Articolo metodologico

Anestesia e intubazione di cuccioli di topo preadolescenti per chirurgia cardiotoracica

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DOI:

10.3791/64004

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2 giugno 2022

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1Molecular Cardiology and Biophysics Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent’s Clinical School, University of New South Wales Sydney, 3Department of Anaesthesia, The Children’s Hospital at Westmead, 4School of Child and Adolescent Health, University of Sydney

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I modelli chirurgici cardiotoracici nei topi di età >7 giorni richiedono l'intubazione, ma questo è difficile per i cuccioli di topo preadolescenti (8-14 giorni) e ci sono poche informazioni sui regimi anestetici per l'intubazione. Qui, presentiamo regimi di dosaggio di ketamina / xilazina / atropina in cuccioli di topo C57BL / 6J di 10 giorni che consentono l'intubazione endotracheale, riducendo al minimo la mortalità animale.

Abstract

I modelli chirurgici murini svolgono un ruolo importante nella ricerca preclinica. Approfondimenti meccanicistici sulla rigenerazione miocardica dopo danno cardiaco possono essere ottenuti da modelli di chirurgia cardiotoracica in topi di 0-14 giorni, i cui cardiomiociti, a differenza di quelli degli adulti, mantengono la capacità proliferativa. I cuccioli di topo fino a 7 giorni sono efficacemente immobilizzati dall'ipotermia e non richiedono l'intubazione per la chirurgia cardiotoracica. I cuccioli di topo preadolescenti (8-14 giorni), tuttavia, richiedono l'intubazione, ma questo è impegnativo e ci sono poche informazioni sull'anestesia per facilitare l'intubazione. Qui, presentiamo regimi di dosaggio di ketamina / xilazina / atropina in cuccioli di topo C57BL / 6J di 10 giorni che consentono l'intubazione endotracheale, riducendo al minimo la mortalità animale. La titolazione empirica dei regimi di dosaggio di ketamina/xilazina/atropina al peso corporeo ha indicato che la risposta all'anestesia di cuccioli di topo di peso diverso era non lineare, per cui dosi di 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg e 50/6/0,18 mg/kg hanno facilitato l'intubazione di cuccioli di peso compreso tra 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) e 5,50-8,10 g (n = 20), rispettivamente. I cuccioli con peso corporeo inferiore richiedevano più tentativi di intubazione rispetto ai cuccioli più pesanti (p < 0,001). La sopravvivenza post-intubazione è correlata al peso corporeo (59%, 70% e 80% per i gruppi di basso, medio e alto peso, rispettivamente, R2 = 0,995). Per la chirurgia dell'infarto miocardico dopo l'intubazione, è stato indotto un piano chirurgico di anestesia con isoflurano al 4,5% in ossigeno al 100% e mantenuto con isoflurano al 2% in ossigeno al 100%. La sopravvivenza post-operatoria è stata simile per i tre gruppi di peso al 92%, 86% e 88% (p = 0,91). Insieme ai perfezionamenti nelle pratiche di manipolazione degli animali per l'intubazione e la chirurgia, e riducendo al minimo la cannibalizzazione da parte della madre post-operatoria, la sopravvivenza globale per l'intera procedura (intubazione più chirurgia) è correlata al peso corporeo (55%, 60% e 70% per i gruppi di basso, medio e alto peso, rispettivamente, R2 = 0,978). Data la difficoltà incontrata con l'intubazione di cuccioli di 10 giorni e l'elevata mortalità associata, raccomandiamo che la chirurgia cardiotoracica nei cuccioli di 10 giorni sia limitata ai cuccioli di peso di almeno 5,5 g.

Introduzione

I modelli murini sono strumenti preziosi nella ricerca cardiotoracica preclinica, in particolare per la facilità con cui possono essere generate linee di topo geneticamente modificate, e anche la facilità con cui i topi possono essere manipolati chirurgicamente per fornire modelli patologici di malattia per consentire, ad esempio, lo studio della rigenerazione miocardica dopo lesione cardiaca1 . A questo proposito, è interessante che, a differenza dei topi adulti in cui i cardiomiociti si sono ritirati dal ciclo cellulare, i cuori di topo neonatale di 0-2 giorni si riparano con cicatrici minime dopo resezione apicale o induzione di infarto miocardico 2,3,4. Al contrario, i cuori neonatali di 7 giorni si rigenerano in modo incompleto con una maggiore incidenza di cicatrici 2,3. Poiché i cardiomiociti all'apice del ventricolo sinistro mantengono la capacità proliferativa fino a 2 settimane dopo la nascita, gli studi meccanicistici sulla rigenerazione dopo lesione cardiaca nei topi di 0-14 giorni possono essere informativi per identificare obiettivi terapeutici per la rigenerazione del cuore adulto danneggiato5.

Lo sviluppo di modelli murini di lesioni cardiache comporta la manipolazione chirurgica in anestesia. Ciò richiede che il torace sia aperto per accedere al cuore, che generalmente richiede l'intubazione e la ventilazione meccanica. Lo sforzo del topo, il peso corporeo e l'età influenzano la sensibilità agli anestetici6. I topi adulti possono essere anestetizzati con una vasta gamma di agenti, un regime comune per l'intubazione è chetamina/xilazina/atropina a 100/13/0,5 mg/kg 6,7. I topi neonatali (0-7 giorni) mancano di un riflesso del dolore centralizzato e possono essere efficacemente immobilizzati sul ghiaccio e sottoposti a chirurgia senza intubazione 6,8,9. I cuccioli di topo preadolescenti (8-14 giorni) non possono essere anestetizzati con ipotermia 9,10; Richiedono l'intubazione per la chirurgia cardiotoracica. Non ci sono studi precedenti sulla chirurgia cardiotoracica in topi preadolescenti di età inferiore a 14 giorni. Nella nostra esperienza, l'intubazione di topi preadolescenti anestetizzati con isoflurano sotto i 14 giorni di età è difficile. Il regime anestetico iniettabile raccomandato riportato per i topi di età superiore ai 7 giorni è 50-150 mg/kg di ketamina e 5-10 mg/kg di xilazina10. I topi preadolescenti sono ancora in via di sviluppo neurologicamente e le loro risposte ai farmaci e al metabolismo dei farmaci sono molto diverse dagli animali adulti6. Ciò comporta un aumento del rischio di squilibrio di liquidi, elettroliti e acido-base, nonché ipoglicemia e ipotermia a causa non solo del loro alto tasso metabolico, che esaurisce rapidamente le loro limitate riserve di energia, ma anche a causa della loro immaturità termoregolatrice 6,11,12. Pertanto, ci sono poche informazioni sui regimi anestetici che facilitano l'intubazione e massimizzano la sopravvivenza dei topi preadolescenti.

Qui abbiamo titolato empiricamente regimi di dosaggio di ketamina / xilazina / atropina in cuccioli di topo C57BL / 6J di 10 giorni di peso compreso tra 3-8 g per ottenere un piano di anestesia sufficiente a consentire l'intubazione endotracheale per la successiva chirurgia cardiotoracica, riducendo al minimo la mortalità animale. Abbiamo anche perfezionato le pratiche di gestione degli animali per ridurre la mortalità da intubazione, chirurgia e cannibalismo materno post-chirurgico.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Garvan/St Vincent's Hospital Animal Ethics Committee in conformità con il Codice di condotta australiano per la cura e l'uso di animali per scopi scientifici e le linee guida ARRIVE, e tutti gli esperimenti sono stati eseguiti da un chirurgo esperto di piccoli animali (JW) con la guida di un anestesista pediatrico (JJS).

1. Preparazione degli strumenti

  1. Il giorno dell'intervento, installare attrezzature specializzate per l'intubazione di cuccioli di 10 giorni (Figura 1A, B). Ciò include una lampada riscaldante, una piattaforma di intubazione, luce a fibre ottiche, piccole pinze, un laringoscopio ricavato da un pezzo di filo di rame di 0,02 mm di diametro (60 mm di lunghezza con l'estremità del filo modellata in un cerchio di 3 mm di diametro con un angolo di 175°; Figura 1B) e una cannula endovenosa di plastica (e.v.) calibro 24, che viene utilizzata come tubo endotracheale.
  2. Assicurarsi che la cannula sia costituita da un tubo di plastica lungo 19 mm (OD 0,7 mm) collegato a un adattatore luer lock femmina di plastica da 21 mm (Figura 1B). Irrigidire il tubo della cannula inserendo un pezzo di filo di rame tramite l'adattatore luer lock. Utilizzare una cannula con un volume totale di 130 μL per un topo con volume corrente di ~8 μL/g13,14.

2. Anestesia di topi di 10 giorni

  1. Il giorno dell'intervento, rimuovere la diga da una gabbia di cuccioli C57BL/6J di 10 giorni e posizionare la gabbia su una piastra riscaldante (37 °C).
  2. Anestetizzare i cuccioli di 10 μL per g di iniezione intraperitoneale di peso corporeo utilizzando una siringa da insulina da 0,5 ml e un ago da 29 G con ketamina/xilazina/atropina nei rapporti dettagliati nella Tabella 1 per diversi gruppi di peso.
  3. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare il cucciolo in una camera di plexiglass riscaldata (37 °C) pre-ossigenata con ossigeno al 100%.

3. Intubazione di topi di 10 giorni

  1. Dopo 3-4 minuti di ossigenazione, trasferire il cucciolo su una piattaforma per l'intubazione essenzialmente come per i topi adulti. Eseguire questa operazione con il cucciolo in posizione supina (Figura 1C) o sospeso con un angolo di 45°15. Mantenere la temperatura con una lampada riscaldante.
    1. Prima dell'intubazione, valutare la profondità dell'anestesia dal riflesso del pizzicamento della zampa. Per un'intubazione ottimale, il riflesso del pizzico della zampa deve essere ancora presente ma notevolmente ridotto rispetto a quello di un animale cosciente.
  2. Dopo aver assicurato il cucciolo anestetizzato supino a una piattaforma di intubazione (Figura 1C), tenere la lingua con una piccola pinza e utilizzare un laringoscopio ricavato da un pezzo di filo di rame (Figura 1B) per esporre la glottide e le corde vocali. Aiuta la visualizzazione delle corde vocali mediante trans-illuminazione con una luce flessibile a fibre ottiche (Figura 1D).
  3. Utilizzando una cannula irrigidita, inclinare la cannula in modo che l'estremità del luer lock sia leggermente più bassa (~ 10°) rispetto alla punta e, non appena le corde vocali si separano, inserire la cannula e farla avanzare fino a quando l'adattatore luer lock è appena fuori dalla bocca. Rimuovere il filo immediatamente dopo l'intubazione.
    NOTA: Non è prevista alcuna resistenza durante l'intubazione nei topi di questa età a meno che la cannula non sia troppo avanzata e la resistenza sia avvertita dalla carena.
    1. Valutare la profondità dell'anestesia dopo l'intubazione dalla capacità dell'animale di respirare spontaneamente. Confermare il successo dell'intubazione tracheale dei cuccioli che respirano spontaneamente bloccando brevemente il catetere di intubazione per verificare che ciò impedisca il movimento del torace.
  4. Trasferire immediatamente il cucciolo intubato su un cuscinetto riscaldante (37 °C) e collegare la cannula endotracheale a un ventilatore che fornisca ossigeno al 100% a una portata di 1 L/min con 30 μL/corsa, 40 μL/corsa o 50 μL/corsa per 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g, o 5,50-8,10 g di cuccioli, rispettivamente, e 150 colpi/min.
  5. Eseguire queste procedure rapidamente, entro <15 s per ridurre al minimo la ri-respirazione.

4. Chirurgia dell'infarto miocardico di topi di 10 giorni

  1. Per indurre un piano chirurgico di anestesia per la chirurgia, commutare il gas che scorre nel ventilatore dal 100% di ossigeno al 4,5% di isoflurano nell'ossigeno (la concentrazione di isoflurano è determinata da un vaporizzatore) per 4-5 minuti.
    1. Dopo il passaggio all'isoflurano, confermare nuovamente l'intubazione tracheale controllando che la frequenza del movimento della parete toracica sia uguale a quella del ventilatore. La perdita della respirazione spontanea seguita dall'assenza di un riflesso della coda o della zampa indica che è stato raggiunto un piano chirurgico di anestesia (dopo 4-5 minuti).
  2. Mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% in ossigeno.
  3. Eseguire un intervento chirurgico di infarto miocardico al microscopio chirurgico (obiettivo 10x e 16x) come descritto alpunto 16.
    1. Disinfettare la pelle con un movimento circolare più volte con giri alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina e alcool al 70%. Usando le forbici sottili, fai un'incisione cutanea orizzontale tra la terza e la quarta costola (quarto spazio intercostale) nella parete laterale sinistra del torace. Usando una pinza fine, apri il torace mediante dissezione smussata dello spazio intercostale e usa un divaricatore per mantenere lo spazio aperto.
    2. Indurre un infarto miocardico mediante legatura dell'arteria coronaria sinistra appena distale all'appendice atriale sinistra con sutura monofilamento in polipropilene 9-0. Dopo l'intervento chirurgico di infarto di ~ 10 minuti, chiudere la pelle con prolene 7-0 e disinfettare l'incisione con betadine. Pulire il cucciolo di sangue con etanolo o soluzione salina al 70%.
      NOTA: La legatura dell'arteria coronaria sinistra nei cuccioli preadolescenti è essenzialmente senza sangue, come lo è con le legature adulte.
    3. Somministrare uno dopo l'altro con una siringa da insulina da 0,5 ml e ago da 29 G: atipamezolo (1-5 mg/kg, 10 μL, intraperitoneale) per un rapido recupero da sedazione, analgesia (buprenorfina, 0,075 mg/kg, 10 μL, sottocutanea) e soluzione salina (50 μL, intraperitoneale).
  4. Consentire agli animali di riprendersi interrompendo l'isoflurano. Assicurarsi che la respirazione spontanea riprenda entro pochi minuti dopo.
    1. Riportare il cucciolo nella camera pre-ossigenata riscaldata e monitorare continuamente durante il recupero fino a quando il riflesso raddrizzante non viene recuperato, a quel punto estubare il cucciolo.
    2. Strofinare delicatamente il cucciolo con la lettiera della gabbia domestica, tenerlo al caldo, controllare che la respirazione sia regolare e che il cucciolo sia in grado di muoversi spontaneamente. Ciò ridurrà il cannibalismo post-operatorio da parte della diga.
  5. Riportare la diga nella gabbia quando tutti i cuccioli si sono completamente ripresi dall'anestesia.
    NOTA: Il tempo complessivo impiegato per la preparazione, l'anestesia, l'intubazione, la chirurgia e il recupero di un cucciolo può variare da 40 a 60 minuti.
  6. Diga domestica e cuccioli durante la notte in una gabbia posta metà sopra / metà fuori da un cuscinetto riscaldante a 37 ° C.

5. Valutazione post-operatoria delle dimensioni dell'infarto

  1. Il 3° giorno dopo l'intervento, anestetizzare i cuccioli mettendoli in una camera di plexiglass pre-equilibrata con isoflurano al 4,5% in ossigeno a 1 ml/min di portata.
  2. Una volta raggiunto un piano chirurgico di anestesia (dopo 4-5 minuti), valutato dal riflesso del pizzicamento della zampa, rimuovere il cucciolo dalla camera e fissarlo in posizione supina su un pad riscaldante tappando la coda.
  3. Posizionare un filo sopra gli incisivi e il nastro adesivo in posizione per mantenere la testa estesa e posizionare la testa in un cono nasale collegato a un ventilatore che fornisce isoflurano al 4,5% in ossigeno a 200 μL / corsa, 150 colpi / min. Mantenere un piano chirurgico di anestesia con isoflurano al 2% in ossigeno.
  4. Disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Usando forbici sottili, praticare un'incisione di 1 cm nella pelle sopra l'arteria carotide comune destra lungo la trachea e cannulare il vaso esposto utilizzando un tubo di polietilene a lume singolo (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) per somministrare 0,2 ml di soluzione salina eparinizzata (200 U) per 1 minuto per prevenire la coagulazione del sangue.
  5. Aumentare l'isoflurano al 4,5% in ossigeno per 1 minuto prima di somministrare rapidamente 0,2 mL di 3,3 M KCl entro 2 s per arrestare il cuore in diastole.
  6. Sezionare la vena giugulare destra attraverso la stessa incisione e transetto. Perfondere il cuore con 0,2 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS), quindi perfondere con 0,1 ml di blu di Alcian allo 0,2% per colorare il miocardio remoto non infartuato. Controllare la perfusione riuscita, evidenziata dal lavaggio del sangue, PBS e poi Alcian Blue attraverso la vena giugulare.
  7. Apri il torace e asporta il cuore sezionando il tessuto connettivo circostante e i vasi per rilasciare il cuore. Risciacquare il cuore in PBS, rimuovere gli atri se lo si desidera e fotografare il cuore con una fotocamera montata su un microscopio chirurgico utilizzando un obiettivo 10x.

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Risultati

Anestesia di topi di 10 giorni. I cuccioli di 10 giorni possono essere anestetizzati con isoflurano al 4,5% in 4-5 minuti; Tuttavia, si riprendono dall'anestesia nel processo di preparazione per l'intubazione. A causa delle loro piccole dimensioni, l'intubazione in anestesia isoflurana erogata da un cono nasale standard non è fattibile. In precedenza abbiamo utilizzato un regime anestetico di ketamina / xilazina / atropina di 100/13 / 0,5 mg / kg, rispettivamente, per la chirurgia cardiotoracica in cucci...

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Discussione

Attualmente, non ci sono metodi ben documentati per l'anestesia e l'intubazione di topi di 10 giorni per la chirurgia cardiotoracica. A tal fine, abbiamo titolato i regimi di dosaggio di ketamina / xilazina / atropina al peso corporeo, in base ai quali dosi di 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg e 50/6/0,18 mg/kg hanno facilitato l'intubazione di cuccioli con peso corporeo basso (3,15-4,49 g), medio (4,50-5,49 g) e alto (5,50-8,10 g), rispettivamente. La sopravvivenza post-intubazione è correlata al peso corporeo (59%, 70% ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal NHMRC Program Grant [ID 1074386], da una sovvenzione Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research [RMG] e da una sovvenzione del RT Hall Trust [RMG & SEI].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Atipamezole (Antisedan)Provet (NSW) Pty LtdATIP I
Atropina 600 mcg/mLClifford Hallam Healthcare Pty Ptd1957699 PFIZER-0143386
BetadineLivingstone InternationalBU0520
Buprenorfina (Temgesic)Provet (NSW) Pty LtdTEMG I
Luce a fibre otticheLeica3011350CLS 150X
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersione 9.1.2
Piattaforma di intubazione --Qualsiasi scatola robusta (ad es. scatola di punta in plastica) con dimensioni approssimative 12 (L) x 8,5 x (L) x 7,5 cm (A)
IsofluraneProvet (NSW) Pty LtdISOF 07
Ketamina 100 mg/mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1
Cannula endovenosa in plastica 24 gauge Polywin Safety BD Insyte CE0086Tubo in plastica di 19 mm di lunghezza (diametro esterno 0,7 mm) collegato a un adattatore luer lock femmina in plastica da 21 mm; volume totale dell'annula 130 μ L
Tubo in polietilene a lume singoloCritchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSWDiametro esterno 0,61 mm, diametro interno 0,28 mm
Pinza piccolaF.S.T.NO 11051-10
Microscopio operatorio (fotocamera opzionale)LeicaM651 (fotocamera Leica IC80 HD)Obiettivo 10x e 16x
Sutura 7-0 proleneEthicon8708H
Sutura 9-0 monofilamento di polipropileneEthicon2813
V-1 Piano del tavolo con sistema di anestesia isoflurano Active ScavengingVetEquip901820
Camera di induzione in plexiglass ventilata da 2 litriVetQuip Pty Ltd94210225 cm (L) x 13 cm (L) x 11 cm (H)
Lampada riscaldanteBrilant Lighting99223
XylazineProvet (NSW) Pty LtdXYLA Z 2

Riferimenti

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