'indice di circolarità (CI) quantifica la rotondità degli organoidi e il rapporto di intensità (IR) è una misura della presenza di un lume centrale. Gli organoidi non CF hanno un alto CI e un basso IR rispetto agli organoidi CF. Gli indici ROMA hanno perfettamente discriminato 167 soggetti con FC da 22 soggetti senza FC, rendendo ROMA un interessante test fisiologico CFTR per aiutare nella diagnosi di FC. Le biopsie rettali possono essere eseguite di routine a tutte le età nella maggior parte degli ospedali e il tessuto può essere inviato a un laboratorio centrale per la coltura di organoidi e ROMA. In futuro, ROMA potrebbe anche essere applicato per testare l'efficacia dei modulatori CFTR in vitro. Lo scopo del presente rapporto è quello di spiegare pienamente i metodi utilizzati per ROMA, per consentire la replica in altri laboratori.
Introduzione
La fibrosi cistica (FC) è una malattia autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene CFTR (Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). La proteina CFTR è un canale del cloruro e del bicarbonato, garantendo l'idratazione di diversi epiteli1. La FC è una malattia multisistemica ad alto carico, che accorcia la vita, che si manifesta principalmente come una malattia respiratoria, ma colpisce anche il tratto gastrointestinale, il pancreas, il fegato e il tratto riproduttivo2.
Le mutazioni di CFTR che causano malattie portano a una diminuzione della quantità o della funzione di CFT....
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Protocollo
Per tutte le procedure che coinvolgono tessuti umani, è stata ottenuta l'approvazione da parte del Comitato etico di ricerca UZ/KU Leuven (ricerca CE). Tutte le ricerche sono state eseguite con il consenso informato e / o l'assenso di genitori, rappresentanti e / o pazienti.
NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono biopsie rettali e organoidi devono essere eseguite in un flusso laminare per proteggere il ricercatore da qualsiasi pericolo biologico e per ridurre al minimo il rischio di contaminazione delle colture. Come per qualsiasi procedura di laboratorio, i ricercatori dovrebbero sempre indossare camici da laboratorio, guanti e occhiali ....
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Risultati
Gli organoidi di 212 soggetti sono stati raccolti durante le visite cliniche di routine. Non si sono verificati eventi avversi durante o dopo la procedura di biopsia rettale. Gli organoidi sono stati fotografati da un ricercatore in cieco alle caratteristiche del soggetto come il genotipo e le informazioni cliniche. A causa delle immagini di bassa qualità, sono stati esclusi 23 soggetti. Esempi di colture organoidi riuscite e fallite e acquisizione di immagini possono essere visti nella Figura 2
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Discussione
Forniamo un protocollo dettagliato per l'analisi della morfologia organoide rettale (ROMA). I due indici calcolati con ROMA, IR e CI, distinguevano gli organoidi dai soggetti con FC da quelli senza FC con perfetta precisione. ROMA potrebbe quindi funzionare come un nuovo test fisiologico CFTR complementare a SCC e ad altri test attualmente disponibili13,14,15.
Il protocollo dipende dall'uso di organoi.......
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Dichiarazioni
Questo studio è stato finanziato dall'associazione belga di pazienti FC "Mucovereniging/Association Muco", dalla borsa di ricerca della Società belga di pediatria BVK-SBP 2019 e da una sovvenzione del Fondo UZ Leuven per la ricerca biomedica traslazionale. Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Ringraziamo i pazienti e i genitori che hanno partecipato a questo studio. Ringraziamo Abida Bibi per tutto il lavoro di coltura con gli organoidi. Ringraziamo Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz e Bernard Wenderickx per il supporto logistico. Ringraziamo anche la Mucovereniging/Association Muco, e in particolare Stefan Joris e Dr. Jan Vanleeuwe....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Sorenson | 17040 | |
| Provette coniche da 15 mL | VWR | 525-0605 | |
| Piastre da 24 pozzetti | Corning | 3526 | |
| Piastre da 96 pozzetti | Greiner | 655101 | |
| Microscopio a campo chiaro | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubatore | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Microscopio confocale | Zeiss | LSM 800 | |
| Cappa a flusso laminare | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Materiale per la coltura di organoidi come descritto nel precedente protocollo10 | |||
| Micropipette (20, 200 e 1000 µ L) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Excel 2019 MSO | Software per fogli di calcolo | |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Software di imaging Nikon | v.5.02.00 | |
| Puntali per pipette (20, 200 e 1000 &; micro; L) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| software Zeiss Zen Blue | Software di imaging | Zeiss | v2.6 |
Riferimenti
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal....
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Ristampe e permessi
