Test SARS-CoV-2 su larga scala con saliva e pooling di campioni di trasposizione

Summary

Il protocollo è destinato a fungere da modello per le università e altre organizzazioni che prendono in considerazione test su larga scala per SARS-CoV-2 o lo sviluppo di piani di preparazione per future epidemie virali.

Abstract

L'identificazione e l'isolamento degli individui contagiosi, insieme alla quarantena dei contatti stretti, sono fondamentali per rallentare la diffusione del COVID-19. I test su larga scala in una capacità di sorveglianza o screening per i portatori asintomatici di COVID-19 forniscono sia dati sulla diffusione virale che la capacità di follow-up di testare rapidamente le persone durante i focolai sospetti. Dall'autunno del 2020, il programma di diagnosi precoce del COVID-19 presso la Michigan State University utilizza test su larga scala con capacità di sorveglianza o screening. I metodi qui adattati sfruttano l'affidabilità, l'elevato volume di campione e i vantaggi dell'auto-raccolta della saliva, abbinati a uno schema di pooling bidimensionale economico e conservatore dei reagenti. Il processo è stato progettato per essere adattabile alle carenze di approvvigionamento, con molti componenti dei kit e del test facilmente sostituibili. I processi descritti per la raccolta e l'elaborazione dei campioni di SARS-CoV-2 possono essere adattati per testare in modo affidabile la presenza di futuri agenti patogeni virali espressi in modo affidabile nella saliva. Fornendo questo modello per le università o altre organizzazioni, è possibile sviluppare piani di preparazione per future epidemie virali.

Introduction

La pandemia di COVID-19, causata dal virus SARS-CoV-2, ha causato la morte di oltre 6,2 milioni di persone fino ad oggi, con numeri in aumento ogni giorno¹. Il gold standard dei test per SARS-CoV-2 è la PCR quantitativa in tempo reale (RT-q), con primer progettati per colpire il genoma virale, come i geni nucleocapside, envelope, spike e RNA polimerasi^{RNA-dipendente 2}. All'inizio della pandemia, la capacità sufficiente per i test SARS-CoV-2 era gravemente carente. È nato dalla mancanza di test convalidati, componenti di test, personale clinico e un'infrastruttura impreparata a espandersi....

Protocol

Gli studi condotti per ottimizzare i metodi per il programma di diagnosi precoce sono stati approvati dal Michigan State University Institutional Review Board. Tutte le cifre sono state riprodotte con campioni artificiosi e sono rappresentative dei risultati umani osservati. Nessun dato, informazione o risultato mostrato nel manoscritto proviene da alcun partecipante al programma di rilevamento precoce della Michigan State University.

1. Produzione del kit

NOTA: Durante l'assemblaggio del kit, indossare sempre maschere, guanti, protezioni per gli occhi e camici da ....

Results

La stragrande maggioranza dei campioni ricevuti dal laboratorio fino ad oggi è stata accettata e ha superato la fase iniziale di controllo visivo della qualità. La necessità di rifiutare un campione è limitata ai motivi che possono influenzare negativamente l'elaborazione del campione e/o i risultati complessivi del campione. In particolare, il volume errato della provetta, la consistenza o il colore non naturale della saliva, l'assenza di perle di ceramica utilizzate per facilitare l'omogeneizzazione del campione e i co.......

Discussion

Durante l'elaborazione del campione, ci sono passaggi che richiedono molta attenzione. La fase iniziale del controllo qualità, che esamina il volume del campione, la consistenza, il colore e la presenza di perle aggiunte, è fondamentale per il successo complessivo del processo. Le provette con campioni che non contengono la giusta quantità di saliva potrebbero produrre un falso negativo, poiché una quantità insufficiente di saliva comporterebbe una quantità insufficiente di materiale gen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Step MM, no ROX	Thermo Fisher	A28523
Piastre a pozzetti profondi da 1,2 ml	Fisher	AB0564
Serbatoi di reagenti da 100 mL Corning		4872
Perline in ceramica da 2,8 mm OMNI		19-646
25 ml conico con tappo a vite	VWR	76338-496
Serbatoi di fondo V da 50 ml	Costar	4870
5430-Centrifuga ad alta velocità	Eppendorf	22620601
5ml Eppendorf Tube	Fisher	14282300
8 provette a strisce per QuantStudio	life technologies	4316567
Beta Mercaptoethanol	Fisher	AC125472500
Ethanol 200 Proof, Molecular Biology Grade	Fisher	BP28184
Piastra di reazione rapida trasparente a 96 pozzetti Microamp Endura Optical con	tecnologie di durata	dei
Piastra a 96 pozzetti Microamp Fast Optical	Mini	4346906
Tappi	Corning Medical	6770
per provette a strisce	tecnologie di vita	AB-1820
Pellicola ottica	Thermo Fisher
Pellicola sigillante per piastre PCR 4311971 Non ottico	Fisher	AB-0558
Piastra PCR semi-gonna	Fisher	14230244
QuantStudio 3 Sistema PCR in tempo reale, 96 pozzetti, 0,1 mL	Thermo Fisher	A28136
Conferma rapida del kit virale a RNA Zymo		R1035
Serbatoio di reagenti, 100 ml	di 229298		DOT
RNA Shield	Zymo	R1200-1L
Piccole borse per rischio biologico	Fisher	180000
Taqpath RTPCR Kit COVID19	Thermo Fisher	A47814
Thermo Scientific Sorvall ST4R Plus Centrifuga	Thermo Fisher	75009525
Transfer Pipet	Fisher	22170404
Viral 96 Kit	Zymo	R1041
Miscelatore a vortice	Fisher	2215414