Questo protocollo descrive il processo di differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) in cellule simili alle microglia per la sperimentazione in vitro . Includiamo anche una procedura dettagliata per generare sinaptosomi umani da motoneuroni inferiori derivati da iPSC che possono essere utilizzati come substrato per saggi di fagocitosi in vitro utilizzando sistemi di imaging di cellule vive.
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Articolo metodologico
Cellule simili alla microglia umana: differenziazione da cellule staminali pluripotenti indotte e saggio di fagocitosi di cellule vive in vitro utilizzando sinaptosomi umani
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le microglia sono le cellule immunitarie residenti di origine mieloide che mantengono l'omeostasi nel microambiente cerebrale e sono diventate un attore chiave in molteplici malattie neurologiche. Lo studio della microglia umana in salute e malattia rappresenta una sfida a causa della fornitura estremamente limitata di cellule umane. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da individui umani possono essere utilizzate per aggirare questa barriera. Qui, viene dimostrato come differenziare le iPSC umane in cellule simili alla microglia (iMG) per la sperimentazione in vitro . Queste iMG mostrano le proprietà attese e fisiologiche della microglia, compresa la morfologia simile alla microglia, l'espressione di marcatori appropriati e la fagocitosi attiva. Inoltre, viene fornita la documentazione per l'isolamento e l'etichettatura dei substrati di sinaptosomi derivati da motoneuroni inferiori derivati da iPSC umani (i3LMN). Un test di imaging longitudinale a cellule vive viene utilizzato per monitorare l'inghiottimento dei sinaptosomi umani marcati con un colorante sensibile al pH, consentendo indagini sulla capacità fagocitaria di iMG. I protocolli qui descritti sono ampiamente applicabili a diversi campi che stanno studiando la biologia della microglia umana e il contributo della microglia alle malattie.
Introduzione
Le microglia sono le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo del SNC. Le microglia sono anche importanti nel cervello adulto per mantenere l'omeostasi e rispondere attivamente ai traumi e ai processi patologici. Evidenze cumulative mostrano che le microglia sono fattori chiave per la patogenesi di molteplici malattie neuroevolutive e neurodegenerative 1,2. Sebbene le attuali conoscenze sulla biologia microgliale siano state prevalentemente derivate da modelli murini, studi recenti hanno chiarito importanti differenze tra microglia murina, sot....
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Protocollo
NOTA: Tutti i reagenti utilizzati in questo protocollo devono essere sterili e tutte le fasi devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza in condizioni sterili. Tutte le linee iPSC, così come i mezzi di manutenzione e differenziazione, sono descritti nella Tabella dei Materiali. Il metodo di differenziazione delle microglia illustrato di seguito si basasui protocolli 7,8,12 precedentemente pubblicati con nuove modifiche qui descritte.
1. Differenziazione delle microglia
NOTA: una p....
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Risultati
Per generare iMG utilizzando questo protocollo, è importante iniziare con iPSC indifferenziate che mostrano una morfologia compatta della colonia con bordi ben definiti (Figura 2A). Le iPSC dissociate mantenute come descritto nella sezione sulla formazione di EB formeranno aggregati sferici, chiamati EB, che cresceranno di dimensioni fino al giorno 4 della differenziazione (Figura 2B). Una volta che gli EB sono stati raccolti e placcati nelle condizioni appropri.......
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Discussione
Il protocollo di differenziazione qui descritto fornisce un metodo efficiente per ottenere cellule simili a microglia derivate da iPSC in ~ 6-8 settimane con elevata purezza e in una resa sufficiente per eseguire esperimenti di immunofluorescenza e altri test che richiedono un numero maggiore di cellule. Questo protocollo ha prodotto fino a 1 × 106 iMG in 1 settimana, il che consente l'estrazione di proteine e RNA e le corrispondenti analisi a valle (ad esempio, RNASeq, qRT-PCR, western blot, spettrometria di .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Michael Ward per aver fornito la linea WTC11 hNIL iPSC per il differenziamento dei motoneuroni e i Jackson Laboratories per aver fornito la linea iPSC del clone KOLF2.1J WT B03 utilizzata per il differenziamento delle microglia. Ringraziamo anche Dorothy Schafer per il suo supporto durante l'implementazione dei protocolli, Anthony Giampetruzzi e John Landers per il loro aiuto con il sistema di imaging delle cellule vive, nonché Hayden Gadd per i suoi contributi tecnici durante le revisioni e Jonathan Jung per la sua collaborazione in questo studio. Questo lavoro è stato supportato dal Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience della UMASS Chan M....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpi per analisi in immunofluorescenza | |||
| anti-IBA1 anticorpo di coniglio | Wako Chemical USA | NC9288364 | diluizione 1:350 |
| anticorpo di coniglio | Sigma-Aldrich | HPA014518 | diluizione 1:50 |
| anticorpo di coniglio | Sigma-Aldrich | HPA051870 diluizione 1:50 Sigma-Aldrich diluizione | |
| 1:100Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | diluizione 1:500 |
| anticorpo di coniglio anti-sinaptofisina (SYP) | Abclonal | A6344 | diluizione 1:1.000 |
| anticorpo di topo | Millipore | MAB1596 | diluizione 1:500 |
| Borate buffer componenti | |||
| Acido borico (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Cloruro di sodio (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Tetraborato di sodio (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Materiali per colture cellulari | |||
| Piastre a 6 pozzetti | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μ m Filtri cellulari | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Trattato per colture tissutali | CELLTREAT | 229620 | |
| Sollevatore cellulare, doppia estremità, lama piatta e Lama stretta, sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a bassa aderenza | Corning | 7007 | |
| Primaria Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti a fondo piatto modificata a superficie Corning | 353847, | ||
| Primaria Piastra per coltura multipozzetto a fondo piatto a fondo piatto trasparente a 6 pozzetti | Corning | 353846 | |
| Primaria a 96 pozzetti Clear Flat Inferiore Micropiastra | Corning | 353872 | |
| Reagenti per dissociazione cellulare | |||
| Accutasi | Corning | 25058CI | reagenti di dissociazione utilizzati per la differenziazione inferiore dei motoneuroni |
| Reagente TrypLE | Technologies | 12-605-010 | reagenti di dissociazione utilizzati per la differenziazione della microglia |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Reagenti di rivestimento per colture cellulari | |||
| Matrigel GFR Matrice a membrana | Corning™ | 354230 | Riferito al reagente di rivestimento della matrice extracellulare |
| CellAdhere Laminin-521 | Tecnologia STEMCELL | 77004 | Riferito alla laminina 521 |
| Poli-D-lisina | Sigma | P7405 | Ricostituito a 0,1 mg/mL in tampone borato |
| Poli-L-Ornitina | Sigma | P3655 | Ricostituire a 1 mg/mL in tampone borato |
| Componenti dei terreni iPSC | |||
| Kit mTeSR Plus | Tecnologia STEMCELL | 100-0276 | Per preparare i terreni iPSC miscelato i componenti a 1x |
| Componenti dei terreni EB | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | finale 50 ng/mL |
| iPSC | concentrazione finale 1x | ||
| Inibitore ROCK Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | concentrazione finale 10 µ M |
| SCF | PeproTech | 300-07 | concentrazione finale 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | concentrazione finale 50 ng/mL |
| Componenti del terreno base PMP | |||
| GlutaMAX | Gibco 35050061 | concentrazione finale 1x | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Concentrazione finale Gibco | 15140122 | 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | concentrazione finale 1x |
| Componenti di PMP terreno completo | |||
| 55 mM 2-mercaptoetanolo | Gibco | 21985023 | concentrazione finale 55 µ M |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | concentrazione finale 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | concentrazione finale 100 ng/mL |
| PMP terreno di base | concentrazione finale 1x | ||
| Componenti del terreno di base iMG | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | concentrazione finale 1x |
| GlutaMAX | Gibco 35050061 | concentrazione finale 1x | |
| integratore di N2, 100x | Gibco | 17502-048 | concentrazione finale 1x |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | concentrazione finale 100 U/mL |
| Componenti del terreno completo iMG | |||
| 55 mM 2-mercaptoetanolo | Gibco | 21985023 | concentrazione finale 55 &; micro; M |
| IL-34 | PeproTech o Biologend | 200-34 o 577904 | concentrazione finale 100 ng/mL |
| iMG terreno base | concentrazione finale 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | concentrazione finale 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | concentrazione finale 50 ng/mL |
| Componenti del terreno di base a induzione | |||
| DMEM/F12 con HEPES | Gibco 11330032 | concentrazione finale 1x | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | concentrazione finale 1x |
| integratore di N2, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentrazione 1x |
| Aminoacidi non essenziali (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | concentrazione finale 1x |
| Componenti del mezzo di induzione completo | |||
| Composto E | Calbiochem | 565790 | concentrazione finale 0,2 μ M e ricostituire il reagente stock a 2 mM in etanolo 1:1 e DMSO |
| Doxiciclina | Sigma | D9891 | concentrazione finale 2 μ g/mL e ricostituire il reagente stock a 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | concentrazione finale 1x | ||
| inibitore ROCK Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | concentrazione finale 10 μ M |
| Componenti di Neuron media | |||
| B-27 Plus Sistema di coltura neuronale | Gibco | A3653401 | concentrazione finale 1x per terreni e complementi |
| GlutaMAX | Gibco 35050061 | concentrazione finale 1x | |
| integratore di N2, 100x | Gibco | 17502-048 | concentrazione finale 1x |
| Aminoacidi non essenziali (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | concentrazione finale 1x |
| linee iPSC utilizzate in questo studio | |||
| KOLF2.1J: Clone WT B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Reagenti per l'isolamento del sinaptosoma | |||
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimetilsolfossido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Reagente per l'estrazione di proteine sinaptiche | Thermo Scientific | 87793 | Riferito come reagente per la lisi cellulare per l'isolamento di coloranti per il test di sinaptosomi |
| fagocitosi | |||
| Reagente NucBlue Live Ready | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Rosso, estere succinimidilico | ThermoFisher Scientific | P36600 | Riferito a colorante sensibile al pH |
| Altri reagenti per colture cellulari | |||
| Trypan Blue, soluzione allo 0,4% | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Ricostituire a 40 mM in acqua sterile |
| Citocalasina D | Sigma | concentrazione finale 10 µ M | |
| DPBS con calcio e magnesio | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS senza calcio e magnesio | Corning | 21-031-CV | Riferito a DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Riferito a DMEM-F12 ottimizzato per la crescita di cellule staminali embrionali umane e pluripotenti indotte |
| Proteina di topo laminina, | Gibco | 23017015 | Riferito a laminina |
| Software e apparecchiature | |||
| Centrifuga | Eppendorf | Modello 5810R | |
| Cytation 5 imaging di cellule vive lettore | Biotek | ||
| Gen5 Software per lettore e imager di micropiastre | Biotek | versione 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | si riferisce all'agitatore per tubi | |
| Sonicatore d'acqua | Elma Mode Transsonic 310 |
Riferimenti
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G.
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Ristampe e permessi
