Articolo metodologico

Isolamento e identificazione di batteri resistenti agli antibiotici trasportati dall'acqua e caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici

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DOI:

10.3791/63934

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3 marzo 2023

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di batteri resistenti agli antibiotici dall'acqua e la caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici (ARG). L'uso di tecniche basate su colture e non basate su colture (analisi metagenomica) fornisce informazioni complete sulla diversità batterica totale e sul pool totale di diversi ARG presenti nelle acque dolci di Mumbai, in India.

Abstract

Lo sviluppo e la diffusione della resistenza agli antibiotici (AR) attraverso il microbiota associato ai corpi d'acqua dolce è una delle principali preoccupazioni per la salute globale. Nel presente studio, sono stati raccolti e analizzati campioni di acqua dolce rispetto alla diversità batterica totale e ai geni AR (ARG) utilizzando sia tecniche convenzionali basate sulla coltura che un approccio metagenomico indipendente dalla coltura ad alto rendimento. Questo articolo presenta un protocollo sistematico per l'enumerazione dei batteri coltivabili totali e resistenti agli antibiotici da campioni di acqua dolce e la determinazione della resistenza fenotipica e genotipica negli isolati coltivabili. Inoltre, riportiamo l'uso dell'intera analisi metagenomica del DNA metagenomico totale estratto dal campione di acqua dolce per l'identificazione della diversità batterica complessiva, compresi i batteri non coltivabili, e l'identificazione del pool totale di diversi ARG (resistoma) nel corpo idrico. Seguendo questi protocolli dettagliati, abbiamo osservato un elevato carico di batteri resistenti agli antibiotici nell'intervallo di 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU / ml. La maggior parte degli isolati erano resistenti ai molteplici antibiotici testati, tra cui cefotaxime, ampicillina, levofloxacina, cloramfenicolo, ceftriaxone, gentamicina, neomicina, trimetoprim e ciprofloxacina, con indici multipli di resistenza agli antibiotici (MAR) di ≥0,2, indicando alti livelli di resistenza negli isolati. Il sequenziamento dell'rRNA 16S ha identificato potenziali patogeni umani, come Klebsiella pneumoniae, e batteri opportunisti, come Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. e Aeromonas spp. La caratterizzazione molecolare degli isolati ha mostrato la presenza di vari ARG, quali blaTEM, blaCTX-M (β-lattamici), aadA, aac (6')-Ib (aminoglicosidi) e dfr1 (trimetoprims), confermata anche dall'analisi metagenomica del DNA. Nel DNA metagenomico è stata rilevata anche un'elevata prevalenza di altri ARG che codificano per le pompe di efflusso antibiotico - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lattamasi - SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, il gene cloramfenicolo acetiltransferasi catB10 e il gene di resistenza alla rifampicina rphB - . Con l'aiuto dei protocolli discussi in questo studio, abbiamo confermato la presenza di batteri MAR trasportati dall'acqua con diversi tratti fenotipici e genotipici dell'AR. Pertanto, l'analisi metagenomica del DNA completo può essere utilizzata come tecnica complementare alle tecniche convenzionali basate sulla coltura per determinare lo stato complessivo di AR di un corpo idrico.

Introduzione

La resistenza antimicrobica (AMR) è stata identificata come uno dei problemi globali più urgenti. La rapida evoluzione della resistenza antimicrobica e la sua diffusione a livello mondiale rappresentano una delle maggiori minacce per la salute umana e l'economia globale in termini di costi sanitari ad essa associati1. L'uso eccessivo e l'abuso di antibiotici hanno portato ad un aumento dell'AR. Ciò è stato evidenziato dalla pandemia di COVID-19, durante la quale il trattamento delle infezioni secondarie associate, in molti casi, è stato enormemente compromesso a causa della resistenza antimicrobica nei pazienti colpiti2. Oltre all'uso/abuso diretto di antibiotici da parte dell'uomo, l'uso eccessivo e improprio di antibiotici in agricoltura e zootecnia e il loro scarico improprio nell'ambiente, compresi i corpi idrici, costituiscono una delle principali preoccupazioni3. L'aumento di nuovi tratti di resistenza e resistenza multifarmaco nei batteri evidenzia urgentemente la necessità di una migliore comprensione dei fattori che portano allo sviluppo dell'AR e alla sua diffusione. Più batteri resistenti agli antibiotici, che spesso trasportano più geni AR (ARG) su elementi genetici mobili come i plasmidi, possono trasferire questi geni di resistenza a microrganismi non resistenti, compresi potenziali agenti patogeni umani, portando così alla comparsa di superbatteri che non sono trattabili anche con antibiotici di ultima istanza4. Questi molteplici batteri resistenti agli antibiotici, se presenti negli ecosistemi acquatici, possono entrare direttamente nell'intestino umano attraverso il consumo di alimenti contaminati a base d'acqua come pesci, granchi e molluschi. Studi precedenti hanno dimostrato che la diffusione dei batteri AR nei sistemi idrici presenti in natura può raggiungere anche altre riserve idriche, compresa l'acqua potabile, e, quindi, può entrare nella catena alimentare umana 5,6,7.

Lo scopo del presente studio è quello di fornire un protocollo completo utilizzando una combinazione di tecniche basate su colture e non basate su colture (analisi metagenomica completa) per ottenere informazioni complete sulla diversità batterica totale e sul pool totale di diversi ARG presenti in un corpo idrico a Mumbai, in India. Convenzionalmente, sono state utilizzate tecniche basate sulla coltura per studiare la diversità batterica nei corpi idrici. Poiché i microrganismi coltivabili costituiscono solo una piccola percentuale del microbiota totale in qualsiasi nicchia, per avere una migliore comprensione dello stato generale della diversità batterica e dei vari tratti resistenti prevalenti in qualsiasi campione, devono essere utilizzate in tandem varie tecniche basate sulla coltura e indipendenti dalla coltura. Una di queste tecniche robuste e affidabili indipendenti dalla coltura è l'analisi del DNA metagenomico completo. Questo metodo ad alto rendimento è stato utilizzato con successo in vari studi sulla diversità batterica o nelle annotazioni funzionali di vari ARG 8,9. Questa tecnica utilizza il metagenoma (il materiale genetico totale in un campione) come materiale di partenza per varie analisi e, quindi, è indipendente dalla coltura. I protocolli del presente studio possono essere utilizzati per l'analisi dell'intero DNA metagenomico per ottenere informazioni sulla diversità batterica totale e vari ARG (resistoma) in campioni di acqua.

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Protocollo

1. Raccolta ed elaborazione dei campioni

  1. Raccolta di campioni
    1. Raccogliere il volume appropriato del campione d'acqua in contenitori sterili, assicurandosi che non siano riempiti più di 3/4 del contenitore.
    2. Trasportare i campioni in laboratorio in condizioni asettiche il più presto possibile dopo la raccolta e trattarli immediatamente.
  2. Elaborazione dei campioni
    1. Filtrare asetticamente il campione d'acqua attraverso un panno di mussola sterile per rimuovere qualsiasi particella.
    2. Effettuare adeguate diluizioni seriali dell'acqua filtrata per ulteriori analisi.

2. Stima della carica batterica totale e del conteggio dei batteri resistenti agli antibiotici

  1. Determinazione della carica batterica totale
    1. Sospendere 18,12 g di Agar R2A, polvere modificata in 1.000 ml di acqua bidistillata e sciogliere la miscela riscaldando. Autoclavare la miscela disciolta a 121 °C, 15 psi per 20 min. Preparare le piastre R2A Agar, Modified versando la quantità appropriata della miscela autoclavata in piastre di Petri sterili (ad esempio, aggiungere circa 20 ml di terreno sterile autoclavato a una piastra di Petri sterile di 90 mm).
    2. Distribuire uniformemente 100 μL delle diluizioni appropriate del campione di acqua filtrata sulla piastra R2A Agar, modificata una volta che il mezzo si solidifica. Esegui l'esperimento in duplicato.
    3. Incubare tutte le piastre di cui sopra a 35-37 °C per 48 h (variare la temperatura e il tempo di incubazione a seconda del mezzo utilizzato per l'isolamento).
    4. Esprimere la carica batterica totale in termini di unità formanti colonie per millilitro (CFU/ml) usando l'equazione (1):
      figure-protocol-1(1)
  2. Determinazione della carica batterica AR
    1. Seguire i passaggi 2.1.1-2.1.4. Tuttavia, invece di R2A Agar, piastre modificate, utilizzare R2A Agar, piastre modificate integrate individualmente con cinque diversi antibiotici, vale a dire cefotaxime (3 μg / mL), ciprofloxacina (0,5 μg / mL), eritromicina (20 μg / mL), kanamicina (15 μg / mL) e vancomicina (3 μg / mL).
    2. Aggiungere gli antibiotici separatamente in provette contenenti 20 mL di agar R2A fuso sterile, modificato (con la temperatura dell'agar R2A fuso, modificato a ≤40 °C) per ottenere la concentrazione finale di antibiotico come indicato al punto 2.2.1.
    3. Agitare per una miscelazione uniforme e versare su piastre di Petri sterili prima che l'agar si solidifichi. Esegui l'esperimento in duplicato.
    4. Incubare tutte le piastre di cui sopra a 35-37 °C per 48 h (se si utilizza un mezzo diverso, la temperatura e il tempo di incubazione possono variare).
    5. Per il controllo di qualità e la verifica dell'efficacia degli antibiotici, distribuire 100 μL di sospensioni batteriche dei ceppi di Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 29213 sui rispettivi ceppi di Agar R2A contenente antibiotici, piastre modificate (assicurarsi che la densità della coltura fresca utilizzata per l'inoculazione sia OD = 0,5 a 600 nm).
    6. Determinare la conta batterica resistente agli antibiotici in termini di CFU/ml come descritto al punto 2.1.4.
  3. Scorte di glicerolo degli isolati
    1. Selezionare colonie AR morfologicamente distinte.
    2. Sospendere una singola colonia isolata in 2 ml di brodo Luria-Bertani sterile contenente il rispettivo antibiotico (ad esempio, se una colonia è stata selezionata da una piastra contenente cefotaxime, inoculare la colonia dal punto 2.3.1 in brodo sterile di Luria-Bertani contenente cefotaxime alla rispettiva concentrazione).
    3. Incubare le provette inoculate a 37 °C a 80 giri/min fino a quando l'OD600 raggiunge 0,5.
    4. Preparare le scorte di glicerolo degli isolati mescolando 750 μL della sospensione di coltura dalla fase 2.3.3 in 250 μL di glicerolo sterile al 100% in condizioni asettiche.
    5. Conservare le scorte di glicerolo a -80 °C fino a ulteriori analisi.
      NOTA: Per la rinascita delle colture dalle scorte di glicerolo, scongelare le scorte di glicerolo a 4 °C. Inoculare un ciclo di questo stock in 2 ml di brodo Luria-Bertani sterile contenente il rispettivo antibiotico e lasciare crescere.

3. Identificazione di batteri coltivabili mediante sequenziamento del gene 16S rRNA

  1. Preparazione del modello di DNA dagli isolati per PCR
    NOTA: Il protocollo descritto per la preparazione del modello di DNA per la PCR per l'isolamento del DNA grezzo dai batteri è dato da Carlson et al.10.
    1. Usando uno stuzzicadenti sterile, prendi una singola colonia isolata e pura dell'isolato che cresce su una piastra di Petri. Sospendere la colonia batterica in 100 μL di acqua sterile bidistillata in una provetta sterile per microcentrifuga e far bollire per 10 minuti.
    2. Centrifugare la sospensione a 10.000 × g per 2 minuti per pellettare i detriti e trasferire il surnatante in una provetta di microcentrifuga sterile fresca da utilizzare come modello di DNA grezzo.
  2. Amplificazione PCR mirata della regione V3 del gene rRNA 16S e sequenziamento
    1. Preparare 40 μL della miscela di reazione in una provetta PCR per l'amplificazione della PCR, come indicato nella Tabella 1.
      NOTA: La preparazione del DNA deve essere effettuata su un blocco di ghiaccio riducendo al minimo la possibilità di contaminazione (indossare guanti durante la manipolazione dei reagenti e pulire accuratamente la superficie di lavoro con etanolo al 70%).
    2. Posizionare il tubo nel blocco termico ed eseguire il programma appropriato nel termociclatore PCR. Vedere la Tabella 2 per le condizioni di ciclo standardizzate della PCR e le informazioni di primer per l'amplificazione delle regioni V3 dei geni rRNA 16S.
    3. Per risolvere gli ampliconi e la visualizzazione, eseguire l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE). Mescolare 10 μL del prodotto PCR amplificato e 2 μL di tampone caricante gel 6x (Tabella 3) e caricare questa miscela in pozzetti su gel di agarosio all'1,5% (sciogliere 1,5 g di polvere di agarosio in 100 mL di 1x tampone TAE [Tabella 3]) contenente 5 μL di 10 mg/mL di bromuro di etidio (EtBr) ad una concentrazione finale di 0,5 μg/mL di EtBr in 100 mL di gel di agarosio.
      ATTENZIONE: EtBr è un potente cancerogeno. I guanti devono essere indossati in ogni momento durante la manipolazione di EtBr e gel contenenti EtBr.
    4. Aggiungi la scala del DNA per la stima della dimensione degli ampliconi.
    5. Effettuare l'elettroforesi del gel in un tampone serbatoio TAE a 80-100 V.
    6. Una volta che il colorante tracciante esegue 3/4 del gel, interrompere l'elettroforesi e visualizzare le bande di amplicone sotto un transilluminatore UV.
    7. Utilizzare il prodotto PCR (amplicone) per il sequenziamento del gene rRNA 16S per identificare l'isolato.
    8. Quantificare l'amplicone sottoponendolo ad analisi spettrofotometrica utilizzando l'equazione (2).
      figure-protocol-2(2)
    9. Per verificare la purezza del DNA, calcolare il rapporto A260/A280.
      NOTA: Idealmente, questo numero dovrebbe essere superiore a 1,5 e, preferibilmente, compreso tra 1,8 e 2,0.
    10. Per identificare gli isolati, confrontare le sequenze ottenute con i database di sequenze utilizzando uno strumento di ricerca di allineamento appropriato.

4. Rilevazione della resistenza agli antibiotici negli isolati mediante test di sensibilità agli antibiotici

NOTA: Questo protocollo descrive il metodo per i test di sensibilità agli antibiotici (AST) mediante diffusione del disco. Sono stati utilizzati i seguenti dischi antibiotici: cefotaxime (5 μg), ampicillina (10 μg), levofloxacina (5 μg), cloramfenicolo (30 μg), tigeciclina (15 μg), ceftriaxone (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicina (10 μg), neomicina (10 μg), trimetoprim (5 μg) e ciprofloxacina (5 μg).

  1. Preparazione dell'inoculo per l'AST
    1. Inocula asetticamente una singola colonia di AR purificata isolata utilizzando un'ansa sterile in 2 ml di un mezzo sterile non selettivo, come il brodo di Luria-Bertani (senza alcun antibiotico), e incubare a 37 °C a 80 giri/min durante la notte.
    2. Risospendere prelevando 100-150 μL della coltura coltivata durante la notte (approssimativamente, OD 600 = 1,8-2,0) in 2 ml di terreno di brodo fresco non selettivo Luria-Bertani e incubare per 2-4 ore (fino a quando l'OD600 raggiunge 0,4-0,5).
    3. Diluire questa sospensione di coltura appena coltivata utilizzando una soluzione salina sterile allo 0,85% in modo tale che la densità della coltura sia pari allo standard di 0,5 McFarland (approssimativamente, OD600 = 0,1), che corrisponde approssimativamente a 1-2 × 108 cellule / ml.
    4. Mescolare delicatamente la sospensione batterica per una distribuzione uniforme delle cellule.
    5. Utilizzare la sospensione di cui sopra entro 15 minuti dalla diluizione.
  2. Inoculo delle piastre di agar
    1. Preparare le piastre Mueller-Hinton Agar (MHA) per eseguire l'AST mescolando 38 g di MHA in 1.000 ml di acqua bidistillata e sciogliere la miscela riscaldando. Autoclavare la miscela disciolta a 121 °C, 15 psi per 15 min.
    2. Assicurarsi che la profondità di MHA nelle piastre sia di 4 mm (25 ml di terreno per piastra).
    3. Contemporaneamente, rimuovere i dischi di antibiotico dal congelatore e riscaldarli a temperatura ambiente.
      NOTA: I dischi antibiotici devono essere gradualmente scongelati scongelando inizialmente i dischi a 4 °C e successivamente a temperatura ambiente per ridurre qualsiasi potenziale pericolo di condensa sui dischi, che può successivamente influenzare la zona di inibizione (ZOI).
    4. In condizioni asettiche, immergere un batuffolo di cotone sterile nell'inoculo preparato al punto 4.1 e rimuovere la sospensione in eccesso per evitare un'eccessiva inoculazione delle piastre.
    5. Distribuire uniformemente la coltura sui piatti, partendo dalla parte superiore della piastra MHA e andando avanti e indietro da un bordo all'altro. Ruotare la piastra di 60° durante il tampone.
  3. Applicazione dei dischi antibiotici
    1. Con l'aiuto di una pinza sterilizzata a fiamma, trasferire asetticamente i dischi antibiotici sulle piastre MHA inoculate e premere delicatamente i dischi per garantire un contatto completo con l'agar.
      NOTA: Questa procedura deve essere eseguita entro 15 minuti dall'inoculazione della coltura sulle piastre.
    2. Posizionare il numero appropriato di dischi di antibiotico sulla piastra di agar tenendo conto dell'organismo, dell'antibiotico utilizzato e delle dimensioni della piastra per evitare sovrapposizioni delle zone di inibizione.
      NOTA: da quattro a cinque dischi possono essere alloggiati su una piastra circolare da 90 mm.
  4. Incubazione delle piastre
    1. Entro 15 minuti dall'applicazione dei dischi antibiotici, capovolgere le piastre e incubare a 37 °C durante la notte.
  5. Interpretazione dei risultati
    1. Misurare il diametro ZOI in millimetri (mm) e interpretare in base ai valori di breakpoint forniti da EUCAST11. Vedi i due esempi riportati di seguito.
      1. Il punto di rottura del diametro della zona (mm) per un disco antibiotico di ciprofloxacina (5 μg) per Enterobacterales è S ≥ 25 e R < 22, il che significa che è considerato sensibile (S) se ZOI ≥ 25 mm, mentre è resistente (R) se ZOI < 22 mm. Se il diametro ZOI scende tra 22 e 25, l'isolato è considerato intermedio (I).
      2. Il punto di rottura del diametro della zona (mm) per un disco antibiotico cloramfenicolo (30 μg) per Staphylococcus spp. è S ≥ 18 e R < 18, il che significa che è considerato sensibile se ZOI ≥ 18 mm, mentre è resistente se ZOI < 18 mm.
    2. Determinare l'indice di resistenza agli antibiotici multipli (MAR) trovando il rapporto tra il numero di antibiotici a cui l'isolato è resistente e il numero totale di antibiotici a cui l'isolato è esposto.
      NOTA: Per il controllo di qualità, E. coli ATCC 25922 e S. aureo Gli ATCC 29213 sono utilizzati come ceppi di riferimento seguendo il protocollo come nella fase 4.

5. Rilevazione basata sulla PCR di geni di resistenza agli antibiotici negli isolati

  1. Utilizzare un protocollo PCR standard per l'identificazione degli ARG negli isolati. Preparare il modello di DNA utilizzando il protocollo indicato al punto 3.1.
    NOTA: Le condizioni di ciclo della PCR utilizzate in questo studio erano 94 °C per 10 minuti, seguite da 35 cicli di 94 °C per 30 s, ricottura per 30 s alla temperatura appropriata (come standardizzato per ciascun set di primer), estensione a 72 °C per 40 s e estensione finale a 72 °C per 5 minuti. La miscela di reazione è descritta nella tabella 4. L'elenco degli ARG, dei primer e delle temperature di ricottura è riportato nella tabella 5.
  2. Per risolvere, visualizzare e verificare la purezza degli ampliconi, seguire i passaggi 3.2.3-3.2.10.

6. Analisi del DNA metagenomico integrale per l'identificazione della diversità batterica totale e la rilevazione di ARG nel metagenoma

  1. Estrazione del DNA totale (metagenoma) dal campione d'acqua
    1. Estrarre il DNA metagenomico dai campioni di acqua filtrata.
      NOTA: Nel presente studio, il DNA metagenomico (DNA totale) è stato estratto dai campioni di acqua filtrata utilizzando il kit di isolamento del DNA di riferimento seguendo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).
    2. Controllare la qualità del DNA caricando 3 μL del DNA metagenomico estratto su un gel di agarosio allo 0,8% e far scorrere il gel a 80-110 V per circa 30 minuti.
    3. Verificare la presenza di una singola banda intatta.
    4. Controllare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorometro.
  2. Determinazione della diversità batterica e rilevazione di ARG mediante sequenziamento dell'intero DNA metagenomico
    1. Preparazione della libreria e amplificazione PCR:
      1. Preparare una libreria di sequenziamento con estremità accoppiate utilizzando il kit di preparazione della libreria del DNA di riferimento (vedere la tabella dei materiali).
      2. Preparare il DNA per la legatura dell'adattatore prendendo 200 ng di DNA e tagliandolo meccanicamente in frammenti più piccoli, seguito da una fase continua di riparazione finale in cui viene aggiunta una "A" alle estremità 3'.
      3. A seconda della piattaforma utilizzata per il sequenziamento, applicare adattatori specifici a entrambe le estremità dei frammenti di DNA.
        NOTA: in questi adattatori sono presenti sequenze cruciali per l'associazione di librerie con doppio codice a barre a una cella di flusso per il sequenziamento. Ciò consente l'amplificazione PCR dei frammenti legati all'adattatore e il legame dei primer di sequenziamento standard.
      4. Per verificare la qualità e la quantità, analizzare la libreria amplificata utilizzando un chip DNA ad alta sensibilità secondo le istruzioni del produttore.
    2. Generazione e sequenziamento dei cluster:
      1. Caricare la libreria amplificata sulla piattaforma di sequenziazione appropriata per la generazione e la successiva sequenziazione dei cluster.
        NOTA: Le molecole di libreria si legano agli oligo adattatori complementari sulla cella di flusso accoppiata. Durante il sequenziamento, i filamenti anteriori vengono selettivamente scissi dopo la risintesi del filamento inverso. Questo filamento inverso copiato viene quindi sequenziato dall'estremità opposta del frammento.
    3. Analisi bioinformatica:
      1. Genera scaffold dai dati di alta qualità utilizzando la piattaforma appropriata.
      2. Sottoporre questi scaffold ad analisi bioinformatica per la classificazione tassonomica e l'identificazione degli ARG.
        NOTA: Il flusso di lavoro per l'analisi dell'intero DNA metagenomico per l'identificazione della diversità batterica totale e la rilevazione di ARG nel metagenoma è riportato nella Figura 1. Un foglio di flusso della metodologia completa descritta nel manoscritto è riportato nella Figura 2.

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Risultati

Carica batterica totale e conteggio dei batteri resistenti agli antibiotici (AR)
Il calcolo della carica batterica totale è stato effettuato diffondendo da 10−4 a 10−6 diluizioni dei campioni d'acqua su R2A Agar, mezzo modificato. Per l'enumerazione della conta dei batteri AR, sono state distribuite diluizioni da 10−3 a 10−6 volte su piastre contenenti antibiotici (Figura 3). I conteggi totali e dei batteri AR sono stati calcola...

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Discussione

La raccolta e l'elaborazione dei campioni svolgono un ruolo significativo e potrebbero influenzare i risultati e l'interpretazione dello studio. Pertanto, per escludere la variabilità nei campioni, è importante effettuare campionamenti in più punti del corpo d'acqua dolce studiato. Mantenere condizioni ambientali asettiche adeguate durante la manipolazione di tali campioni può prevenire la contaminazione. Inoltre, per evitare cambiamenti nella composizione batterica che possono influenzare la qualità e la quantità degli ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno interessi contrastanti da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da sovvenzioni finanziarie del Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme dell'Università di Mumbai. Devika Ghadigaonkar ha lavorato come Project Fellow nell'ambito del programma. Si riconosce l'aiuto tecnico fornito da Harshali Shinde, Senior Research Fellow presso il progetto n. del Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB): CRG/2018/003624.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Scala DNA 100 bpHimediaMBT049-50LNPer la stima delle dimensioni degli ampliconi
2x PCR Taq mastermixHiMediaMBT061-50RPer la preparazione di miscele di reazione PCR
37 gradi C IncubatoreGS-192, Gayatri ScientificNAPer l'incubazione dei batteri
6x Gel Loading BufferHiMediaML015-1MLColorante di caricamento e tracciamento che aiuta ad appesantire il campione di DNA e a monitorare l'andamento dell'elettroforesi
Polvere di agarosioHimediaMB229-50GPer la risoluzione degli ampliconi durante l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE)
Disco antibiotico per ampicillinaHiMediaSD002Per l'esecuzione
AST AutoclaveEquitronNANecessario per la sterilizzazione di terreni, lastre di vetro, provette, ecc
Bioanalizzatore 2100Agilent TechnologiesNAPer verificare la qualità e la quantità della libreria amplificata
Bisafety B2 CabinetIMSETIMSET BSC-Classe II Tipo B2Utilizzato per lavori microbiologici come la coltura batterica, AST ecc.
Disco antibiotico CefotaximeHiMediaSD295E-5VLPer l'esecuzione AST
Polvere antibiotica CefotaximeHiMediaTC352-5GPer la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento dei batteri resistenti agli antibiotici
Disco antibiotico CeftriaxoneHiMediaSD065Per l'esecuzione
centrifuga AST MinispinEppendorfMinispin Plus-5453Utilizzato per pellettare i detriti durante la preparazione del DNA grezzo
Disco antibiotico cloramfenicoloHiMediaSD006-5x50DSPer l'esecuzione
disco antibiotico AST ciprofloxacinaHiMediaSD060-5x50DSPer l'esecuzione
polvere antibiotica AST ciprofloxacinaHiMediaTC447-5GPer la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di antibiotici resistenti batteri
ColorimetroQuestNAPer il controllo dell'OD delle sospensioni di coltura Database
completo di resistenza agli antibiotici (CARD) databaseannotazione funzionale degli ARG; https://card.mcmaster.ca/
Incubatore per agitatore di raffreddamentoBTL41 Allied ScientificNAPer l'incubazione di piastre di terreno per la coltura di batteri
Congelatore (-40 ° C) HaierDW40L, Haier BiomedicalsPer la conservazione delle scorte di glicerolo
Kit di preparazione della libreria di DNANEB Next Kit di preparazione della libreria di DNA Ultra per IlluminaNAPreparazione della libreria di sequenziamento paired-end
EDTAHiMediaGRM1195-100GPer la preparazione del tampone di corsa in gel per l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE)
Apparecchio per elettroforesiTechResourceVassoiodi colata in gel da 15 cmPer fare il gel di agarosio ed eseguire l'elettroforesi 
Elettroforesi Alimentatore con elettrodiGeneiNAPer l'esecuzione dell'AGE 
Disco antibiotico per eritromicinaHiMediaSD222-5VLPer l'esecuzione di AST
Polvere antibiotica per eritromicinaHiMediaCMS528-1GPer la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di batteri resistenti agli antibiotici
Polvere antibiotica per eritromicinaHiMediaTC024-5GPer la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di batteri resistenti agli antibiotici batteri
Escherichia coli ATCC 25922       HiMedia0335X-1Utilizzato come controllo durante l'esecuzione dell'AST
Etidio BromuroHiMediaMB071-1GAgente intercalante e visualizzazione del DNA dopo l'elettroforesi sotto il sistema di documentazione su gel
FluorimetroQubit 2.0NAPer determinare la concentrazione del DNA metagenomico estratto
Sistema di documentazione su gelBioRadUtilizzato per la visualizzazione di ampliconi PCR dopo l'elettroforesi
Disco antibiotico per gentamicinaHiMediaSD170-5x50DSPer l'esecuzione di AST
Acido acetico glacialeHiMediaAS119-500MLPer la preparazione di tampone di corsa in gel per l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE)
GliceroloHiMediaGRM1027-500MLPer la produzione di scorte di glicerolo
Discoantibiotico ImipenemHiMediaSD073Per l'esecuzione di AST
Kaiju DatabaseNANA Perla classificazione tassonomica delle read; disco antibiotico https://kaiju.binf.ku.dk/
KanamicinaHiMediaSD017-5x50DSPer l'esecuzione di AST
Kanamicina antibiotica in polvereHiMediaMB105-5GPer la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di batteri resistenti agli antibiotici
Disco antibiotico LevofloxacinaHiMediaSD216-5VLPer l'esecuzione
AST Luria Bertani brodoHimediaM1245-500GPer l'arricchimento delle colture
McFarland StandardHimediaR092-1NoPer confrontare la densità della sospensione di coltura
Biologia molecolare acquaHiMediaTCL018-500MLPer la produzione di miscele
di reazioni PCRMueller-Hinton Agar (MHA)HiMediaM173-500GPer l'esecuzione di test di suscettibilità antibiotc (AST)
Disco antibiotico alla neomicinaHiMediaSD731-5x50DSPer l'esecuzione di AST
PCR Gradient Thermal CyclerEppendorfMastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz Utilizzato per eseguire la PCR per l'amplificazione della regione 16S rRNA e di vari geni di resistenza agli antibiotici
Inneschi XcelrisNAper l'amplificazione PCR 
R2A Agar,HiMediaM1743Per la preparazione di piastre di terreno per l'isolamento della carica batterica totale e resistente agli antibiotici (AR) Generazione di
scaffold CLCGenomics Workbench 6.0NAPer la generazione di scaffold
SequenziatorePiattaforma Illumina (2 x 150 bp chimica)NASequenziamento di libreria amplificata
Cloruro di sodio HiMediaTC046-500GPer la preparazione di soluzione salina allo 0,85% per la diluizione seriale del campione d'acqua
Kit di isolamento del DNA del suoloXcelgenNAPer l'estrazione dell'intero DNA metagenomico dal campione di acqua filtrata 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213HiMedia0365PUtilizzato come controllo durante l'esecuzione
classificazione tassonomicaKaiju ioinformatics toolNAPer la classificazione delle letture in diversi gruppi tassonomici dal phylum al livello di genere 
Il database completo di resistenza agli antibiotici (CARD)NANAPer l'annotazione funzionale degli ARG
Disco antibiotico tigeciclinaHiMediaSD278Per l'esecuzione
disco antibiotico AST TrimetoprimHiMediaSD039-5x50DSPer l'esecuzione della base AST
TrisHiMediaTC072-500GPer la preparazione del tampone di corsa Gel per il gel di agarosio Elettroforesi (AGE)
Polvere antibiotica vancomicinaHiMediaCMS217Per la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di batteri resistenti agli antibiotici
Bilancia di pesataMettler ToledoME204 Mettler ToledoUtilizzata per pesare polveri di fluidi, polveri reagenti, ecc.
NA - Non applicabile
di. della del delladi modificato della AST del

Riferimenti

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