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Summary

Le barre di microgel con gruppi reattivi complementari sono prodotte tramite microfluidica con la capacità di interlegarsi in soluzione acquosa. I microgel anisometrici si inceppano e si interconnettono in costrutti stabili con pori più grandi rispetto ai sistemi basati su sferiche. Microgel modificati con GRGDS-PC formano costrutti 3D macroporosi che possono essere utilizzati per la coltura cellulare.

Abstract

Un sistema bicomponente di microgel funzionalizzati dalla microfluidica consente una rapida interconnessione in costrutti macroporosi 3D in soluzioni acquose senza ulteriori additivi. La gelificazione continua su chip fotoavviata consente la variazione del rapporto di aspetto del microgel, che determina le proprietà del blocco di costruzione per i costrutti ottenuti. I monomeri di glicidil metacrilato (GMA) o 2-amminoetilmetacrilato (AMA) vengono copolimerizzati nella rete di microgel basata su polimeri stellari di glicole polietilenico (PEG) per ottenere funzionalità epossidica o amminica. Un flusso di olio di focalizzazione viene introdotto nella struttura di uscita microfluidica per garantire la raccolta continua delle barre di microgel funzionalizzate. Sulla base di una recente pubblicazione, i costrutti basati su aste di microgel producono pori più grandi di diverse centinaia di micrometri e, allo stesso tempo, portano a una maggiore stabilità complessiva dell’impalcatura rispetto a un modello basato su sferica. In questo modo, è possibile produrre costrutti di volume più elevato con più volume libero, riducendo al contempo la quantità di materiale richiesto. Gli scaffold macroporosi interconnessi possono essere prelevati e trasportati senza danni o disintegrazioni. I gruppi amminici ed epossidici non coinvolti nell’interconnessione rimangono attivi e possono essere utilizzati indipendentemente per la post-modifica. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per la fabbricazione di barre di microgel per formare scaffold macroporosi interconnessi che possono essere utilizzati per successivi esperimenti cellulari.

Introduction

Per studiare il comportamento complesso delle cellule cooperative nei costrutti 3D, le piattaforme di scaffold devono mostrare prestazioni coerenti in termini di riproducibilità, avere una geometria adatta per la migrazione cellulare e, allo stesso tempo, consentire una certa flessibilità in termini di alterazione dei parametri per indagare la loro influenza sul tessuto vivente¹. Negli ultimi anni, il concetto di particelle ricotto macroporose (MAP), descritto per la prima volta da Segura et al., si è sviluppato in una piattaforma efficiente e versatile per la produzione di scaffold 3D². La composizione su misura dei microgel, che sono gli elementi costitutivi dello scaffold 3D finale, predefinisce proprietà come la rigidità del costrutto, la reattività chimica selettiva della rete di gel e la dimensione finale dei pori dello scaffold 2,3,4,5,6. I peptidi adesivi cellulari come spunti per le interazioni scaffold-cellula sono incorporati nella rete polimerica dei microgel per consentire l’attaccamento cellulare e possono essere variati per studiare i loro effetti specifici sulle cellule in coltura. Gli scaffold 3D sono stabilizzati dall’interconnessione dei microgel iniettabili ricotti a causa di legami covalenti o supramolecolari, risultando in costrutti robusti e definiti per la coltura cellulare 2,3,5,7,8.

La microfluidica si è affermata come uno dei metodi più accurati e adattabili per la preparazione di idrogel granulari definiti⁹. La possibilità di produrre maggiori quantità degli elementi costitutivi necessari in un processo continuo mantenendo la loro monodispersità chimica, meccanica e fisica contribuisce in modo sostanziale all’idoneità di questo processo. Inoltre, le dimensioni e la forma dei microgel prodotti possono essere manipolate con vari metodi come emulsioni batch, microfluidica, litografia, spruzzatura elettrodinamica o frammentazione meccanica, che determinano la geometria dei blocchi di costruzione e, quindi, la struttura 3D dell’impalcatura finale ^1,10.

Recentemente, è stato riportato il concetto di scaffold 3D macroporosi composti da barre di microgel funzionalizzate che si interlegano rapidamente in soluzioni acquose senza ulteriori additivi¹¹. L’anisotropia dei bastoncelli di microgel ha portato a porosità e distribuzioni dei pori più elevate con dimensioni dei pori maggiori rispetto all’impiego di microgel sferici in questo studio¹¹. In questo modo, meno materiale crea pori più grandi con una varietà di geometrie di pori diverse, mantenendo la stabilità dello scaffold 3D. Il sistema è costituito da due tipi di barre di microgel con ammina primaria complementare e gruppi funzionali epossidici che vengono consumati all’interno della reazione di interconnessione quando entrano in contatto tra loro. I gruppi funzionali che non partecipano al processo di interconnessione rimangono attivi e possono essere utilizzati per la post-modifica selettiva con peptidi adesivi cellulari o altri fattori bioattivi. Le cellule dei fibroblasti si attaccano, si diffondono e proliferano quando vengono coltivate all’interno degli scaffold 3D, crescendo prima sulla superficie del microgel e riempiendo la maggior parte dei macropori dopo 5 giorni. Uno studio preliminare di co-coltura di fibroblasti umani e cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) ha mostrato risultati promettenti per la formazione di strutture simili a vasi all’interno degli scaffold 3D interconnessi¹¹.

Protocol

1. Materiale richiesto e preparati per la microfluidica Per la procedura microfluidica descritta, utilizzare siringhe di vetro da 1 mL e 5 mL e pompe a siringa. La formazione di goccioline su chip viene osservata tramite un microscopio invertito dotato di una telecamera ad alta velocità. Creare il progetto del chip microfluidico (Figura 1B) utilizzando un software di progettazione assistita da computer e produrre un modello master come già riportato12. Ottenere un’irradiazione UV controllata utilizzando un LED UV autocostruito (λ = 365 nm, diametro spot ~ 4,7 mm) che fornisce irradianza a 957 mW / cm2 attraverso un vetro di copertura spesso 0,13 mm.NOTA: Tenere conto della possibile generazione di calore locale da parte dell’UV-LED durante l’irraggiamento. In tal caso, assicurarsi di un raffreddamento sufficiente mediante flusso d’aria esterno. 2. Produzione di dispositivi microfluidici NOTA: La produzione di dispositivi microfluidici si basa su una precedente pubblicazione13. Preparare 20 g di una miscela 10:1 (in massa) di polidimetilsilossano (PDMS) e agente indurente. Mescolare energicamente per 3 min. Mescolare 60 mg di olio rosso O in 2,0 g di toluene. Aggiungere 50 μL di olio rosso O in soluzione di toluene alla miscela PDMS. Mescolare fino a ottenere una distribuzione omogenea del colore per ridurre la diffusione indesiderata della luce e mantenere la dimensione dello spot focalizzata durante la gelificazione su chip. Rimuovere le bolle mettendo la miscela in un essiccatore dotato di una pompa per vuoto. Gettate la miscela PDMS nella dima principale ad un’altezza di 5-5,5 mm e degasate nuovamente. Lasciare polimerizzare il PDMS per 18 ore a temperatura ambiente per evitare la degradazione del colorante diazo. Ritagliare la struttura PDMS e perforare i fori di ingresso e uscita nella struttura utilizzando uno strumento di campionamento del nucleo di linea (diametro interno 0,77 mm, diametro esterno 1,07 mm). Lavare ripetutamente il PDMS e coprire il vetro con isopropanolo e acqua deionizzata 5 volte e, successivamente, rimuovere il liquido tramite aria in pressione o flusso di azoto dopo ogni fase di lavaggio. Trattare il vetro secco e il PDMS insieme in un forno al plasma a 0,2 mbar, con un flusso di ossigeno di 20 ml / min per 60 s a 100 W, e collegare direttamente per legare insieme il vetro e il PDMS per formare il dispositivo microfluidico.NOTA: evitare di piegare la struttura PDMS durante il processo di associazione per ridurre al minimo la deformazione della struttura del canale. Per rendere idrofobici i canali del chip microfluidico, posizionare il dispositivo insieme a 50 μL di tricloro-(1H,1 H,2 H,2 H-perfluoroctil)-silano in un essiccatore sotto vuoto durante la notte (chiudere il collegamento alla pompa dopo aver diminuito la pressione del vapore). Risciacquare l’esterno del dispositivo con idrofluoroetere.ATTENZIONE: Eseguire questi passaggi in una cappa aspirante ed evitare qualsiasi contatto con il perfluorosilano. Utilizzare un essiccatore sottovuoto per vetro sigillato con grasso. Pulire accuratamente l’essiccatore prima di utilizzarlo per altri scopi. 3. Preparazione della soluzione per la microfluidica Per la fase oleosa continua, mescolare olio di paraffina ed esadecano (1:1 v/v) e aggiungere l’8% (p/p) di un tensioattivo non ionico. Riempire una siringa di vetro da 1 mL (primo olio, Figura 1) e una da 5 mL (secondo olio, Figura 1). Preparare le soluzioni di prepolimeri per la fase dispersa in flaconcini di vetro marrone per prevenire la decomposizione del fotoiniziatore e la gelificazione involontaria.Soluzione di prepolimero componente amminico contenente GRGDS-PCPer una soluzione da 300 μL, pesare 33,3 mg di glicole-polietilenglico-acrilato stellato (sPEG-AC) e 3,03 mg di litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP). Sciogliere 18,74 mg di 2-amminoetilmetacrilato cloridrato (AMA) in 1,5 ml di acqua deionizzata e far passare la soluzione attraverso un filtro a siringa (dimensione dei pori 0,20 μm).NOTA: AMA è igroscopica e deve essere eliminata non appena i grumi delle forme solide si accumulano nel contenitore di stoccaggio. Preparare aliquote sterili di 36 mM GRGDS-PC in acqua e conservare a -20 °C fino all’uso. Utilizzare 291,7 μL della soluzione AMA per dissolvere sPEG-AC e LAP e aggiungere 8,3 μL della soluzione GRGDS-PC. Assumere la soluzione con una siringa di vetro da 1 mL e proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. Soluzione di prepolimero componente epossidicoPer una soluzione da 300 μL, pesare 33,3 mg di glicole-polietilenglico-acrilato stellato (sPEG-AC), 3,03 mg di LAP e sciogliere in 300 μL di acqua deionizzata. Aggiungere 2,4 mg di glicidil metacrilato (GMA).NOTA: Lo scuotimento vigoroso accelera la dissoluzione di GMA. Assumere la soluzione con una siringa di vetro da 1 mL e proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio. 4. Produzione e purificazione di barre di microgel funzionalizzato amminico ed epossidico Figura 1: Disposizione del gruppo di gelificazione microfluidica su chip. (A) Vista frontale e vista angolata della disposizione dei componenti durante la microfluidica. (B) Progettazione di chip microfluidici utilizzati per la gelificazione su chip di barre di microgel. (1) Tubo in PE alla prima presa d’olio. (2) Tubo in PE protetto dalla luce all’ingresso della fase dispersa. (3) Tubo in PE al secondo ingresso dell’olio. (4) Tubo in PE dall’uscita al contenitore di raccolta del prodotto. (5) Lampada UV e posizione di irradiazione sul canale rettilineo da 80 μm vicino all’uscita. (6) Obiettivo del microscopio/posizione di osservazione. (7) Componente PDMS colorato del dispositivo microfluidico. (8) Vetro di copertura incollato al PDMS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Inserire gli aghi nei tubi PE e rimuovere il gas dalla siringa e dal tubo. Inserire un tubo PE nella presa per la raccolta del prodotto. Collocare tutte le siringhe di vetro nelle pompe a siringa e inserire ciascuna estremità del tubo nell’ingresso corrispondente (Figura 1).NOTA: Proteggere il tubo di prepolimero dalla luce tramite un foglio di alluminio o un tubo nero per evitare gelificazioni involontarie. Focalizzare il microscopio sulla sezione trasversale olio-acqua. Avviare la prima pompa della siringa dell’olio (portata = 100-200 μL/h) per riempire prima il canale con olio per evitare la bagnatura del canale da parte della fase di dispersione. Diminuire la prima portata dell’olio a 30 μL/h e avviare la pompa della siringa prepolimerica (portata = 100-200 μL/h) fino a quando non è possibile osservare la fase acquosa dispersa nella sezione trasversale. Impostare la portata del prepolimero su 30 μL/h e focalizzare il microscopio sull’uscita. Avviare la seconda pompa a siringa dell’olio (portata di 300 μL/h) e attendere che il regime di flusso sia stabile. Posizionare il tubo di uscita in un contenitore di raccolta.NOTA: Posizionare l’estremità del tubo nella parte superiore del contenitore per evitare un aumento di pressione dovuto all’accumulo del prodotto nel tempo. Impostare il sistema di irradiazione UV in modo tale che l’irraggiamento sia compreso tra 900 e 1000 mW/cm 2 (irradianza utilizzata = 957 mW/cm2) e che lo spot di irradiazione si trovi nella parte del canale diritto prima dell’uscita (figura 1B).NOTA: assicurarsi di non irradiare vicino alla sezione trasversale olio-acqua per evitare di intasare il canale. Per una protezione aggiuntiva, coprire le strutture del canale prima del punto di irradiazione sulla parte superiore dell’unità. Prima dell’irradiazione UV, regolare le portate del prepolimero e del primo olio per ottenere le proporzioni desiderate nell’intervallo da 3,0 a 4,5 e impostare il tempo di irradiazione della fase dispersa a ~ 2,3 s, a seconda delle dimensioni dello spot di irradiazione. Avviare l’irradiazione UV e, se necessario, regolare nuovamente le portate secondo la sottosezione precedente.NOTA: Osservare la produzione all’inizio e monitorare il comportamento stabile del flusso in uscita e l’uniformità delle barre di microgel. Il secondo flusso dell’olio può essere regolato per ottimizzare il trasporto del prodotto all’interno dell’uscita. Modificare il contenitore di raccolta e annotare l’ora di inizio della raccolta del prodotto e le portate.NOTA: Proteggere il prodotto dalla polvere. Interrompere la raccolta prima che qualsiasi siringa esaurisca la soluzione. Per terminare la raccolta, rimuovere il contenitore di raccolta, annotando l’ora. Fermare l’irradiazione e tutte le pompe a siringa. Lavare il prodotto successivamente 5 volte ciascuno con n-esano, isopropanolo e acqua deionizzata. Rimuovere il surnatante dopo la sedimentazione dell’asta.NOTA: Dopo ogni aggiunta di soluzione, disperdere accuratamente il prodotto e attendere 10 minuti prima di sostituire il solvente, considerando la diffusione molecolare. Sostituire gradualmente l’isopropanolo con acqua per evitare che le aste galleggiano sulla superficie del liquido. Più passaggi di lavaggio aggiuntivi con acqua riducono le tracce rimanenti di isopropanolo. 5. Formazione di impalcature macroporose Determinare il numero di barre di microgel per volume di dispersione per i campioni epossidici e amminizzati funzionalizzati. Regolare il numero di campioni epossidici e amminizzati funzionalizzati mediante diluizione o concentrazione a un valore simile tra 1.000-5.000 barre/100 μL.NOTA: Utilizzare una centrifuga a ~2.000 x g per 5-10 s per accelerare la sedimentazione delle barre di microgel. Se il numero di barre per volume di dispersione è basso, l’interconnessione delle aste può risultare in cluster di barre più piccoli invece di un costrutto stabile. Se il numero di barre per volume di dispersione è elevato, la qualità di miscelazione dei due componenti sarà compromessa. Trasferire la dispersione del primo componente (~1.200 barrette) in un flaconcino conico trasparente da 1,5 ml o 2 ml. Aggiungere il secondo componente in modo controllato in un funzionamento continuo (pipetta da 100 μL). Dopo l’aggiunta, mescolare il contenuto direttamente utilizzando la pipetta per assorbire il liquido e aggiungerlo di nuovo. La struttura interconnessa si forma in pochi secondi durante la miscelazione.NOTA: Se si formano più cluster invece di una struttura coerente, ricontrollare il numero di barre di microgel per volume o fornire una miscelazione più controllata dei due componenti. 6. Post-modifica dell’adesivo cellulare Calcolare il numero teorico di gruppi epossidici nella struttura interconnessa in base alla portata della fase polimerica dispersa, al numero di microgel raccolti durante un tempo specifico e al fattore di diluizione della dispersione di microgel utilizzata per la formazione dello scaffold.NOTA: approssimare il numero teorico di gruppi epossidici per impalcatura con la seguente equazione.nesimo: Quantità teorica di sostanzac GMA: concentrazione diGMA in soluzione di prepolimeroD: Portata della soluzione di prepolimeri Aggiungere la soluzione GRGDS-PC alla struttura interconnessa per modificare tutti i restanti gruppi epossidici con il peptide adesivo cellulare contenente un’ammina libera e un tiolo (n [gruppi epossidici teorici] / n [GRGDS-PC] = 1). Lasciare a temperatura ambiente durante la notte. Rimuovere le molecole non reagite lavando con acqua deionizzata e rimuovendo il surnatante. 7. Sterilizzazione e trasferimento in terreni di coltura cellulare Ridurre il livello dell’acqua per immergere semplicemente l’impalcatura interconnessa. Aprire il flaconcino e irradiare con luce UV di λ = 250-300 nm. Chiudere il flaconcino e trasferirlo su un banco pulito. Lavare 1x con acqua sterile. Sostituire l’acqua nel flaconcino con terreni di coltura cellulare e consentire l’equilibrio per 5 minuti. Ripetere questa operazione con terreni di coltura cellulare freschi 2x. Trasferire l’impalcatura macroporosa in una piastra di coltura cellulare per l’esperimento versando o usando una spatola.   

Representative Results

Figura 2: Struttura dello scaffold reticolato macroporoso. (A) Proiezione 3D di una microscopia confocale da 500 μm Z-stack dello scaffold macroporoso interconnesso. La barra di scala rappresenta 500 μm. (B) Impalcatura interconnessa composta da ~ 10.000 barre di microgel su un vetro di copertura prelevato diretta…

Discussion

Uno dei passaggi critici in questo protocollo è la qualità del 2-amminoetilmetacrilato (AMA) utilizzato come comonomero per la funzionalizzazione dell’ammina primaria. L’AMA dovrebbe essere una polvere a grana fine e preferibilmente incolore consegnata in un contenitore di vetro marrone a tenuta di gas. Si dovrebbe evitare l’uso di materiale verdastro e grumoso, in quanto compromette significativamente la reazione di gelificazione e influisce negativamente sulla riproducibilità dei risultati. In caso di scarsa gelific…

Materials

ABIL EM 90	Evonik	144243-53-8	non-ionic surfactant
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride	TCI Chemicals	A3413	>98.0%(T)(HPLC)
8-Arm PEG-acrylate 20 kDa	Biochempeg Scientific Inc.	A88009-20K	≥ 95 %
AutoCAD 2019	Autodesk		computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs
CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter	CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KG	XH49.1	pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV)
Cover glass	Marienfeld-Superior		type No. 1
EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm	Electron Microscopy Sciences		0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter
Ethanol absolut	VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera	FLIR Systems
Fluoresceinamine isomer I	Sigma-Aldrich	201626
Fluorescein isothiocyanate	Thermo Fisher Scientific	46424
25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles	BD Microlance 3
Glycidyl methacrylate	Sigma-Aldrich	779342	≥97.0% (GC)
GRGDS-PC	CPC Scientific	FIBN-015A
Hamilton 1000 Series Gastight syringes	Thermo Fisher Scientific	10772361/10500052	PFTE Luer-Lock
Hexane	Sigma-Aldrich	1,04,367
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate	Sigma-Aldrich	900889	≥95 %
Motic AE2000 trinocular microscope	Ted Pella, Inc.	22443-12
Novec 7100	Sigma-Aldrich	SHH0002
Oil Red O	Sigma-Aldrich	O9755
Paraffin	VWR Chemicals	24679320
Pavone Nanoindenter Platform	Optics11Life
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade	dropletex		ID 0.38 mm OD 1.09 mm
2-Propanol	Sigma-Aldrich	190764	ACS reagent, ≥99.5%
Protein LoBind Tubes	Eppendorf	30108132
Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus
RPMI 1640 medium	Gibco	11530586
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Dow SYLGARD	634165S
Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane	Sigma-Aldrich	448931
UVC LED sterilizing box	UVLED Optical Technology Co., Ltd.	9S SZH8-S2