Questo protocollo descrive un approccio per facilitare modifiche precise knock-in negli embrioni di zebrafish utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Viene presentata una pipeline di fenotipizzazione per dimostrare l'applicabilità di queste tecniche per modellare una variante genetica associata alla sindrome del QT lungo.
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Articolo metodologico
Modifiche precise mediate da CRISPR-Cas9 nei cuori di zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) in modelli animali consentono una precisa manipolazione genetica per lo studio dei fenomeni fisiologici. I pesci zebra sono stati utilizzati come modello genetico efficace per studiare numerose domande relative alla malattia ereditaria, allo sviluppo e alla tossicologia a livello di intero organo e organismo. Grazie al genoma del pesce zebra ben annotato e mappato, sono stati sviluppati numerosi strumenti per l'editing genetico. Tuttavia, l'efficacia della generazione e la facilità di rilevare modifiche precise utilizzando CRISPR è un fattore limitante. Qui è descritto un approccio knock-in basato su CRISPR-Cas9 con la semplice rilevazione di modifiche precise in un gene responsabile della ripolarizzazione cardiaca e associato al disturbo elettrico, la sindrome del QT lungo (LQTS). Questo approccio a due RNA a guida singola (sgRNA) asporta e sostituisce la sequenza bersaglio e collega un gene reporter geneticamente codificato. L'utilità di questo approccio è dimostrata descrivendo misure fenotipiche non invasive della funzione elettrica cardiaca in larve di zebrafish wild-type e geneticamente modificate. Questo approccio consente lo studio efficiente delle varianti associate alla malattia in un intero organismo. Inoltre, questa strategia offre possibilità per l'inserimento di sequenze esogene di scelta, come geni reporter, ortologhi o editor di geni.
Introduzione
Le strategie di editing genetico basate su CRISPR in modelli animali consentono lo studio di malattie, sviluppo e tossicologia geneticamente ereditabili a livello dell'intero organismo 1,2,3. I pesci zebra forniscono un modello potente che è più vicino in numerosi aspetti fisiologici agli esseri umani rispetto ai modelli cellulari murini o derivati dall'uomo4. Una vasta gamma di strumenti e strategie genetiche sono stati utilizzati nel pesce zebra sia per lo screening genetico in avanti5 che per lo screenin....
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Protocollo
Gli studi che utilizzano il pesce zebra sono stati condotti in accordo con le politiche e le procedure del Simon Fraser University Animal Care Committee e del Canadian Council of Animal Care e sono stati completati secondo il protocollo # 1264K-18.
1. Progettazione di componenti CRISPR per modifiche precise
- Per progettare le guide a due sgRNA che verranno utilizzate per asportare la sequenza contenente il sito bersaglio KI, identificare prima l'ortologo del pesce zebra per il gene di interesse.
NOTA: la Figura 2 fornisce una panoramica riepilogativa dei passaggi per progettare modi....
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Risultati
L'uso di successo di questo approccio CRISPR di sostituzione dell'esone a due sgRNA è evidenziato dall'introduzione e dalla semplice rilevazione di una modifica precisa per ingegnerizzare la variante associata a LQTS, R56Q, nel gene zkcnh6a nel pesce zebra. La Figura 6 mostra una larva rappresentativa di 3 dpf iniettate allo stadio embrionale unicellulare con componenti CRISPR come descritto sopra. La Figura 6A mostra la presenza dell'espressione genica.......
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Discussione
L'ingegneria di precisi edit genetici utilizzando CRISPR-Cas9 è messa in discussione dalle basse efficienze dei meccanismi HDR e dal loro rilevamento efficiente. Qui, viene descritto un approccio di sostituzione dell'esone a due sgRNA basato su CRISPR-Cas9 che produce modifiche precise nel pesce zebra con rilevamento visivo diretto di modifiche positive. L'efficacia di questo approccio è dimostrata generando modifiche precise nel gene zkcnh6a . Questo articolo mostra come la funzione cardiaca nelle larve di zebr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione del Canadian Institutes of Health Research Project (T.W.C.) e dalle sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery (T.W.C.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | Istituto | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| Piastra a 24 pozzetti | VWR | ||
| Piastra di Petri da 25 mm | VWR | ||
| Blackfly USB3 Telecamera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Termociclatore | Bio-Rad | ||
| Centrifuga 5415C | Eppendorf | ||
| Kit di estrazione su gel EZNA Kit di trascrizione | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 | Incubatore Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 | Barnstead Lab Line | ||
| Qiagen | |||
| mMessage Kit di trascrizione mMachine T7 Ultra | Spettrofotometro | ||
| ND1000 | Kit | ||
| PCR | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Apparecchio Harvard PowerPac | ||
| Alimentatore di base | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscopio | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Sistema di elettroforesi | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing Sistema | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Sintesi genica | Genewiz | ||
| Sanger Sequenziamento | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Cellule competenti | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Miscela di nucleotidi | ABM | ||
| Ampicillina | Sigma | ||
| BamHI Endonucleasi con tampone | NEB | ||
| BsaI Endonucleasi con tampone | NEB | ||
| DR274 Plasmide (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonucleasi con tampone | NEB | ||
| Glicerolo | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonucleasi con tampone | NEB | ||
| Kanamicina | Sigma | ||
| Blu di metilene | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmide (XL1 Blu pugnalata di agar batterica) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaina) | Plasmide Sigma | ||
| pKHR5 (DH5&alfa; pugnalata di agar batterico) | Addgene | ||
| PmeI Endonucleasi con tampone | NEB | ||
| SalI Endonucleasi con tampone | NEB | ||
| Idrossido di sodio | Sigma | ||
| T4 Ligasi con tampone | Sigma | ||
| Taq Polimerasi | Qiagen | ||
| TE Tampone | Sigma | ||
| Tris cloridrato | Sigma | ||
| XhoI Endonucleasi con tampone | NEB | ||
| RICETTE | |||
| Solution | Fornitore | componenti | |
| Tampone di ricottura (pH 7,5-8,0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7,2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0,17 mM KCl | Sigma | ||
| 0,33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0,33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| tampone per iniezione (pH 7,5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
Riferimenti
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models.
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Ristampe e permessi
