Arricchimento di vescicole extracellulari derivate da astrociti da plasma umano

Natalia Valle-Tamayo; Rocío Pérez-González; Gemma Chiva-Blanch; Olivia Belbin; Sara Serrano-Requena; Sònia Sirisi; Alba Cervantes González; Oriol Giró; Érika Sánchez-Aced; Oriol Dols-Icardo; Daniel Alcolea; María Carmona-Iragui; Amanda Jimenez; Alberto Lleó; Juan Fortea; M. Florencia Iulita

doi:10.3791/64107

Articolo metodologico

Arricchimento di vescicole extracellulari derivate da astrociti da plasma umano

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DOI:

10.3791/64107

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3 agosto 2022

Natalia Valle-Tamayo¹^,² , Rocío Pérez-González²^,³ , Gemma Chiva-Blanch⁴^,⁵ , Olivia Belbin¹^,² , Sara Serrano-Requena¹^,² , Sònia Sirisi¹^,² , Alba Cervantes González¹^,² , Oriol Giró⁴^,⁵ , Érika Sánchez-Aced¹^,² , Oriol Dols-Icardo¹^,² , Daniel Alcolea¹^,² , María Carmona-Iragui¹^,² , Amanda Jimenez⁴^,⁵ , Alberto Lleó¹^,² , Juan Fortea¹^,² , M. Florencia Iulita¹^,²

¹Sant Pau Memory Unit, Department of Neurology, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Biomedical Research Institute Sant Pau, Universitat Autònoma de Barcelona, ²Center of Biomedical Investigation Network for Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), ³Movement Disorders Unit, Department of Neurology, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, ⁴Department of Endocrinology and Nutrition, Hospital Clínic de Barcelona, August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute - IDIBAPS, ⁵Spanish Biomedical Research Network in Physiopathology of Obesity and Nutrition (CIBEROBN)

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'arricchimento di vescicole extracellulari derivate da astrociti (ADEV) dal plasma umano. Si basa sulla separazione delle vescicole extracellulari mediante precipitazione polimerica, seguita dall'immunocattura degli ADEV basata su ACSA-1. L'analisi degli ADEV può offrire indizi per studiare i cambiamenti nelle vie infiammatorie dei pazienti viventi, in modo non invasivo mediante biopsia liquida.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle biologiche secrete da tutte le cellule per la comunicazione cellulare e l'eliminazione dei rifiuti. Partecipano a una vasta gamma di funzioni agendo e trasferendo i loro carichi ad altre cellule in condizioni fisiologiche e patologiche. Data la loro presenza nei biofluidi, le vescicole extracellulari rappresentano un'ottima risorsa per lo studio dei processi patologici e possono essere considerate una biopsia liquida per la scoperta di biomarcatori. Un aspetto interessante dell'analisi delle vescicole extracellulari è che possono essere selezionate in base ai marcatori della loro cellula di origine, riflettendo così l'ambiente di un tessuto specifico nel loro carico. Tuttavia, uno dei principali svantaggi legati ai metodi di isolamento delle vescicole extracellulari è la mancanza di consensi metodologici e protocolli standardizzati. Gli astrociti sono cellule gliali con ruoli essenziali nel cervello. Nelle malattie neurodegenerative, la reattività degli astrociti può portare a un'alterazione del carico di EV e a una comunicazione cellulare aberrante, facilitando/migliorando la progressione della malattia. Pertanto, l'analisi delle vescicole extracellulari degli astrociti può portare alla scoperta di biomarcatori e potenziali bersagli della malattia. Questo protocollo descrive un metodo in 2 fasi per l'arricchimento di EV derivate da astrociti (ADEV) da plasma umano. In primo luogo, le vescicole extracellulari sono arricchite da plasma defibrinato tramite precipitazione a base di polimeri. Segue l'arricchimento degli ADEV attraverso l'immunocattura basata su ACSA-1 con microsfere magnetiche, in cui le EV risospese vengono caricate su una colonna posta in un campo magnetico. Le EV ACSA-1+ marcate magneticamente sono trattenute all'interno della colonna, mentre altre EV fluiscono attraverso. Una volta rimossa la colonna dal magnete, gli ADEV vengono eluiti e sono pronti per la conservazione e l'analisi. Per convalidare l'arricchimento dei marcatori astrocitari, la proteina acida fibrillare gliale (GFAP), o altri marcatori astrocitici specifici di origine intracellulare, possono essere misurati nell'eluato e confrontati con il flow-through. Questo protocollo propone un metodo semplice ed efficiente in termini di tempo per arricchire gli ADEV dal plasma che può essere utilizzato come piattaforma per esaminare i marcatori rilevanti per gli astrociti.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono un gruppo eterogeneo di nanoparticelle membranose secrete da tutti i tipi di cellule, che trasportano proteine, lipidi e acidi nucleici¹. Le microvescicole (100-1000 nm), gli esosomi (30-100 nm) e i corpi apoptotici (1000-5000 nm) costituiscono i principali tipi di EV, distinti dal loro sito di origine ^2,3. Le vescicole extracellulari regolano importanti processi fisiologici, come la presentazione dell'antigene e le risposte immunitarie⁴, il riciclo dei recettori, l'eliminazione dei metabolit....