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Articolo metodologico

Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi di cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani

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DOI:

10.3791/64323

⸱

18 agosto 2022

 , 
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Translation Science Program, Morningside Graduate School of Biomedical Sciences, University of Massachusetts Chan Medical School

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il processo di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in cellule simili alle microglia per la sperimentazione in vitro . Includiamo anche una procedura dettagliata per generare sinaptosomi umani da motoneuroni inferiori derivati da iPSC che possono essere utilizzati come substrato per saggi di fagocitosi in vitro utilizzando sistemi di imaging di cellule vive.

Abstract

Le microglia sono le cellule immunitarie residenti di origine mieloide che mantengono l'omeostasi nel microambiente cerebrale e sono diventate un attore chiave in molteplici malattie neurologiche. Lo studio della microglia umana in salute e malattia rappresenta una sfida a causa della fornitura estremamente limitata di cellule umane. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da individui umani possono essere utilizzate per aggirare questa barriera. Qui, viene dimostrato come differenziare le iPSC umane in cellule simili alla microglia (iMG) per la sperimentazione in vitro . Queste iMG mostrano le proprietà attese e fisiologiche della microglia, compresa la morfologia simile alla microglia, l'espressione di marcatori appropriati e la fagocitosi attiva. Inoltre, viene fornita la documentazione per l'isolamento e l'etichettatura dei substrati di sinaptosomi derivati da motoneuroni inferiori derivati da iPSC umani (i3LMN). Un test di imaging longitudinale a cellule vive viene utilizzato per monitorare l'inghiottimento dei sinaptosomi umani marcati con un colorante sensibile al pH, consentendo indagini sulla capacità fagocitaria di iMG. I protocolli qui descritti sono ampiamente applicabili a diversi campi che stanno studiando la biologia della microglia umana e il contributo della microglia alle malattie.

Introduzione

Le microglia sono le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo del SNC. Le microglia sono anche importanti nel cervello adulto per mantenere l'omeostasi e rispondere attivamente ai traumi e ai processi patologici. Evidenze cumulative mostrano che le microglia sono fattori chiave per la patogenesi di molteplici malattie neuroevolutive e neurodegenerative 1,2. Sebbene le attuali conoscenze sulla biologia microgliale siano state prevalentemente derivate da modelli murini, studi recenti hanno chiarito importanti differenze tra microglia murina, sottolineando la necessità di sviluppare tecnologie per studiare la genetica e le funzioni biologiche della microglia umana 3,4. L'isolamento della microglia dal tessuto primario sezionato può modificare gravemente le proprietà della microglia5, potenzialmente confondendo i risultati acquisiti con tali cellule. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di differenziare le iPSC umane in iMG, fornendo così un sistema di coltura cellulare per studiare la microglia umana in condizioni basali. Inoltre, un test di fagocitosi che utilizza un sistema modello completamente umano è incluso nel presente documento come mezzo per studiare la funzionalità delle iMG, sia come misura di controllo della qualità che per valutare la disfunzione di iMG nel contesto della malattia.

Protocolli multipli per la differenziazione delle microglia dalle iPSC sono recentemente emersi in letteratura 6,7,8,9,10. I potenziali svantaggi di alcuni protocolli includono lunghi o prolungati periodi di differenziazione, l'aggiunta di più fattori di crescita e/o procedure sperimentali complesse 6,9,10. Qui viene dimostrato un metodo di differenziazione "user-friendly" che ricapitola aspetti dell'ontogenesi della microglia attraverso la differenziazione di iPSCs in cellule precursori denominate precursori primitivi dei macrofagi (PMP)7,11. I PMP vengono generati come descritto in precedenza, con alcune ottimizzazioni presentate qui12. I PMP imitano i macrofagi derivati dal sacco vitellino indipendenti da MYB, che danno origine alla microglia durante lo sviluppo embrionale invadendo il cervello prima della chiusura della barriera emato-encefalica13. Per differenziare terminalmente i PMP in iMG, abbiamo utilizzato un metodo di monocoltura veloce e semplificato basato sui protocolli di Haenseler et al. e Brownjohn et al., con alcune modifiche per generare un efficiente metodo di differenziazione della microglia in cui le iMG esprimono robustamente marcatori arricchiti di microglia 7,8. Questo metodo di differenziazione può essere riprodotto in laboratori con esperienza nella coltura di iPSC e con obiettivi di ricerca volti a studiare la biologia delle microglia utilizzando un sistema modello umano.

Le microglia derivate da iPSC rappresentano una fonte biologicamente rilevante di microglia umana per la sperimentazione in vitro e sono uno strumento importante per studiare le funzioni canoniche microgliali, compresa la fagocitosi. Le microglia sono i fagociti professionali del cervello e del SNC, dove eliminano i detriti cellulari, le proteine aggregate e la mielina degradata14. Le microglia funzionano anche nel rimodellamento sinaptico inghiottendo le sinapsi e nella difesa contro le infezioni esterne attraverso la fagocitosi dei patogeni15,16. In questo protocollo, la fagocitosi da parte di iMG viene valutata utilizzando sinaptosomi umani come materiale per l'inghiottimento di iMG. A tal fine, viene descritta una descrizione per isolare i sinaptosomi derivati da i3LMN umani. I sinaptosomi umani derivati da i3LMN sono marcati con un colorante sensibile al pH che consente la quantificazione dei sinaptosomi localizzati all'interno di compartimenti acidi durante l'elaborazione e la degradazione dei fagosomi in vitro. Viene mostrato un test di fagocitosi utilizzando la microscopia a cellule vive per monitorare il processo dinamico di inghiottimento della microglia in tempo reale. Questo test funzionale stabilisce una base per studiare possibili difetti nella fagocitosi microgliale in salute e malattia utilizzando un sistema umano completo.

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Protocollo

NOTA: Tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo devono essere sterili e tutte le fasi devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza in condizioni sterili. Tutte le linee iPSC, così come i mezzi di manutenzione e differenziazione, sono descritti nella Tabella dei Materiali. Il metodo di differenziazione delle microglia illustrato di seguito si basasui protocolli 7,8,12 precedentemente pubblicati con nuove modifiche qui descritte.

1. Differenziazione delle microglia

NOTA: una panoramica del protocollo è riepilogata nella Figura 1.

  1. Coltura di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)
    NOTA: Ulteriori dettagli che descrivono le tecniche di coltura iPSC sono disponibili altrove17.
    1. Scongelamento e manutenzione
      1. Preparare il terreno iPSC, aliquote del terreno e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Scongelare le aliquote per una notte a 4 °C e utilizzarle per un massimo di 1 settimana. Lasciare il fluido a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.
      2. Rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti aggiungendo 1 mL di 10 μg/mL di laminina 521 diluita in DPBS contenente calcio e magnesio18. Conservare le piastre in un'incubatrice a 37 °C e al 5% di CO 2 per almeno2 ore o preferibilmente durante la notte. Una volta diluita, conservare la laminina a 4 °C per 3 mesi.
      3. Preparare 10 mM di soluzione madre di inibitore della chinasi Rho chinasi Y27632 (inibitore ROCK) diluendo in acqua sterile. Produrre aliquote monouso della soluzione inibitrice di ROCK e conservarle a -20 °C per un massimo di 1 anno.
      4. Preparare 0,5 mM EDTA diluendo la soluzione madre di 0,5 M EDTA in DPBS.
      5. Per scongelare un flaconcino di iPSC congelate, porre il flaconcino a bagnomaria a 37 °C fino a quando non è per lo più scongelato. Trasferire immediatamente il contenuto del flaconcino in un tubo conico da 15 mL contenente 4 mL di mezzo iPSC. Centrifugare a 500 × g per 1 min.
      6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo 1 mL di mezzo iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK lentamente contro la parete del tubo per evitare il disturbo delle colonie.
      7. Aggiungere 1,5 mL di mezzo iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK a ciascuno dei pozzetti rivestiti e trasferire le colonie risospese goccia a goccia ai pozzetti contenenti il mezzo.
        NOTA: Utilizzare 5-7 gocce dal punto 1.1.1.6 per il mantenimento della coltura, ma regolare la densità di semina ottimale per ogni linea iPSC.
      8. Distribuire uniformemente le celle nei pozzetti mescolando manualmente la piastra da un lato all'altro e da dietro a davanti. Posizionare le celle in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2. Il giorno successivo, sostituire completamente il terreno aggiungendo un nuovo mezzo iPSC senza inibitore ROCK.
      9. Per il mantenimento, cambiare il mezzo ogni giorno fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.
        NOTA: Le celle possono essere mantenute senza cambiare il terreno per 2 giorni se il mezzo iPSC utilizzato consente un programma di alimentazione flessibile. Si consiglia di limitare questo a una volta per passaggio e solo se le cellule sono meno del 50% confluenti.
    2. Emicranico
      1. Aspirare il mezzo e lavare le cellule con 1 mL di DPBS (senza calcio e magnesio).
      2. Per rimuovere le cellule, aggiungere 1 mL di 0,5 mM EDTA e incubare per 2-3 minuti a temperatura ambiente fino a quando i bordi delle colonie cellulari si sollevano dalla superficie del pozzetto. Lavare nuovamente le celle con DPBS e aggiungere 1 mL di mezzo iPSC.
      3. Dissociare le colonie cellulari raschiandole delicatamente usando un sollevatore cellulare. Raschiare ogni area del pozzo solo una volta per evitare di disturbare le colonie.
        NOTA: Metodi alternativi per rimuovere le colonie dal pozzo possono essere trovati altrove17.
      4. Utilizzando una punta per pipetta da 1 ml, raccogliere le cellule e trasferirle goccia a goccia in rapporto 1:6 (cellule e mezzo) in pozzetti prepatinati (come indicato al punto 1.1.1.2) contenenti 1,5 mL di mezzo iPSC.
  2. Differenziazione iPSC in cellule simili alla microglia (iMG)
    NOTA: Le piccole molecole e i fattori di crescita sono disciolti in albumina sierica bovina allo 0,1% filtrata sterile in DPBS a una concentrazione di riserva 1.000 volte superiore alla concentrazione finale. Si raccomanda di differenziare le iPSC in iMG durante i primi passaggi. Si consiglia il cariotipo di routine delle linee iPSC.
    1. Preparare la soluzione di rivestimento standard
      1. Scongelare la soluzione madre di un reagente di rivestimento della matrice extracellulare su ghiaccio a 4 °C durante la notte.
      2. Prechill tubi per microcentrifuga e punte di pipette filtranti a 4 °C.
      3. Aliquot 250 μL del reagente di rivestimento concentrato della matrice extracellulare in ciascuna provetta e posto immediatamente su ghiaccio. Conservare le aliquote a -20 °C.
      4. Per preparare la soluzione di rivestimento, scongelare una delle aliquote del reagente di rivestimento della matrice extracellulare sul ghiaccio a 4 °C durante la notte.
      5. Aggiungere 50 ml di DMEM-F12 ghiacciato ottimizzato per la crescita di cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte (indicato come DMEM-F12) in un tubo conico prerefrigerato e tenerlo in ghiaccio.
      6. Raffreddare una punta di pipetta da 1 mL pipettando più volte DMEM-F12 ghiacciato su e giù, quindi utilizzare immediatamente la punta della pipetta per trasferire 250 μL del reagente di rivestimento della matrice extracellulare nel tubo conico contenente il mezzo DMEM-F12.
        NOTA: La soluzione di rivestimento standard può essere conservata per 2 settimane a 4 °C.
    2. Formazione del corpo embrioide (EB)
      1. Preparare il terreno EB che può essere mantenuto a 4 °C per un massimo di 4 giorni.
      2. Una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, dissociare le colonie lavando con 1 mL di DPBS e aggiungendo 1 mL di un reagente di dissociazione per 2 minuti a 37 °C. Rimuovere le colonie utilizzando un sollevatore di cellule raschiando più volte per creare una sospensione a cella singola. Raccogliere le cellule e trasferire tutto in un tubo conico da 15 mL contenente 9 mL di DPBS.
      3. Centrifugare le cellule a 500 × g per 1 minuto, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di mezzo EB. Prendere 10 μL di cellule e diluire 1:1 con Trypan blue. Contare le cellule con un ematocitometro e, in base al numero di cellule, diluire lo stock cellulare fino a una diluizione finale di 10.000 cellule per 100 μL. Per le celle di placcatura, aggiungere 100 μL delle celle diluite per pozzetto in una piastra a bassa aderenza, a fondo arrotondato, a 96 pozzetti.
        NOTA: Generalmente, 48 pozzetti della piastra a 96 pozzetti possono essere ottenuti da ciascun pozzo confluente all'80% di iPSC.
      4. Centrifugare la piastra a 125 × g per 3 minuti e incubare a 37 °C e 5% CO2 per 4 giorni. Eseguire un cambio medio-medio il giorno 2 utilizzando una pipetta multicanale e raccogliendo delicatamente 50 μL di vecchio fluido, quindi aggiungendo 50 μL di terreno EB fresco.
        NOTA: Il giorno 4, le iPSC formeranno strutture cellulari sferiche denominate EB come descritto nella sezione dei risultati. Il processo di differenziazione EB può essere esteso fino a 7 giorni, se necessario.
    3. Generazione di precursori primitivi dei macrofagi (PMP)
      1. Preparare il terreno base PMP, filtrare sterile e conservarlo a 4 °C per un massimo di 1 mese.
      2. Rivestire i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti aggiungendo 1 ml di soluzione di rivestimento Matrigel ghiacciata e incubare a 37 °C e 5% di CO 2 per almeno2 ore o preferibilmente durante la notte.
      3. Il giorno 4 della differenziazione EB, trasferire gli EB nei pozzetti rivestiti Matrigel raccogliendo gli EB con 1 mL di punte per pipette (usando una pipetta). Pipettare su e giù una o due volte per rimuovere gli EB dal pozzo. Tenere la piastra a 6 pozzetti con un angolo inclinato per consentire agli EB di depositarsi sul bordo del pozzo.
        NOTA: nove o dieci EB possono essere placcati per pozzetto rivestito.
      4. Una volta che tutti gli EB si sono sistemati, pipettare delicatamente e rimuovere il vecchio mezzo utilizzando una punta di pipetta da 1 mL mantenendo gli EB sul bordo del pozzetto. Aggiungere 3 ml di terreno completo PMP appena preparato a ciascun pozzetto. Distribuire uniformemente le celle nei pozzetti mescolando manualmente la piastra da un lato all'altro e da dietro a davanti. Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
      5. Non disturbare la piastra per 7 giorni per consentire agli EB di attaccarsi al fondo del pozzo. Dopo tale periodo, eseguire una modifica semi-media utilizzando il mezzo completo PMP.
        NOTA: A questo punto, la maggior parte degli EB deve essere attaccata alla piastra. Qualsiasi EB galleggiante può essere rimosso.
      6. Dopo 5-7 giorni, ispezionare gli EB al microscopio a campo luminoso con ingrandimento 4x per assicurarsi che siano attaccati al fondo dei pozzetti. Modificare il supporto come descritto al punto 1.2.3.5. Il giorno 21, eseguire un cambio completo del mezzo con 3 ml di terreno completo PMP.
        NOTA: I progenitori mieloidi che galleggiano nel mezzo possono essere evidenti a questo punto. Queste celle devono essere scartate durante il cambio del mezzo.
      7. Il giorno 28, cercare celle rotonde denominate PMP nel surnatante e raccogliere il mezzo contenente i PMP utilizzando una pipetta da 10 ml e un pipettatore automatico. Fare attenzione a non disturbare gli EB. Trasferire i PMP e il mezzo in un tubo conico da 15 mL e procedere come descritto al punto 1.2.4.
        NOTA: Di solito i PMP della stessa linea iPSC possono essere raccolti da cinque pozzetti di una piastra a 6 pozzetti e raggruppati insieme in un singolo tubo conico da 15 ml.
      8. Aggiungere 3 ml di PMP fresco completo per un'ulteriore manutenzione degli EB. Poiché i PMP emergono continuamente dagli EB per più di 3 mesi, raccoglierli ogni 4-7 giorni (non consentire al mezzo di cambiare colore in un tono giallo) come descritto nei passaggi 1.2.3.7 e 1.2.3.8.
        NOTA: Sebbene i PMP possano essere raccolti per diversi mesi, possono cambiare il loro fenotipo nel tempo.
    4. Differenziazione rispetto alle iMG
      1. Preparare il terreno base iMG (Table of Materials), filtrare sterile e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
      2. Una volta raccolti i PMP in una provetta conica da 15 ml, centrifugarli a 200 × g per 4 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere i PMP utilizzando 1-2 mL di mezzo basale iMG. Contare le cellule utilizzando un emocitometro prendendo una piccola aliquota e diluendo 1:1 con Trypan blue.
        NOTA: 0,5-1,5 × 106 PMP sono normalmente ottenuti ogni settimana a seconda della linea iPSC e dell'età della cultura EB.
      3. Centrifugare nuovamente il resto delle cellule a 200 × g per 4 minuti. Diluire i PMP alla concentrazione desiderata in modo tale che le cellule siano placcate ad una densità di ~105/cm2 su piastre trattate con colture cellulari utilizzando il mezzo completo iMG appena preparato. Eseguire un cambio medio-medio utilizzando il mezzo completo iMG appena preparato ogni 3-4 giorni per 10-12 giorni per consentire la differenziazione terminale.
        NOTA: A questo punto, le cellule dovrebbero acquisire morfologia simile alla microglia. Per confermare l'impegno delle PMP nel destino delle microglia, viene eseguita un'analisi di immunofluorescenza per corroborare l'espressione di marcatori arricchiti di microglia come il recettore purinergico P2RY12 e la proteina transmembrana 119 (TMEM119)9.
      4. Per preservare la salute e la vitalità cellulare, eseguire tutti gli esperimenti tra i giorni 10 e 12 della differenziazione iMG.

2. Saggio di fagocitosi utilizzando sinaptosomi umani derivati da motoneuroni

  1. Differenziazione mediata dal fattore di trascrizione dei motoneuroni inferiori derivati da iPSC (i3LMN)
    NOTA: Per il processo di differenziazione è stata utilizzata una linea WTC11 con inserimento stabile della cassetta del fattore di trascrizione inducibile hNIL contenente i fattori di trascrizione neurogenina-2 (NGN2), isol-1 (ISL1) e LIM homeobox 3 (LHX3) nel locus Safe Harbor CLYBL17. La linea iPSC è stata mantenuta come descritto al punto 1.1.1, ma con le condizioni di rivestimento descritte nella fase 1.2.1. Qualsiasi reagente di rivestimento della matrice extracellulare può essere utilizzato per la coltura di iPSC che verranno utilizzate per la differenziazione neuronale poiché la laminina 521 non è richiesta. Tutti i fluidi sono equilibrati a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.
    1. Rivestire i piatti di 10 cm con 5 ml di soluzione di rivestimento standard come descritto al punto 1.2.1.
      NOTA: Qui, sono stati utilizzati 3-4 piatti da 10 cm per differenziazione.
    2. Preparare il mezzo Induction Base, filtrare sterilemente e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
    3. Preparare il mezzo Neuron, filtrare sterilemente e conservarlo a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
    4. Preparare il tampone borato mescolando 100 mM di acido borico, 25 mM di tetraborato di sodio e 75 mM di cloruro di sodio in acqua sterile. Regolare il pH a 8,5 e filtrarlo sterilemente.
    5. Una volta che le iPSC hanno raggiunto l'80% di confluenza, lavare le cellule con DPBS e rimuovere le colonie aggiungendo 0,5 mM di EDTA.
      NOTA: Due pozzetti sono generalmente sufficienti per ogni piatto di 10 cm.
    6. Incubare le cellule per 4-5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'EDTA e aggiungere 3 ml di DMEM/F12 con HEPES a ciascun pozzetto.
    7. Raschiare le cellule usando un sollevatore di celle e utilizzare una pipetta da 10 ml per rimuovere le cellule dal fondo del pozzetto pipettando delicatamente su e giù 2-3 volte.
    8. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 3 minuti.
    9. Risospendere le cellule in 3 mL di mezzo iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK e contarle utilizzando un emocitometro.
    10. Piastra 1,5 × 106 iPSC in un piatto prerivestito da 10 cm con 12 mL di terreno iPSC contenente 10 μM di inibitore ROCK.
    11. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con DPBS. Aggiungere 12 ml di mezzo di induzione completa appena preparato per indurre l'espressione dei fattori di trascrizione.
    12. Il giorno 2, rivestire piatti di 10 cm con 5 ml di soluzione di rivestimento neuronale preparata con volumi uguali di 0,1 mg / ml di poli-D-lisina e 1 mg / ml di poli-L-ornitina diluita in tampone borato. Incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO2.
    13. Il giorno 3, lavare i piatti rivestiti con acqua sterile 3x, aspirare completamente l'acqua e lasciare asciugare i piatti inclinando le piastre e lasciandole parzialmente scoperte all'interno di un armadio di biosicurezza per almeno 1 ora a temperatura ambiente.
    14. Una volta che le stoviglie sono completamente asciutte, ricoprirle con 6 ml di terreno di induzione completa integrato con 15 μg/ml di laminina e 40 μM di BrdU per almeno 1 ora a 37 °C e 5% di CO2.
      NOTA: Il trattamento con BrdU è raccomandato per eliminare le cellule mitoticamente attive e quindi per migliorare la purezza delle colture neuronali. Gli effetti di BrdU sulla salute neuronale sono minimi.
    15. Trattare le cellule differenzianti con 3 ml di reagente di dissociazione per piatto da 10 cm e incubare per 3-4 minuti a temperatura ambiente.
    16. Aggiungere 6 mL di DPBS nella piastra senza rimuovere il reagente di dissociazione e pipettare le cellule in soluzione su e giù 4-5 volte con una pipetta da 10 mL per dissociare le cellule.
    17. Raccogliere la sospensione cellulare e farla passare attraverso un filtro cellulare da 40 μm in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 1 mL di base a induzione per risciacquare il colino.
    18. Centrifugare le cellule a 300 × g per 5 minuti. Aspirare il mezzo e risospendere le cellule in 3 mL di mezzo di induzione completa contenente 40 μM BrdU.
    19. Contare le cellule con un emocitometro. Placcare circa 2,5 × 10 6 celle per piatto da 10 cm in piatti prepatinati diluendo le celle in6 ml di mezzo di induzione completa contenente 40 μM di BrdU senza rimuovere la soluzione di rivestimento aggiunta al punto 2.1.14.
    20. Il giorno 4, aspirare il fluido, lavare le celle 1x con DPBS e aggiungere un nuovo mezzo di induzione completa contenente 40 μM di BrdU.
    21. Il giorno 6, aspirare il substrato, lavare le cellule 1x con DPBS e aggiungere Neuron medium integrato con 1 μg / mL di laminina.
    22. Al giorno 9, cambiare 1/3del terreno sostituendolo con Neuron medium fresco integrato con 1 μg/mL di laminina.
    23. Mantenere i 3 LMN per altri 25 giorni eseguendo cambiamenti di mezzo medio con Neuron medium integrato con 1 μg/mL fresco di laminina ogni3-4giorni.
      NOTA: In questo momento, i3LMN dovrebbero presentare una morfologia neuronale con processi lunghi. I neuroni tendono anche a formare grumi o gruppi di cellule. Una descrizione più dettagliata di come convalidare la differenziazione di i3LMN può essere trovata altrove17.
  2. Purificazione ed etichettatura dei sinaptosomi
    NOTA: Mantenere condizioni sterili ed eseguire tutte le fasi all'interno di un armadio di biosicurezza.
    1. Lavare i3 LMN due volte con DPBS.
    2. Aggiungere 2 ml di reagente di lisi cellulare ghiacciato per l'isolamento dei sinaptosomi, incubare sul ghiaccio per 2 minuti e raschiare saldamente i neuroni.
    3. Trasferire il lisato in più microtubi da 2 mL (~1,5 mL di lisato per provetta) e centrifugare a 1.200 × g per 10 minuti a 4 °C.
      NOTA: Mantenere i tubi sul ghiaccio durante questa procedura.
    4. Raccogliere il surnatante (scartare il pellet) e centrifugare a 15.000 × g per 20 minuti a 4 °C. Salvare e risospendere il pellet contenente i sinaptosomi con un volume simile (come il lisato originale) del 5% di DMSO in DPBS.
      NOTA: I sinaptosomi possono essere immediatamente marcati con un fluoroforo o conservati a -80 °C per un uso futuro.
    5. Eseguire un test proteico dell'acido bicinconinico (BCA) per tutte le provette per valutare la resa totale di proteine nella preparazione del sinaptosoma.
      NOTA: Possono essere utilizzati altri test per misurare la concentrazione proteica. La resa proteica totale ottenuta da diversi preparati è stata inclusa nella tabella 1 come riferimento. Si raccomanda di eseguire l'analisi western blot della preparazione del sinaptosoma per confermare la presenza di proteine presinaptiche e postsinaptiche. Qui, il marcatore presinaptico, sinaptofisina (SYP), e il marcatore postsinaptico, la proteina di densità postsinaptica 95 (PSD95) sono stati scelti per l'analisi western blotting come descritto in precedenza19.
    6. Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio 100 mM in acqua, regolare il pH a 8,5 e filtrare sterile.
    7. Solubilizzare 1 mg di polvere liofilizzata del colorante pH sensibile utilizzato in 150 μL di DMSO. Fabbricare aliquote monouso e conservarle a -80 °C.
    8. Centrifugare i sinaptosomi a 15.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
    9. Diluire fino a 1 mg di sinaptosomi in 100 μL di soluzione di bicarbonato di sodio 100 mM.
    10. Per etichettare i sinaptosomi, aggiungere 1 μL del colorante ricostituito sensibile al pH per 1 mg di sinaptosomi e coprire la reazione con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Agitare a temperatura ambiente per 2 ore utilizzando uno scuotitubo.
    11. Aggiungere 1 mL di DPBS alla provetta e centrifugare i sinaptosomi marcati a 15.000 × g per 5 minuti a 4 °C.
    12. Rimuovere il surnatante ed effettuare quattro lavaggi supplementari come descritto al punto 2.2.11.
    13. Dopo il lavaggio finale e la centrifuga, rimuovere il surnatante il più possibile senza disturbare il pellet e risospendere i sinaptosomi marcati con DMSO al 5% in DPBS ad un volume per la concentrazione desiderata (0,7 μg / μL utilizzati qui). Preparare aliquote monouso e conservare a -80 °C. Assicurati di evitare l'esposizione alla luce ai sinaptosomi etichettati.
  3. Saggio di fagocitosi su cellule vive
    1. Piastra 20-30 × 10 4 PMP in piastre da 96 pozzetti in 100 μL di mezzo completo iMG e seguire il processo di differenziazione per 10 giorni come indicato al punto 1.2.4.
    2. Il giorno del test, preparare la soluzione di colorazione nucleare aggiungendo 1 goccia di una macchia nucleare per cellule vive in 2 ml di mezzo basale iMG.
    3. Rimuovere 40 μL di mezzo per pozzetto della piastra a 96 pozzetti e aggiungere 10 μL della soluzione di colorazione nucleare utilizzando una pipetta multicanale. Incubare la piastra a 37 °C e 5% CO 2 per2 ore.
    4. Scongelare i sinaptosomi etichettati sul ghiaccio e sonicare delicatamente usando un sonicatore ad acqua per 1 minuto. Trasferire immediatamente i sinaptosomi al ghiaccio. Diluire i sinaptosomi marcati nel mezzo completo iMG con un rapporto di 1 μL di sinaptosomi per 50 μL di terreno.
      NOTA: La concentrazione del sinaptosoma dipende dal saggio e può richiedere un'ottimizzazione. Per mantenere una percentuale relativamente bassa (cioè lo 0,1% o meno) di DMSO nel mezzo, si consiglia di non aggiungere più di 2 μL di sinaptosomi per pozzetto.
    5. Come controllo negativo, pretrattare alcuni dei pozzetti con citocalasina D per inibire la polimerizzazione dell'actina e quindi la fagocitosi. Preparare una soluzione di 60 μM di citocalasina D nel mezzo completo iMG. Aggiungere 10 μL di questa soluzione in ciascun pozzetto per una concentrazione finale di 10 μM e incubare a 37 °C e 5% di CO2 per 30 min.
    6. Togliere la piastra dall'incubatore e incubare a 10 °C per 10 minuti. Mantenere la piastra su ghiaccio e aggiungere 50 μL di terreno contenente sinaptosomi preparati come descritto al punto 2.3.4.
    7. Centrifugare la piastra a 270 × g per 3 minuti a 10 °C e mantenere la piastra su ghiaccio fino all'acquisizione dell'imaging.
  4. Acquisizione e analisi delle immagini
    1. Inserire la piastra in un lettore di imaging a cellule vive e selezionare i pozzetti da analizzare.
    2. Selezionare un obiettivo 20x .
    3. Regolare la messa a fuoco, l'intensità del diodo a emissione luminosa (LED), il tempo di integrazione e il guadagno dei canali brightfield e blu (4',6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI]). La fluorescenza del sinaptosoma dovrebbe essere trascurabile al momento iniziale. Per mettere a fuoco il canale rosso (RFP), utilizzare il canale campo luminoso come riferimento. Il tempo e il guadagno di integrazione possono variare tra gli esperimenti; utilizzare queste impostazioni iniziali per il canale rosso: LED: 4, tempo di integrazione: 250 e guadagno: 5.
    4. Selezionare il numero di singole tessere da acquisire in un montaggio per pozzetto (acquisire 16 tessere al centro del pozzo, visualizzando così circa il 5% dell'area totale del pozzo). Impostare la temperatura su 37 °C e l'intervallo di tempo desiderato per l'imaging.
      NOTA: Le immagini sono state acquisite ogni 1 - 2 ore per un massimo di 16 ore in questo studio.
    5. Aprire il software di analisi.
      1. Apri l'esperimento che contiene le immagini. Fare clic sull'icona Riduzione dati.
      2. Nel menu, selezionate Cucitura immagini in Elaborazione immagini per creare un'immagine completa dalle singole porzioni 4 x 4 nel montaggio con i parametri descritti nella Tabella 2.
      3. Una volta create le immagini cucite, definire una soglia di intensità utilizzando i canali DAPI e RFP per queste immagini. Apri un'immagine e fai clic su Analizza; In Analisi selezionare Analisi cellulare e in Canale di rilevamento selezionare un'immagine cucita nei canali DAPI o RFP. Vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e stabilisci un valore di soglia e valori di dimensione dell'oggetto che selezionano correttamente i nuclei cellulari nel canale DAPI o il segnale del sinaptosoma nel canale RFP. Ripeti il processo con immagini diverse fino a quando i parametri che possono essere applicati all'intero esperimento non vengono ottimizzati.
        NOTA: i valori suggeriti sono riportati nella Tabella 2.
      4. Per contare il numero di nuclei, vai al menu Riduzione dati e, in Analisi immagine, seleziona Analisi cellulare. Vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e in Canale, seleziona le immagini cucite DAPI e usa i parametri descritti nella Tabella 2.
      5. Vai alla scheda Metriche calcolate e seleziona Conteggio celle. Per ottenere l'area del segnale del sinaptosoma, vai al menu Riduzione dati e in Analisi, seleziona Analisi cellulare.
      6. Vai alla scheda Maschera primaria e conteggio e in Canale, seleziona Immagini cucite RFP e usa i parametri dettagliati nella Tabella 2.
      7. Vai alla scheda Metriche calcolate e seleziona Area somma oggetti. Nella scheda Riduzione dati , fare clic su OK e consentire al software di analizzare tutte le immagini acquisite.
      8. Esportare i valori Area somma oggetti e Conteggio celle per ogni punto temporale. Dividere l'area della somma degli oggetti per il conteggio delle celle per calcolare l'area normalizzata per punto temporale. Se si confrontano più trattamenti o genotipi, calcolare l'indice di fagocitosi utilizzando l'equazione (1):
        figure-protocol-1 (1)
      9. Salvare i risultati e integrare i dati.

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Risultati

Per generare iMG utilizzando questo protocollo, è importante iniziare con iPSC indifferenziate che mostrano una morfologia compatta della colonia con bordi ben definiti (Figura 2A). Le iPSC dissociate mantenute come descritto nella sezione sulla formazione di EB formeranno aggregati sferici, chiamati EB, che cresceranno di dimensioni fino al giorno 4 della differenziazione (Figura 2B). Una volta che gli EB sono stati raccolti e placcati nelle condizioni appropri...

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Discussione

Il protocollo di differenziazione qui descritto fornisce un metodo efficiente per ottenere cellule simili a microglia derivate da iPSC in ~ 6-8 settimane con elevata purezza e in una resa sufficiente per eseguire esperimenti di immunofluorescenza e altri test che richiedono un numero maggiore di cellule. Questo protocollo ha prodotto fino a 1 × 106 iMG in 1 settimana, il che consente l'estrazione di proteine e RNA e le corrispondenti analisi a valle (ad esempio, RNASeq, qRT-PCR, western blot, spettrometria di ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Michael Ward per aver fornito la linea WTC11 hNIL iPSC per il differenziamento dei motoneuroni e i Jackson Laboratories per aver fornito la linea iPSC del clone KOLF2.1J WT B03 utilizzata per il differenziamento delle microglia. Ringraziamo anche Dorothy Schafer per il suo supporto durante l'implementazione dei protocolli, Anthony Giampetruzzi e John Landers per il loro aiuto con il sistema di imaging delle cellule vive, nonché Hayden Gadd per i suoi contributi tecnici durante le revisioni e Jonathan Jung per la sua collaborazione in questo studio. Questo lavoro è stato supportato dal Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience della UMASS Chan Medical School e dall'Angel Fund, Inc.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpi per analisi in immunofluorescenza
anti-IBA1 anticorpo di coniglioWako Chemical USANC9288364diluizione 1:350
anticorpo di coniglioSigma-AldrichHPA014518diluizione 1:50
anticorpo di coniglioSigma-AldrichHPA051870 diluizione 1:50 Sigma-Aldrich diluizione
1:100Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibodyAbcamab6046diluizione 1:500
anticorpo di coniglio anti-sinaptofisina (SYP)AbclonalA6344diluizione 1:1.000
anticorpo di topoMilliporeMAB1596diluizione 1:500
Borate buffer componenti
Acido borico (100 mM)SigmaB6768
Bicarbonato di sodio (NaHCO3) BioXtraSigma-AldrichS6297-250G
Cloruro di sodio (75 mM)Sigma  S7653
Tetraborato di sodio (25 mM)Sigma221732
Materiali per colture cellulari
Piastre a 6 pozzettiGreiner Bio-One657160
40 μ m Filtri cellulari  Falcon352340
100 mm x 20 mm Trattato per colture tissutaliCELLTREAT229620
Sollevatore cellulare, doppia estremità, lama piatta e Lama stretta, sterileCELLTREAT229305
piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a bassa aderenzaCorning7007
Primaria Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti a fondo piatto modificata a superficie Corning353847,
Primaria Piastra per coltura multipozzetto a fondo piatto a fondo piatto trasparente a 6 pozzettiCorning353846
Primaria a 96 pozzetti Clear Flat Inferiore MicropiastraCorning353872
Reagenti per dissociazione cellulare
Accutasi  Corning25058CIreagenti di dissociazione utilizzati per la differenziazione inferiore dei motoneuroni
Reagente TrypLETechnologies12-605-010reagenti di dissociazione utilizzati per la differenziazione della microglia
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
Reagenti di rivestimento per colture cellulari
Matrigel GFR Matrice a membranaCorning™354230Riferito al reagente di rivestimento della matrice extracellulare
CellAdhere Laminin-521Tecnologia STEMCELL77004Riferito alla laminina 521
Poli-D-lisinaSigmaP7405Ricostituito a 0,1 mg/mL in tampone borato
Poli-L-OrnitinaSigma  P3655Ricostituire a 1 mg/mL in tampone borato
Componenti dei terreni iPSC
  Kit mTeSR PlusTecnologia STEMCELL100-0276Per preparare i terreni iPSC miscelato i componenti a 1x
Componenti dei terreni EB
BMP-4Fisher ScientificPHC9534finale 50 ng/mL
iPSCconcentrazione finale 1x
Inibitore ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822concentrazione finale 10 µ M
SCFPeproTech300-07concentrazione finale 20 ng/mL
VEGFPeproTech100-20Aconcentrazione finale 50 ng/mL
Componenti del terreno base PMP
GlutaMAXGibco 35050061concentrazione finale 1x
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Concentrazione finale Gibco15140122100 U/mL
X-VIVO 15Lonza12001-988concentrazione finale 1x
Componenti di PMP terreno completo
55 mM 2-mercaptoetanoloGibco21985023concentrazione finale 55 µ M
IL-3PeproTech200-03concentrazione finale 25 ng/mL
M-CSFPeproTech300-25concentrazione finale 100 ng/mL
PMP terreno di base concentrazione finale 1x
Componenti del terreno di base iMG
Advanced DMEM/F12Gibco12634010concentrazione finale 1x
GlutaMAXGibco 35050061concentrazione finale 1x
integratore di N2, 100xGibco17502-048concentrazione finale 1x
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122concentrazione finale 100 U/mL
Componenti del terreno completo iMG
55 mM 2-mercaptoetanoloGibco21985023concentrazione finale 55 &; micro; M
IL-34PeproTech o Biologend200-34 o 577904concentrazione finale 100 ng/mL
iMG terreno baseconcentrazione finale 1x
M-CSFPeproTech300-25concentrazione finale 5 ng/mL
TGF-βPeproTech100-21concentrazione finale 50 ng/mL
Componenti del terreno di base a induzione
DMEM/F12 con HEPESGibco 11330032concentrazione finale 1x
GlutaMAXGibco35050061concentrazione finale 1x
integratore di N2, 100xGibco17502-048final concentrazione 1x
Aminoacidi non essenziali (NEAA), 100xGibco11140050concentrazione finale 1x
Componenti del mezzo di induzione completo
Composto ECalbiochem565790concentrazione finale 0,2 μ M e ricostituire il reagente stock a 2 mM in etanolo 1:1 e DMSO
DoxiciclinaSigmaD9891concentrazione finale 2 μ g/mL e ricostituire il reagente stock a 2 mg/mL in DPBS
Induction base mediaconcentrazione finale 1x
inibitore ROCK Y27632Fisher ScientificBD 562822concentrazione finale 10 μ M
Componenti di Neuron media
B-27 Plus Sistema di coltura neuronaleGibcoA3653401concentrazione finale 1x per terreni e complementi
GlutaMAXGibco 35050061concentrazione finale 1x
integratore di N2, 100xGibco17502-048concentrazione finale 1x
Aminoacidi non essenziali (NEAA), 100xGibco11140050concentrazione finale 1x
linee iPSC utilizzate in questo studio
KOLF2.1J: Clone WT B03The Jackson Laboratories
WTC11 hNILNational Institute of Health
Reagenti per l'isolamento del sinaptosoma
Kit per il dosaggio delle proteine BCAThermo Scientific Pierce23227
dimetilsolfossido (DMSO)SigmaD2650
Syn-PER Reagente per l'estrazione di proteine sinapticheThermo Scientific87793Riferito come reagente per la lisi cellulare per l'isolamento di coloranti per il test di sinaptosomi
fagocitosi
Reagente NucBlue Live ReadyInvitrogen  R37605
pHrodo Rosso, estere succinimidilicoThermoFisher Scientific  P36600Riferito a colorante sensibile al pH
Altri reagenti per colture cellulari
Trypan Blue, soluzione allo 0,4%AMRESCO INCK940-100ML
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma22144-77-0
BrdUSigmaB9285Ricostituire a 40 mM in acqua sterile
Citocalasina DSigmaconcentrazione finale 10 µ M
DPBS con calcio e magnesioCorning21-030-CV
DPBS senza calcio e magnesioCorning21-031-CVRiferito a DPBS
KnockOut  DMEM/F-12Gibco12660012Riferito a DMEM-F12 ottimizzato per la crescita di cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte
Proteina di topo laminina,Gibco23017015Riferito a laminina
Software e apparecchiature
CentrifugaEppendorfModello 5810R
Cytation 5 imaging di cellule vive lettoreBiotek
Gen5 Software per lettore e imager di micropiastreBiotekversione 3.03
Multi-Therm Heat-ShakeBenchmarksi riferisce all'agitatore per tubi
Sonicatore d'acquaElma Mode Transsonic 310
TMEM119 Life concentrazione naturale

Riferimenti

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