La chiarezza ottica è un grande vantaggio per il lavoro biologico e fisiologico delle cellule nel pesce zebra. Vengono descritti metodi robusti per la misurazione della crescita cellulare nei singoli animali che consentono nuove intuizioni su come la crescita del muscolo scheletrico e dei tessuti vicini sono integrati con la crescita di tutto il corpo.
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Articolo metodologico
Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un certo numero di metodi può essere utilizzato per visualizzare singole cellule in tutto il corpo di zebrafish embrionale, larvale o giovanile vivo. Mostriamo che i pesci vivi con membrane plasmatiche marcate in modo fluorescente possono essere scansionati in un microscopio a scansione laser confocale per determinare il volume del tessuto muscolare e il numero di fibre muscolari presenti. Approcci efficienti per la misurazione del numero e delle dimensioni delle cellule negli animali vivi nel tempo sono descritti e convalidati rispetto a metodi di segmentazione più difficili. Vengono descritti metodi che consentono il controllo dell'attività elettrica muscolare, e quindi contrattile. La perdita dell'attività contrattile del muscolo scheletrico ha ridotto notevolmente la crescita muscolare. Nelle larve viene descritto un protocollo che consente la reintroduzione dell'attività contrattile evocata elettricamente. I metodi descritti minimizzano l'effetto della variabilità interindividuale e permetteranno di analizzare l'effetto di stimoli elettrici, genetici, farmacologici o ambientali su una varietà di parametri di crescita cellulare e fisiologica nel contesto dell'organismo vivente. Il follow-up a lungo termine degli effetti misurati di un intervento definito all'inizio della vita sugli individui può essere successivamente eseguito.
Introduzione
La crescita tissutale regolata, che comprende l'aumento del numero cellulare (iperplasia) e / o delle dimensioni delle cellule (ipertrofia), è un fattore cruciale nello sviluppo, nella rigenerazione e nell'adattamento ecologico ed evolutivo. Nonostante gli enormi progressi nella comprensione genetica molecolare della biologia cellulare e dello sviluppo negli ultimi decenni, la comprensione meccanicistica della regolazione delle dimensioni dei tessuti e degli organi è ancora agli inizi. Una delle ragioni di questa lacuna nella conoscenza è la difficoltà di quantificare la crescita dei tessuti negli organismi viventi con la necessaria precisione spaziale e temporale.
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Protocollo
Tutte le ricerche descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e sotto adeguate licenze del Ministero degli Interni del Regno Unito in conformità con l'Animal (Scientific Procedures) Act 1986 e successive modifiche. Gli embrioni/larve devono essere allevati a 28,5 °C fino al completamento della gastrulazione, ma possono poi essere mantenuti a 22-31 °C per controllare il tasso di sviluppo. I pesci possono essere scansionati o stimolati a temperatura ambiente.
1. Anestetizzare le larve di zebrafish
- Incrociare pesci adulti reporter fluorescenti adatti come Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP....
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Risultati
Una misura rapida e precisa del volume di somite
Viene descritto un metodo di preparazione del campione, acquisizione dei dati e analisi volumetrica che consente la rapida misurazione della crescita muscolare nelle larve di zebrafish. La dimensione muscolare può essere misurata negli animali vivi utilizzando pesci marcati sulle loro membrane plasmatiche con una GFP mirata alla membrana (β-actina: HRAS-EGFP) o mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). Le larve sono state anestetizzate transit.......
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Discussione
Qui riportiamo un metodo per la stima accurata ed efficiente del volume muscolare delle larve vive di zebrafish in stadi o in varianti genetiche in cui la pigmentazione non è un grosso ostacolo all'imaging e quando l'anestesia transitoria e / o l'immobilizzazione sono ben tollerate. Mentre abbiamo impiegato la microscopia confocale a scansione laser, gli approcci descritti sono applicabili alla microscopia confocale a disco rotante o a foglio luminoso e a qualsiasi altro metodo che crea pile di immagini su piani focali d.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori sono profondamente in debito con gli sforzi dei membri del laboratorio Hughes Drs Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin e Vladimir Snetkov per lo sviluppo dei protocolli descritti, e a Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau e Peter Currie per aver condiviso plasmidi o linee di zebrafish. SMH è uno scienziato del Medical Research Council (MRC) con sovvenzione del programma G1001029, MR / N021231 / 1 e MR / W001381 / 1. MA ha conseguito una borsa di studio di dottorato del programma di formazione di dottorato MRC presso il King's College di Londra. Questo lavoro ha beneficiato dell'inpu....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adesivo, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aspirapolvere per aerosol | - | - | - |
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A9539-Agarosio | |
| , bassa temperatura di gelificazione | Sigma-Aldrich | A9414 | Una volta sciolto, conservare a 37oC in un riscaldatore a blocco per rimanere in forma liquida per un uso ripetuto. |
| Riscaldatore a blocco | Cole-Parmer | SBH130-BODIPY | |
| FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | Da diluire in acqua di pesce e utilizzare a 5 &5; M per l'incubazione notturna. |
| Clip e fili di coccodrillo | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH- | - | |
| Medium per pesci, acqua per pesci- | - | Acqua del sistema di circolazione raccolta dall'impianto ittico. | |
| Pesce medio, E3 medio | - | - | E3 è descritto in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 e 0,33 mM MgSO4 in acqua distillata). |
| Microscopio a fluorescenza | Leica | Leica MZ16F | Si prevede che siano adatti anche microscopi a fluorescenza di altro tipo. |
| Ago di vetro | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | Da lucidare a fuoco per evitare danni agli embrioni durante la manipolazione. |
| Stimolatore per erba | Grass Instruments | S88 | Si prevede che siano adatti anche stimolatori di altro tipo. |
| Kimwipes, panni per attività delicate | Kimberly-Clark Microscopio a scansione professionale | 13258179-Laser | |
| (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 | LSM di altro tipo dovrebbero essere adatti. |
| Nunc Piastra a 6 pozzetti trattata | Thermo Scientific | 140675-Objective | |
| , 20&/1.0W | Zeiss | - | - |
| Pipetta Pasteur, graduata 1 mL | Starlab Group | E1414-0100-Pasteur | |
| , Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100-Piastra | |
| di Petri, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmide, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (Università di Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmide iniettato a 25-75 pg allo stadio di una cellula. Citazione: Bussman J e Schulte-Merker S. (2011) Sviluppo 138:4327-4332. DOI: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmide, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (Università di Sheffield) | - | Per la trascrizione in vitro utilizzando il promotore SP6 (possono essere utilizzati plasmidi contenenti altri marcatori di marcatura della membrana); sintetizzato mRNA con cappuccio da iniettare a 100-200 pg allo stadio di una cellula. |
| Regolatore di impulsi | Hoefer Scientific Instruments | PC750-Saldatore | |
| - | - | ||
| Tricaina | Sigma-Aldrich | E10521 | Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato / MS-222; da sciogliere in acqua di pesce e utilizzare a 0,6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Pinze per orologiai, n. 5 | - | - | -Filo |
| , Platino | Goodfellow | PT005142/12 | 0,40 mm di diametro; una costosa alternativa all'argento. |
| Filo, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0,25 mm di diametro (è stato testato un intervallo di diametri cioè 0,25-0,5 mm, che ha prodotto risultati simili). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | Nome ufficiale ZFIN: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citazione: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordá n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging dell'eterogeneità delle cellule tumorali dopo il trapianto di cellule in zebrafish immunodeficiente otticamente chiaro. Nat Commun. 21 gennaio 2016;7:10358. DOI: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN nome ufficiale: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citazione: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, e Currie PD. Perdita di Tropomodulina4 nel mutante del pesce zebra trä La GE provoca la formazione di bastoncelli citoplasmatici e debolezza muscolare che ricorda la miopatia nemalinica. Dis Model Mecc. 2014 Dicembre; 7(12):1407-15. DOI: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actina:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN nome ufficiale: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citazione: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I e Kimelman D. Visualizzazione della morfogenesi in embrioni di zebrafish transgenico utilizzando il colorante BODIPY TR metilestere come controcolorante vitale per la GFP. Dev Dyn. febbraio 2005; 232(2):359-68. DOI: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
Riferimenti
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al.
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Ristampe e permessi
