Il protocollo è destinato a fungere da modello per le università e altre organizzazioni che prendono in considerazione test su larga scala per SARS-CoV-2 o lo sviluppo di piani di preparazione per future epidemie virali.
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Articolo metodologico
Test SARS-CoV-2 su larga scala con saliva e pooling di campioni di trasposizione
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'identificazione e l'isolamento degli individui contagiosi, insieme alla quarantena dei contatti stretti, sono fondamentali per rallentare la diffusione del COVID-19. I test su larga scala in una capacità di sorveglianza o screening per i portatori asintomatici di COVID-19 forniscono sia dati sulla diffusione virale che la capacità di follow-up di testare rapidamente le persone durante i focolai sospetti. Dall'autunno del 2020, il programma di diagnosi precoce del COVID-19 presso la Michigan State University utilizza test su larga scala con capacità di sorveglianza o screening. I metodi qui adattati sfruttano l'affidabilità, l'elevato volume di campione e i vantaggi dell'auto-raccolta della saliva, abbinati a uno schema di pooling bidimensionale economico e conservatore dei reagenti. Il processo è stato progettato per essere adattabile alle carenze di approvvigionamento, con molti componenti dei kit e del test facilmente sostituibili. I processi descritti per la raccolta e l'elaborazione dei campioni di SARS-CoV-2 possono essere adattati per testare in modo affidabile la presenza di futuri agenti patogeni virali espressi in modo affidabile nella saliva. Fornendo questo modello per le università o altre organizzazioni, è possibile sviluppare piani di preparazione per future epidemie virali.
Introduzione
La pandemia di COVID-19, causata dal virus SARS-CoV-2, ha causato la morte di oltre 6,2 milioni di persone fino ad oggi, con numeri in aumento ogni giorno1. Il gold standard dei test per SARS-CoV-2 è la PCR quantitativa in tempo reale (RT-q), con primer progettati per colpire il genoma virale, come i geni nucleocapside, envelope, spike e RNA polimerasiRNA-dipendente 2. All'inizio della pandemia, la capacità sufficiente per i test SARS-CoV-2 era gravemente carente. È nato dalla mancanza di test convalidati, componenti di test, personale clinico e un'infrastruttura impreparata a espandersi....
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Protocollo
Gli studi condotti per ottimizzare i metodi per il programma di diagnosi precoce sono stati approvati dal Michigan State University Institutional Review Board. Tutte le cifre sono state riprodotte con campioni artificiosi e sono rappresentative dei risultati umani osservati. Nessun dato, informazione o risultato mostrato nel manoscritto proviene da alcun partecipante al programma di rilevamento precoce della Michigan State University.
1. Produzione del kit
NOTA: Durante l'assemblaggio del kit, indossare sempre maschere, guanti, protezioni per gli occhi e camici da ....
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Risultati
La stragrande maggioranza dei campioni ricevuti dal laboratorio fino ad oggi è stata accettata e ha superato la fase iniziale di controllo visivo della qualità. La necessità di rifiutare un campione è limitata ai motivi che possono influenzare negativamente l'elaborazione del campione e/o i risultati complessivi del campione. In particolare, il volume errato della provetta, la consistenza o il colore non naturale della saliva, l'assenza di perle di ceramica utilizzate per facilitare l'omogeneizzazione del campione e i co.......
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Discussione
Durante l'elaborazione del campione, ci sono passaggi che richiedono molta attenzione. La fase iniziale del controllo qualità, che esamina il volume del campione, la consistenza, il colore e la presenza di perle aggiunte, è fondamentale per il successo complessivo del processo. Le provette con campioni che non contengono la giusta quantità di saliva potrebbero produrre un falso negativo, poiché una quantità insufficiente di saliva comporterebbe una quantità insufficiente di materiale gen.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno informazioni finanziarie riguardanti i metodi, le forniture, le attrezzature o i reagenti.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i partecipanti agli studi approvati dal Michigan State University Institutional Review Board utilizzati per ottimizzare i metodi (STUDY00004265, STUDY00004383, STUDY00005109), nonché coloro che sono andati a raccogliere campioni utilizzati per testare i metodi (Dr. Katie Miller, Anna Stoll, Brian Daley, Dr. Claudia Finkelstein). Questo sforzo è stato sostenuto dalla Michigan State University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 Step MM, no ROX | Thermo Fisher | A28523 | |
| Piastre a pozzetti profondi da 1,2 ml | Fisher | AB0564 | |
| Serbatoi di reagenti da 100 mL Corning | 4872 | ||
| Perline in ceramica da 2,8 mm OMNI | 19-646 | ||
| 25 ml conico con tappo a vite | VWR | 76338-496 | |
| Serbatoi di fondo V da 50 ml | Costar | 4870 | |
| 5430-Centrifuga ad alta velocità | Eppendorf | 22620601 | |
| 5ml Eppendorf Tube | Fisher | 14282300 | |
| 8 provette a strisce per QuantStudio | life technologies | 4316567 | |
| Beta Mercaptoethanol | Fisher | AC125472500 | |
| Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade | Fisher | BP28184 | |
| Piastra di reazione rapida trasparente a 96 pozzetti Microamp Endura Optical con | tecnologie di durata | dei | |
| Piastra a 96 pozzetti Microamp Fast Optical | Mini | 4346906 | |
| Tappi | Corning Medical | 6770 | |
| per provette a strisce | tecnologie di vita | AB-1820 | |
| Pellicola ottica | Thermo Fisher | ||
| Pellicola sigillante per piastre PCR 4311971 Non ottico | Fisher | AB-0558 | |
| Piastra PCR semi-gonna | Fisher | 14230244 | |
| QuantStudio 3 Sistema PCR in tempo reale, 96 pozzetti, 0,1 mL | Thermo Fisher | A28136 | |
| Conferma rapida del kit virale a RNA Zymo | R1035 | ||
| Serbatoio di reagenti, 100 ml | di 229298 | DOT | |
| RNA Shield | Zymo | R1200-1L | |
| Piccole borse per rischio biologico | Fisher | 180000 | |
| Taqpath RTPCR Kit COVID19 | Thermo Fisher | A47814 | |
| Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuga | Thermo Fisher | 75009525 | |
| Transfer Pipet | Fisher | 22170404 | |
| Viral 96 Kit | Zymo | R1041 | |
| Miscelatore a vortice | Fisher | 2215414 |
Riferimenti
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , Available from: https://covid19.who.int/ (2022).
- John Hopkins Center for Health Security. Center for Health Security. Comparison of National RT-PCR primers, probes, and protocols for SARS-CoV-2 diagnostics. John Hopkins Center for Health Security. , Centerforhealthsecurity.Org 5(2020).
- ....
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Ristampe e permessi
