Preparazione di una sospensione di cellule non cardiomiocitarie per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula da un cuore di topo adulto post-infarto miocardico

Chengchen Huang; Jiahe Han; Shuo Sun; Guosheng Fu; Min Shang

doi:10.3791/64290

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Articolo metodologico

Preparazione di una sospensione di cellule non cardiomiocitarie per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula da un cuore di topo adulto post-infarto miocardico

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DOI:

10.3791/64290

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3 febbraio 2023

Chengchen Huang¹^,² , Jiahe Han¹^,² , Shuo Sun¹^,² , Guosheng Fu^*¹^,² , Min Shang^*¹^,²

¹Key Laboratory of Cardiovascular Intervention and Regenerative Medicine of Zhejiang Province, ²Department of Cardiology, Sir Run Run Shaw Hospital, School of Medicine, Zhejiang University Hangzhou

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo per isolare una quantità sufficiente di singoli non cardiomiociti con elevata vitalità da un cuore di topo post-infarto miocardico (MI). Questo può essere utilizzato per il successivo sequenziamento di singole cellule, l'analisi della citometria a flusso e la coltura cellulare primaria.

Abstract

L'infarto miocardico (IM) è una delle malattie cardiovascolari più comuni, con un aumento della mortalità in tutto il mondo. I non cardiomiociti rappresentano oltre la metà della popolazione totale di cellule cardiache e contribuiscono alle compensazioni adattative in caso di lesioni miocardiche, comprese le risposte infiammatorie, la riparazione dei tessuti e la formazione di cicatrici. Per studiare il microambiente cardiaco post-MI, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) è ampiamente utilizzato per identificare diversi tipi di cellule cardiache e comunicazioni intercellulari. Tra le procedure di preparazione del campione di scRNA-seq, la preparazione della sospensione cellulare è uno dei passaggi più critici, perché la vitalità cellulare può influenzare la qualità dei risultati di scRNA-seq. Pertanto, abbiamo progettato un protocollo sperimentale per preparare una sospensione di cellule non cardiomiocitarie da cuori di topo post-MI con una particolare attenzione al miglioramento della vitalità cellulare scegliendo enzimi digestivi lievi, controllando il tempo di digestione e applicando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Infine, abbiamo isolato le cellule CD45+ dalla sospensione di cellule non ^{cardiomiocitarie} ottenuta attraverso questo protocollo, e quindi abbiamo eseguito scRNA-seq.

Introduzione

L'infarto miocardico (IM) è una delle malattie cardiovascolari più comuni e la sua mortalità aumenta in tutto il mondo¹. L'infarto miocardico è causato da un insufficiente apporto di sangue al miocardio circostante, che può essere il risultato di un blocco dell'arteria coronaria che si verifica con la rottura della placca aterosclerotica. Sebbene l'intervento coronarico percutaneo (PCI) abbia ridotto i tassi di mortalità dei pazienti con infarto miocardico acuto, l'alta prevalenza di insufficienza cardiaca post infarto miocardico rimane un problema². La fisiopatologia chiave alla base dell'insufficienza cardiaca post-MI ....