Method Article

Un metodo per studiare la correlazione tra struttura locale del collagene e proprietà meccaniche del tessuto fibroso della placca aterosclerotica

DOI:

10.3791/64334

⸱

November 11th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Erasmus Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 3Department of Biomechanical Engineering, Delft University of Technology, 4Erasmus Optical Imaging Center, Erasmus Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo sviluppato una pipeline di meccano-imaging per studiare le proprietà eterogenee strutturali e meccaniche della placca aterosclerotica. Questa pipeline consente la correlazione dell'angolo predominante locale e della dispersione dell'orientamento delle fibre di collagene, il comportamento di rottura e le impronte digitali della tensione del tessuto fibroso della placca.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La rottura delle placche aterosclerotiche nelle arterie coronarie e carotidi è la causa primaria di eventi cardiovascolari fatali. Tuttavia, la meccanica di rottura del tessuto della placca eterogenea e altamente collagenosa, e come questo sia correlato alla struttura fibrosa del tessuto, non sono ancora noti. Le tubazioni esistenti per studiare la meccanica della placca si limitano ad ottenere solo caratteristiche meccaniche grossolane del tessuto della placca, basate sull'ipotesi di omogeneità strutturale del tessuto. Tuttavia, il tessuto fibroso della placca è strutturalmente eterogeneo, probabilmente principalmente a causa della variazione locale nell'architettura delle fibre di collagene.

La pipeline di meccano-imaging qui descritta è stata sviluppata per studiare le proprietà eterogenee strutturali e meccaniche della placca. In questa pipeline, l'architettura locale del collagene del tessuto è caratterizzata utilizzando la microscopia multifotonica (MPM) con generazione di seconda armonica (SHG) e il comportamento di rottura del tessuto è caratterizzato in condizioni di test di trazione uniassiali utilizzando l'analisi di correlazione digitale delle immagini (DIC). Questa pipeline sperimentale consente la correlazione dell'angolo predominante locale e della dispersione dell'orientamento delle fibre di collagene, il comportamento di rottura e le impronte digitali di deformazione del tessuto fibroso della placca. Le conoscenze acquisite sono fondamentali per comprendere, prevedere e prevenire meglio gli eventi di rottura della placca aterosclerotica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ictus ischemico, spesso innescato dalla rottura della placca aterosclerotica nelle arterie carotidi, è una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo1. Tuttavia, le attuali strategie di pianificazione del trattamento chirurgico per prevenire l'ictus correlato all'aterosclerosi carotidea non includono la valutazione del rischio di rottura della placca2. Ciò è dovuto principalmente al fatto che i biomarcatori di rischio precedentemente suggeriti, come lo spessore del cappuccio della placca3 e la dimensione del nucleo lipidico4, hanno dimostrato di avere un valore predittivo subottimale per eventi clinici futuri 5,6. Una migliore comprensione della meccanica della placca e dei meccanismi di rottura è necessaria per ottimizzare la valutazione del rischio di rottura della placca e identificare nuovi marcatori di rischio delle placche aterosclerotiche.

La rottura della placca è un evento meccanico locale in cui il tessuto della placca altamente fibroso non riesce a sopportare il carico meccanico esercitato su di esso dalla pressione sanguigna e perde la sua integrità strutturale7. Nonostante ciò, la meccanica dell'evento di rottura della placca e il suo legame con la microstruttura sottostante sono poco conosciuti8. I pochi studi sperimentali che hanno caratterizzato il cedimento tissutale della placca presentano 9,10,11,12,13 proprietà di rottura meccanica grossolana (cioè deformazione e resistenza alla rottura della trazione finale), derivate con l'ipotesi di omogeneità strutturale del tessuto. Tuttavia, il tessuto fibroso della placca è strutturalmente eterogeneo, probabilmente principalmente a causa della variazione locale nell'architettura delle fibre di collagene14. Inoltre, il legame tra le caratteristiche di guasto meccanico del tessuto della placca e l'architettura del collagene è stato studiato solo in un recente studio di Johnston et al. Gli autori hanno mostrato una differenza interplacca nell'orientamento predominante delle fibre e hanno riportato sollecitazioni finali più elevate e ceppi finali inferiori per campioni di cappuccio di placca fibrosa con un orientamento prevalentemente circonferenziale delle fibre15. Tuttavia, lo studio era anche limitato alle proprietà meccaniche e strutturali grossolane.

Per far luce sulle informazioni essenziali sull'architettura locale del collagene e sulle proprietà meccaniche locali del tessuto fibroso della placca, nel presente studio, abbiamo sviluppato una pipeline di meccano-imaging. Questa pipeline ex vivo consente di quantificare la direzione e la dispersione locale delle fibre di collagene, nonché il ceppo di rottura locale. La pipeline prevede l'imaging MPM con SHG per visualizzare le fibre di collagene nel tessuto della placca, nonché test di trazione DIC e uniassiali per quantificare le caratteristiche di rottura del tessuto.

La generazione di microscopia multifotonica della seconda armonica (MPM-SHG) è diventata una tecnica popolare per studiare il collagene nei tessuti biologici16. La tecnica presenta molti vantaggi rispetto ad altre tecniche di imaging del collagene, come l'istologia17, l'imaging del tensore di diffusione (DTI)14 e la diffusione della luce a piccolo angolo (SALS)15. Innanzitutto, l'imaging MPM-SHG non è distruttivo, il che lo rende ideale da combinare con test meccanici18. In secondo luogo, il segnale SHG è specifico per il collagene e quindi non è necessaria alcuna colorazione del tessuto. A causa delle lunghe lunghezze d'onda di eccitazione (vicino infrarosso), la profondità di penetrazione è maggiore rispetto ad altre tecniche di microscopia16. L'alta risoluzione (livello μm) ottenuta con l'imaging SHG consente anche la visualizzazione delle singole fibre. Ciò offre molte possibilità, come la quantificazione locale del numero di fibre di collagene, l'orientamento delle fibre di collagene e la distribuzione19.

La correlazione digitale delle immagini (DIC) combinata con i test meccanici è un metodo ampiamente utilizzato per ottenere proprietà meccaniche locali dei tessuti biologici20. Con DIC, lo spostamento delle macchie applicate sulla superficie del tessuto viene monitorato confrontando le immagini della telecamera ad alta velocità acquisite durante i test meccanici20. Questo metodo di post-elaborazione delle immagini viene utilizzato per stimare le tensioni superficiali a tutto campo del campione20 e può anche essere utilizzato per studiare il comportamento di rottura del tessuto21.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti i metodi descritti in questo documento sono stati approvati dal Comitato di ricerca etica presso l'Erasmus Medical Center di Rotterdam; Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti prima della raccolta del campione di placca. Un grafico del flusso di lavoro del protocollo è riportato nella Figura 1.

1. Raccolta di tessuti, tomografia microcomputerizzata (μCT) imaging e preparazione del campione di prova

  1. Raccolta e conservazione dei tessuti
    1. Raccogliere campioni di placca aterosclerotica carotidea umana fresca da pazienti consenzienti sottoposti a chirurgia endoarterectomia carotidea.
      NOTA: I campioni di placca recuperati da questo intervento sono costituiti dallo strato intima malato dell'arteria carotide, compreso l'accumulo di grasso (il pool lipidico) e calcificazioni22.
    2. Rimuovere i residui di sangue utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) e asciugare il campione con una garza.
    3. Posizionare il campione in un tubo da 15 ml usando una pinzetta. Congelare il tessuto mettendo il tubo in azoto liquido per 10 minuti.
    4. Dopo il congelamento a scatto, conservare il campione in un congelatore a -80 °C fino al giorno dell'imaging μCT.
      NOTA: Il congelamento a scatto riduce al minimo la formazione di cristalli, causando danni microstrutturali nel tessuto. Uno studio precedente sul tessuto aortico suino ha dimostrato che il congelamento a scatto e la conservazione a -80 °C non hanno avuto un'influenza significativa sulle proprietà meccaniche del tessuto23.
  2. Imaging μTC
    1. Il giorno dell'imaging μCT, estrarre il campione di placca dal tubo da 15 ml. Se il tessuto si attacca al tubo, riempire il tubo con PBS a temperatura ambiente. Lasciare il tessuto in PBS fino a quando il campione può essere estratto dal tubo.
    2. Asciugare accuratamente il campione di placca con carta velina.
    3. Accendere il sistema μCT premendo il pulsante verde . Premere il riscaldamento nel software CT nella parte inferiore dello schermo e attendere 15 minuti.
    4. Posizionare manualmente un filtro a raggi X di Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm nel sistema μCT.
    5. Selezionare la cartella in cui devono essere memorizzate le immagini.
    6. Scegli i parametri nel pannello di sinistra. Utilizzare gli elenchi a discesa per selezionare un tempo di scansione di 4 minuti, una risoluzione di 172 μm, una tensione di 90 kV, un amperaggio di 88 mA, un campo visivo di 86 mm e una rotazione di 360°.
    7. Apri lo sportello del dispositivo. Estrarre la piattaforma manualmente.
    8. Mettere il parafilm sulla piattaforma e posizionare il campione sulla piattaforma (verso l'estremo più lontano della piattaforma).
    9. Posizionare manualmente la piattaforma nel dispositivo e chiudere la porta.
    10. Attiva la modalità live (icona a forma di occhio ). Spostare la piattaforma con le frecce nel dispositivo per centrare il campione nel campo visivo.
    11. Inizia a creare immagini (icona in basso al centro). Una volta terminata l'immagine, premere l'icona della porta in basso (sotto il pulsante di interruzione ).
    12. Dopo la scansione μCT, congelare nuovamente il campione di placca come descritto al punto 1.1.3. Conservarlo a -80 °C fino al giorno dell'imaging al microscopio multifotone e dei test meccanici.
    13. Aprire i file DICOM acquisiti dell'imaging μCT nel software open source 3D Slicer24.
    14. Vai all'editor di segmenti . Selezionare Crea una nuova segmentazione | il volume da analizzare come volume master.
    15. Fai clic su Aggiungi per aggiungere un segmento. Premere il nome e il colore per modificare questi parametri.
    16. Per definire i segmenti, fate clic su effects | threshold nella parte inferiore della finestra. Utilizzare questo strumento di soglia per distinguere tra regioni tissutali calcificate (>450 HU) e non calcificate (<450 HU). Una volta selezionata la soglia, premere Applica nella parte inferiore.
    17. Premere Mostra 3D (a destra di Aggiungi) per visualizzare la segmentazione nella vista 3D. Se ci sono aree della segmentazione che non sono desiderate, rimuoverle con l'effetto forbici.
    18. Modificare l'opacità dei segmenti nel modulo di segmentazione facendo clic sul nome della segmentazione desiderata.
      NOTA: Se possibile, l'imaging μCT e la revisione delle immagini μCT possono essere eseguiti lo stesso giorno del resto del protocollo. In tal caso, saltare il passaggio 1.2.12. Tuttavia, tieni presente che anche i passaggi successivi di questo protocollo richiedono molto tempo e devono essere eseguiti lo stesso giorno. Dopo un po 'di pratica, e con le impostazioni e il tessuto descritti, l'imaging μCT dovrebbe richiedere ~ 45 minuti, la revisione delle immagini μCT ~ 15 minuti, la preparazione del campione di prova di un singolo campione di prova ~ 1 ora, la microscopia ~ 4 h e il test di trazione uniassiale ~ 2 h.
  3. Preparazione del campione di prova
    1. Il giorno dell'imaging del collagene e dei test meccanici, scongelare la placca immergendola in PBS a temperatura ambiente per circa 10 minuti.
    2. Aprire la costruzione 3D della placca creata nei passaggi 1.2.13-1.2.18 nel software di affettatura 3D.
    3. Utilizza i punti di riferimento naturali del tessuto della placca per identificare quali parti della ricostruzione 3D corrispondono al campione di placca reale. Identifica quale area della ricostruzione 3D non contiene calcificazioni e identifica visivamente quest'area nella placca reale.
    4. Tagliare la placca aperta lungo l'asse longitudinale dell'arteria usando forbici chirurgiche e pinzette. Se un taglio è già presente dall'intervento chirurgico, iniziare da questo taglio per un utilizzo ottimale del tessuto. Se il campione non ha una forma tubolare ed è difficile definire la direzione longitudinale, escludere il campione dalla prova.
    5. Ritagliare campioni di prova rettangolari dai campioni di placca. Assicurarsi che i campioni di prova siano il più grandi possibile evitando regioni tissutali contenenti lacrime o calcificazioni. Prestare attenzione durante questo taglio, poiché una piccola lacerazione o fessura sul bordo del campione di prova può provocare la propagazione della fessura dalla fessura esistente durante la prova di trazione.
    6. Assicurarsi che i campioni di prova abbiano un rapporto larghezza-lunghezza (WL) di <1 nella lunghezza tra i riferimenti una volta montati nel tester di trazione. Se i campioni soddisfano questo requisito, sono adatti per prove di trazione appropriate in termini di condizioni al contorno25.
      NOTA: l'intervallo nelle dimensioni del campione può essere ampio. I campioni che gli autori hanno testato avevano una lunghezza del calibro compresa tra 3,4 e 12,9 mm e una larghezza compresa tra 1,6 e 6,4 mm.

2. Imaging al microscopio multifotonico

  1. Preparazioni
    1. Prima del giorno dell'imaging del collagene e dei test meccanici, dividere 40 g di una base di elastomero siliconico su due provette da 50 ml e aggiungere 2 g dell'agente polimerizzante a ciascuna provetta (rapporto di 1:10) utilizzando un pipetta Pasteur. Mescolare i due componenti con il pipet.
    2. Centrifugare i tubi per 1 minuto a 700 × g per rimuovere il maggior numero possibile di bolle d'aria.
    3. Riempire una piastra di Petri (10 cm di diametro) con uno strato sottile (circa 0,5-1 cm) di silicio e incubarla in forno a 65 °C per 3 ore o metterla a temperatura ambiente per 48 ore.
    4. Prelevare un campione di test della placca e fissare entrambe le estremità al silicio bloccando gli aghi nel tessuto (Figura 2A). Assicurarsi che il lato luminale del campione sia rivolto verso l'alto. Inserire gli aghi nella regione del campione che sarà nei morsetti del dispositivo di prova di trazione durante la prova meccanica.
    5. Indossare occhiali di sicurezza. Utilizzare una taglierina laterale per accorciare gli aghi in modo che sporgano a meno di pochi millimetri sopra la superficie del campione, per evitare che danneggino l'obiettivo del microscopio. Riempire la capsula di Petri con PBS fino a quando il campione non è immerso.
  2. Configurazione della microscopia
    1. Assicurarsi che un obiettivo adeguato sia montato sul microscopio multifotone. Utilizzare un obiettivo ottimizzato per trasmettere la luce infrarossa, con un ingrandimento di 20x.
    2. Avviare il sistema del microscopio. Aprire il software operativo del microscopio.
    3. Quando viene richiesto di inizializzare la tabella di imaging, assicurarsi che il braccio del condensatore del microscopio sia spinto indietro e che l'obiettivo sia nella posizione più bassa.
    4. Attivare il laser multifotone.
    5. Inserire la capsula di Petri con il campione di prova sotto l'obiettivo, come nella Figura 3. Assicurati di non posizionare l'obiettivo sopra il campione poiché le impostazioni laser devono ancora essere ottimizzate. In caso contrario, la possibile elevata potenza della luce laser potrebbe causare danni al tessuto.
    6. Assicurati che l'obiettivo sia leggermente immerso in PBS. Utilizzare un pipet per aggiungere PBS aggiuntivo, se necessario.
    7. Impostare la lunghezza d'onda della luce su 880 nm.
      NOTA: Questa lunghezza d'onda viene scelta perché il filtro di emissione SHG nel sistema a due fotoni utilizzato ha una lunghezza d'onda centrale di circa 440 nm. Per altri microscopi, una lunghezza d'onda diversa potrebbe essere più applicabile.
  3. Scansione dei riquadri e selezione delle posizioni di imaging
    1. Spegnere il laser multifotone e attivare la modalità campo luminoso del microscopio. Quindi, attiva la modalità di scansione dal vivo .
    2. Posizionare lo stage in modo che l'obiettivo si trovi sopra il campione e mettere a fuoco la superficie del campione. Disattivare la modalità di scansione dal vivo .
    3. Nella scheda di acquisizione , nel secondo pannello, modificare il fattore di zoom su 1 facendo scorrere la barra desiderata.
      NOTA: questo fattore di zoom, insieme al fattore di ingrandimento dell'obiettivo (20x), determina la dimensione dell'immagine acquisita (739 μm x 739 μm).
    4. Nella scheda di acquisizione , nel secondo pannello, modificare la velocità di scansione su 400 Hz, la media della linea su 1 e la risoluzione su 128 x 128 pixel per immagine (dimensione pixel di ~5,8 μm x 5,8 μm) utilizzando gli elenchi a discesa.
    5. Nella scheda di acquisizione , nel primo pannello, fare clic sul simbolo del motivo raster e attendere che venga visualizzato un pannello di scansione delle piastrelle .
    6. Attivare la modalità Live Scan. Spostate l'obiettivo in un angolo dell'esempio utilizzando le manopole sul pannello smart e fate clic sul simbolo della posizione del contrassegno nel pannello di scansione delle piastrelle. Ripetere questa operazione per ogni angolo del campione. Se eseguita correttamente, una griglia con tutti i riquadri selezionati per l'imaging apparirà in arancione.
    7. Disattiva la funzione di cucitura automatica .
    8. Fare clic su Start nell'angolo inferiore destro dello schermo per creare una scansione delle porzioni dell'intera superficie campione e ottenere una panoramica della geometria del campione.
      NOTA: In base alle impostazioni descritte, al tessuto e al sistema di microscopio, l'acquisizione di una scansione delle piastrelle dell'intera superficie del campione richiede ~ 10 minuti.
    9. Dopo la scansione delle piastrelle, osservare le coordinate x e y dell'angolo superiore sinistro di ciascuna piastrella nel pannello di scansione delle piastrelle, mostrate automaticamente dal software del sistema di microscopia. Annotare queste coordinate in un foglio di calcolo.
    10. Nel software del microscopio, nel pannello di scansione delle piastrelle, osservare il numero di tessere nelle direzioni x e y nella casella chiamata scanfield. Annotare le dimensioni della scansione dei riquadri nel foglio di calcolo. Calcola le coordinate delle altre tessere aggiungendo/sottraendo la dimensione della piastrella (739 μm).
      NOTA: queste coordinate sono necessarie per identificare la posizione esatta delle piastrelle da scansionare con l'imaging SHG. Se il tempo totale di imaging non è un problema, è possibile creare immagini di tutti i riquadri senza saltare alcun riquadro.
    11. Dalla scansione dei riquadri, selezionare le tessere da visualizzare con l'imaging SHG. Per questa selezione, evitare le tessere che si troveranno nei morsetti e lasciare una tessera tra ogni piastrella selezionata sia nella direzione longitudinale che in quella circonferenziale, come illustrato nella Figura 2B.
  4. Visualizzazione del collagene: imaging SHG
    1. Spegnere le luci nella stanza e coprire il palco del microscopio con tessuto oscurante anche che nessuna luce dalla stanza raggiunge il rilevatore.
      NOTA: riducendo al minimo la luce che raggiunge i rilevatori si riduce il rumore durante l'acquisizione delle immagini.
    2. Accendere il laser multifotone (MP).
    3. Selezionare il rilevatore NDD (Non-Descand Detection) dotato di un filtro passa-banda 430-450 nm.
    4. Identificare la posizione dei riquadri da visualizzare utilizzando le informazioni acquisite nel passaggio 2.3.10. Compila le coordinate nelle caselle designate e fai clic su Invio, in modo che l'obiettivo si sposti nel riquadro destro. Attivare la modalità Live Scan.
      NOTA: con altri microscopi o versioni più recenti del software operativo, lo spostamento in posizioni all'interno della scansione delle piastrelle può essere eseguito automaticamente. In questo caso, non è necessario annotare le coordinate x e y di ciascun riquadro (passaggio 2.3.10) e compilare le coordinate nel software operativo (passaggio 2.4.4).
    5. Aumentare la potenza del laser MP utilizzando il cursore nel pannello superiore sotto le impostazioni del percorso del fascio per ottenere la massima potenza laser possibile senza sbiancamento significativo. Quindi, regolare il guadagno del rilevatore per ottenere immagini luminose, ma senza pixel saturi, utilizzando la manopola sul pannello intelligente o facendo clic sul nome del rilevatore in Impostazioni percorso fascio | canali aggiuntivi. I valori tipici per il guadagno del rivelatore sono compresi tra 500 e 800 V.
    6. Utilizzare la manopola Z-position sullo smart panel per regolare il piano di messa a fuoco.
    7. Spostarsi nella parte superiore del campione e impostare le posizioni della parte superiore dello z-stack facendo clic sulla punta della freccia nel pannello z-stack (sotto la scheda acquisizione | 3° pannello).
    8. Quindi, concentrarsi sul campione fino a quando il segnale SHG non viene più rilevato: questa è la fine dello stack. Ancora una volta, fai clic sulla punta della freccia nel pannello z-stack per impostare questa posizione. Al termine, disattivare la modalità Live Scan.
      NOTA: il tessuto potrebbe non essere completamente piatto. Pertanto, la superficie del campione di diverse regioni all'interno del tessuto può avere posizioni leggermente diverse nella direzione z.
    9. Nella scheda di acquisizione , nel secondo pannello, mantenere la velocità di scansione a 400 Hz, impostare la media della linea su 2 e la risoluzione su 512 x 512 pixel per immagine (dimensione dei pixel di ~ 1,4 μm x 1,4 μm) utilizzando gli elenchi a discesa. Attiva il pulsante di scansione X bidirezionale.
    10. Fare clic su z-step size nel pannello z-stack e riempire una dimensione z-step di 3 μm nella casella. Fare clic su Start nell'angolo inferiore destro dello schermo per creare uno z-stack. Al termine, assicurarsi di salvare le coordinate del riquadro nel nome del file o di assegnare a ciascun riquadro il proprio numero (come nella Figura 2B).
      NOTA: In base alle impostazioni descritte, al tessuto e al sistema di microscopio, l'acquisizione di una pila z di una singola tessera richiede ~ 10-15 minuti. Le fasi di preparazione (fasi 2.4.4-2.4.10) sono incluse in questa stima temporale.

3. Collaudo meccanico

  1. Preparazione della configurazione della prova di trazione uniassiale
    1. Preparare la configurazione della prova di trazione orizzontale (Figura 4) per l'uso, seguendo le istruzioni per il tester di trazione (ad esempio, accendere il software, collegare i morsetti, collegare la cella di carico).
    2. Per ridurre al minimo lo slittamento del campione di prova, attaccare il nastro biadesivo di schiuma (figura 4A,B-2) alle facce interne dei morsetti del tester di trazione e della carta vetrata al lato interno del nastro di schiuma. Alla fine, la carta vetrata sarà in contatto con il campione di prova.
    3. Posizionare il bagno di riscaldamento (Figura 4A,B-3) in posizione. Riempire il bagno di riscaldamento con PBS fino al livello della faccia inferiore dei morsetti, in modo che non raggiunga ancora la carta vetrata.
    4. Accendere la fonte di alimentazione del bagno di riscaldamento e impostare la temperatura a circa 37 °C.
    5. Montare la telecamera ad alta velocità sopra il sistema di prova di trazione (Figura 4A-4), ad esempio, utilizzando un supporto da laboratorio, e montare un obiettivo con una lunghezza focale di 50 mm sulla telecamera attraverso un anello di estensione.
    6. Assicurarsi che i morsetti siano a fuoco e che il campo visivo sia sufficientemente ampio da registrare il campione durante l'intera procedura di allungamento (larghezza FOV: ± larghezza del campione; Lunghezza FOV: ± 2x la lunghezza del campione).
    7. Montare il sistema di illuminazione (Figura 4A-5) sopra il sistema di prova di trazione, ad esempio utilizzando un supporto da laboratorio. Accendere il sistema di illuminazione e regolare l'intensità e la posizione della luce in modo che non vi siano riflessi sulla superficie PBS da osservare sull'immagine della telecamera.
    8. Regolare il tempo di esposizione e il guadagno della fotocamera per ottenere immagini nitide.
    9. Impostare il software di acquisizione delle immagini per l'acquisizione a 30 fotogrammi/s con una risoluzione di 5,2 MP.
      NOTA: questa frequenza fotogrammi elevata è necessaria per eseguire la successiva analisi DIC e studiare il comportamento di rottura.
    10. Impostare la velocità di spostamento di uno dei morsetti in modo tale che la velocità di deformazione ingegneristica globale durante le prove meccaniche sia simile alla velocità di deformazione fisiologica in vivo del tessuto
      (5%/s per tessuto placche26).
  2. Generazione di pattern speckle
    NOTA: Questo protocollo di speckle pattern si basa su precedenti lavori di Walsh et al.27.
    1. Asciugare il campione tamponandolo leggermente con carta velina.
    2. Metti il colorante di tessuto nero nel secchio previsto dell'aerografo.
    3. Collegare l'aerografo al compressore. Accendere il compressore dell'aerografo e impostare la pressione su 25 PSI.
    4. Prova a creare un motivo di macchioline ottimale su carta prima di spruzzare sul tessuto. Spruzzare alcune volte fino a raggiungere un rapporto bianco e nero di 50 :5028 . Spostare l'ago dell'aerografo avanti e indietro per regolare la rugosità del motivo a macchie fino a quando la dimensione di una macchietta è simile alla dimensione di 3-5 pixel della fotocamera ad alta velocità29.
      NOTA: il motivo speckle verrà utilizzato per due scopi diversi. In primo luogo, lo spostamento di queste macchioline viene misurato confrontando le immagini delle telecamere ad alta velocità acquisite durante i test meccanici (DIC, fase 4.2). In secondo luogo, questo pattern di speckle viene utilizzato per identificare la posizione di rottura sull'immagine dello stato non deformato del campione (passo 4.3.1).
    5. Tenere l'aerografo a circa 30 cm di distanza dal campione di prova e spruzzare sulla superficie luminale.
    6. Lasciare che il colorante si leghi al campione per 1 minuto a temperatura ambiente prima di immergere il campione in PBS.
  3. Prove di trazione uniassiali
    1. Posizionare il campione nei morsetti del tester di trazione, con la direzione circonferenziale dei campioni allineata con la direzione di allungamento della trazione e il lato luminale del campione rivolto verso l'alto. Assicurarsi che la lunghezza iniziale del calibro sia impostata in modo tale che il rapporto WL delle strisce sia <1.
    2. Stringere le viti delle impugnature applicando una coppia di 20 cNm utilizzando un cacciavite dinamometrico. Fallo gradualmente applicando una piccola coppia a ciascuna vite prima di applicare la coppia finale.
    3. Ispezionare visivamente se il campione contiene lacrime che potrebbero influenzare i test.
    4. Introdurre altro PBS nel bagno di riscaldamento fino a quando il campione non è immerso e attendere che la temperatura del PBS abbia raggiunto nuovamente i 37 °C.
    5. Acquisire un'immagine di calibrazione con la telecamera ad alta velocità, in cui il campione di prova e un righello sono inclusi come riferimento. Assicurarsi che il righello si trovi alla stessa distanza dall'obiettivo della fotocamera della superficie luminale del campione.
    6. Tarare la cella di carico e iniziare a registrare le misurazioni globali della forza e dello spostamento dalla cella di carico e dall'attuatore del tester di trazione.
    7. Raddrizzare il campione applicando un preallungamento di 0,05 N per eliminare il gioco nel campione. Eseguire 10 cicli di precondizionamento fino al 10% di deformazione in base alla misurazione della lunghezza del manometro da parte dell'attuatore dopo l'applicazione del prestiro.
    8. Avviare la prova di trazione uniassiale fino al completo cedimento del campione, registrando un video della deformazione del campione con la telecamera ad alta velocità. Dopo il cedimento tissutale, interrompere la registrazione delle misurazioni globali della forza e dello spostamento.
      NOTA: alcuni tensile tester commerciali possono eseguire automaticamente i passaggi 3.3.6-3.3.9. Il protocollo attuale descrive i passaggi manuali da eseguire se questa opzione automatica non è inclusa nel tester di trazione utilizzato.
    9. Rimuovere il campione di prova dal dispositivo di prova di trazione e gettarlo in modo appropriato.
    10. Quando si esegue il test del campione successivo, sostituire la carta vetrata e il nastro di schiuma sui morsetti.

4. Analisi dei dati

  1. Analisi dell'organizzazione del collagene
    1. Apri gli z-stack ottenuti durante MPM con SHG in ImageJ e crea proiezioni di massima intensità (MIP) di ogni z-stack.
    2. Analizza ogni MIP con lo strumento open source FOA (Fiber Orientation Analysis) basato su MATLAB30 per misurare l'angolo di orientamento delle singole fibre di collagene presenti nelle piastrelle. Utilizzare i seguenti parametri: Scale: [3 4 5] o [2 4 6], a seconda del diametro del vaso, e Soglia di vaso: 0,999, 0,9995 o 0,9999, a seconda dell'intensità del segnale SHG.
      NOTA: Ulteriori dettagli su come utilizzare questo strumento sono disponibili nel manuale del software31.
    3. Usa un altro strumento open source basato su MATLAB, FibLab32, per adattare una distribuzione gaussiana all'istogramma della distribuzione angolare.
      NOTA: ulteriori dettagli su come utilizzare questo strumento sono disponibili nel manuale del software32.
    4. Dal grafico di distribuzione gaussiana ottenuto utilizzando FibLab, estrarre i seguenti parametri strutturali dallo spazio di lavoro di MATLAB: l'angolo di fibra predominante (μ p), che è la modalità di distribuzione, la deviazione standard (σp) della distribuzione dell'angolo della fibra e la frazione anisotropa (Pani = 1 − Piso).
      NOTA: La frazione isotropa è l'area sotto la linea di base nella distribuzione gaussiana, mentre la frazione anisotropa contiene l'area del picco sopra quella linea di base33. Sia σp che Pani forniscono informazioni sulla dispersione dell'orientamento delle fibre nella regione delle piastrelle.
    5. Per l'ispezione visiva, tracciate μ p utilizzando linee orientate e σp e Paniutilizzando mappe colore.
  2. Analisi digitale delle immagini e analisi delle rotture
    1. Eseguire un'ispezione visiva sulle immagini della telecamera per identificare il fotogramma in cui si verifica l'inizio della rottura. Su questo fotogramma, identifica visivamente la posizione di rottura.
    2. Eseguire un'ispezione visiva sulle immagini della telecamera per identificare eventuali crepe o strappi nel punto di rottura all'inizio del test meccanico. Se tale strappo è presente, escludere il campione dall'analisi.
    3. Esegui l'analisi DIC con il software open source basato su MATLAB Ncorr (v1.2)34. Seguire i passaggi nel manuale Ncorr35.
      1. Utilizzare le immagini della telecamera registrate durante la prova di trazione con la telecamera ad alta velocità per DIC. Selezionate l'ultimo fotogramma prima dell'allungamento finale fino al fallimento (dopo il precondizionamento) come immagine di riferimento. Per le immagini correnti, selezionate tutte le immagini dall'inizio dell'allungamento finale fino all'ultimo fotogramma prima del fotogramma in cui si è verificato l'inizio della rottura.
      2. Selezionare la superficie campione come regione di interesse (ROI). Escludere le aree vicine (circa 1 mm) ai morsetti, poiché le deformazioni in queste aree saranno fortemente influenzate dalle impugnature.
      3. Eseguire l'analisi DIC utilizzando i seguenti parametri: Raggio del sottoinsieme: 30 pixel; Spaziatura sottoinsiemi: tre pixel; Interruzione iterazione: 50; Norma del cutoff vettoriale differenza: 10-5; Raggio di deformazione: 5; Propagazione automatica, passo#: 5.
      4. Dall'analisi DIC con Ncorr, ottenere le distribuzioni di Green-Lagrange (o ceppo euleriano) del ROI. Utilizzare queste distribuzioni di deformazione per calcolare la deformazione media di Green-Lagrange dell'intera superficie del campione di placca nell'ultimo fotogramma prima della rottura. Calcolare la deformazione di Green-Lagrange nel punto di rottura.
  3. Correlare i dati strutturali e meccanici nel luogo di rottura
    1. Utilizzando i punti di riferimento naturali nel campione di prova e le macchie applicate sul campione di prova, identificare il punto di rottura (identificato al punto 4.2.1) sull'immagine di riferimento (punto 4.2.3.1).
    2. Utilizzando i punti di riferimento naturali nel campione di prova, creare una sovrapposizione dell'immagine di riferimento e della scansione delle tessere (passaggio 2.3) per identificare la posizione di rottura nella scansione delle piastrelle. Identificare la piastrella MPM-SHG in cui si è verificata la rottura. Se la rottura non è in una piastrella scansionata con MPM-SHG, identificare la piastrella più vicina alla posizione di rottura. Ottenere i parametri strutturali trovati nella piastrella in cui si è verificata la rottura.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Raccolta dei tessuti e preparazione del campione di prova
La raccolta di tessuti produce campioni di tessuto fibroso di placca che possono essere sezionati in singoli campioni di prova per l'imaging strutturale e i test di trazione uniassiali. Idealmente, un campione di tessuto fibroso raccolto contiene aree con poche o nessuna lacerazione (Figura 5A) e macrocalcificazioni (Figura 5B). Un eccesso di queste lacrime e calcificazioni (Figura 5C) può portare a campioni di placca che non soddisfano il requisito di dimensione del campione precedentemente menzionato di WL 1.

Imaging al microscopio multifotonico
SHG imaging e post-elaborazione delle immagini fornisce MIP da ogni riquadro di immagine (Figura 6A,B). Un'ulteriore post-elaborazione mediante rilevamento delle fibre (Figura 6C) produce istogrammi di orientamento delle fibre (Figura 6D) da cui è possibile estrarre i parametri strutturali del collagene (Figura 6E). Inoltre, mappe a colori che mostrano i parametri strutturali locali del collagene attraverso l'intero campione di placca possono essere ottenute per l'analisi visiva (Figura 6F, G). Per il campione di prova rappresentativo nella Figura 6, si trova un'ampia variazione intracampionaria nei parametri strutturali del collagene (media ± SD di μ p = -34° ± 32°; σp = 21° ± 4°; Pani = 0,49 ± 0,14, se la direzione circonferenziale è definita come 0°). Questa variazione intracampionaria sottolinea l'importanza di ottenere parametri strutturali locali invece di assumere omogeneità.

Collaudo meccanico
Comportamento di rottura
La telecamera ad alta velocità fornisce immagini del comportamento di deformazione e rottura dei campioni di placca durante i test meccanici (Figura 7). Da queste immagini, è possibile identificare la posizione di inizio della rottura e il percorso di propagazione della rottura. I risultati dell'identificazione della rottura non sono ottimali se nelle immagini della fotocamera sono presenti bolle o riflessi o se la rottura si propaga troppo velocemente per essere catturata dalla frequenza fotogrammi scelta.

Modelli di deformazione locale
L'analisi della correlazione delle immagini digitali sulle registrazioni della telecamera acquisite durante la prova di trazione uniassiale fornisce le mappe di deformazione tissutale locale, come le mappe di deformazione di Green-Lagrange mostrate nella Figura 8. Queste mappe mostrano le tre componenti della deformazione (εxx, εxy e εyy) nel frame prima dell'inizio della rottura. Da queste mappe di deformazione, è possibile estrarre le deformazioni medie in una regione di interesse e la deformazione locale in un punto, come la posizione di rottura.

Per il campione rappresentativo nella Figura 8, i dati di deformazione locale mostrano un'ampia variazione intracampione. Per il campione rappresentativo in Figura 8, si trova un'ampia variazione intracampionaria nei ceppi locali (gli intervalli dei ceppi osservati sono i seguenti: εxx = -0,30-0,17; εxy = -0,13-0,20; εyy = 0-0,40). Ciò sottolinea l'importanza di ottenere dati locali anziché valori medi lordi ottenuti con l'ipotesi dell'omogeneità tissutale.

Correlare le informazioni sui tessuti meccanici e strutturali
I risultati sopra menzionati consentono di associare la deformazione locale e il comportamento di rottura del tessuto all'architettura del collagene. Una volta identificata la posizione di rottura sulle registrazioni della telecamera (Figura 9A), è possibile mapparla all'immagine della telecamera di riferimento (Figura 9B) e alla scansione della tessera microscopica (Figura 9C). Questo fornisce la tessera MPM-SHG in cui si è verificata la rottura e i parametri strutturali trovati in questa piastrella (Figura 9D). I parametri strutturali trovati nella piastrella in cui si è verificata la rottura in un campione rappresentativo, mostrati nella Figura 9, sono μ p = 28°, σp = 19° e Pani = 0,6. La stessa procedura può essere applicata anche alle posizioni dei tessuti non rotti. È importante notare che mappare la posizione di rottura sull'immagine di riferimento dal fotogramma di rottura può essere difficile in caso di uno schema di macchie scadente e punti di riferimento naturali poco chiari. Inoltre, se i punti di riferimento naturali del tessuto non sono abbastanza chiari, la co-registrazione della sovrapposizione della scansione delle piastrelle e delle immagini della telecamera ad alta velocità può essere difficile.

figure-results-1
Figura 1: Grafico del flusso di lavoro del protocollo sperimentale presentato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Selezione delle tessere per l'imaging SHG dalla scansione delle piastrelle . (A) Campione di prova appuntato in silicio. (B) Scansione delle piastrelle del campione di prova ottenuto mediante microscopia in campo chiaro. I riquadri selezionati per l'imaging SHG sono contrassegnati da quadrati blu. (C) Proiezione di massima intensità dell'MPM con SHG. Barra della scala = 140 μm (C). Abbreviazioni: SHG = generazione di seconda armonica; MPM = microscopia multifotonica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Campione di placca posto sotto l'obiettivo del microscopio multifotone. La posizione del campione di placca è assicurata da una capsula di Petri riempita di soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Misuratore di trazione monoassiale progettato su misura con i suoi diversi componenti indicati . (A) Panoramica totale del sistema. Si noti che gli inserti di carta vetrata nei morsetti sono visibili poiché sono fissati solo i morsetti inferiori. (B) Immagine ingrandita dei morsetti della prova di trazione con la provetta pronta per la prova. Abbreviazioni: PVC = cloruro di polivinile; LED = diodo a emissione luminosa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Risultati della raccolta dei tessuti e della preparazione del campione da campioni rappresentativi . (A) Campione di placca fresco e intatto, recuperato da pazienti consenzienti sottoposti a chirurgia endoarterectomia carotidea. (B) Ricostruzione 3D da una scansione μCT. Il tessuto calcificato è mostrato in azzurro e non calcificato in rosso. Un campione ottimale senza tessuto calcificato potrebbe essere ottenuto dall'area tra le linee blu. (C) Ricostruzione 3D dalla scansione μCT che mostra una placca subottimale con un eccesso di tessuto calcificato. Barra scala = 3 mm. Abbreviazione: μCT = tomografia micro-computerizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: Risultati MPM-SHG da un campione rappresentativo. (A) Panoramica della scansione delle piastrelle; I riquadri selezionati per l'imaging sono visualizzati in blu. (B) MIP di varie tessere. (C) Rilevamento delle fibre mediante lo strumento FOA da una piastrella selezionata . (D) Istogramma di orientamento delle fibre da una piastrella selezionata. (E) Istogramma di orientamento delle fibre + adattamento gaussiano da cui è possibile estrarre i parametri strutturali del collagene da una piastrella selezionata. (F) Rappresentazione del μ p (linea nera di orientamento) e σp (colore di sfondo) sull'intero campione di placca. (G) Rappresentazione del μp (linea nera di orientamento) e Pani (colore di sfondo) sull'intero campione di placca. Barre della scala = 140 μm (B,C). Abbreviazioni: MPM-SHG = microscopia multifotonica-generazione di seconda armonica; MIP = proiezioni di intensità massima; FOA = analisi dell'orientamento delle fibre; μp = angolo di fibra predominante; Pani = frazione anisotropa; σp = deviazione standard della distribuzione dell'angolo della fibra; Piso = frazione isotropa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-7
Figura 7: Inizio e propagazione della rottura in un campione di tessuto a placca durante la procedura della prova di trazione.1) Stato prestirato, tessuto intatto. 2) Inizio della rottura-primo fotogramma in cui si osserva la rottura. Il luogo di inizio della rottura è contrassegnato da un quadrato rosso. 3 ) e 4) Propagazione della rottura. 5) Rottura completa del campione di placca. Barre della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-8
Figura 8: Modelli di deformazione Green-Lagrange di un campione rappresentativo (εxx, εxy e εyy) nel frame prima della rottura, ottenuto con l'analisi DIC. Viene fornita la deviazione media e standard sull'intera placca, insieme alla deformazione nel punto di rottura. Abbreviazioni: DIC = correlazione dell'immagine digitale; εxx = deformazione longitudinale; εxy = cesoia; εyy = deformazione a trazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

figure-results-9
Figura 9: Immagine sovrapposta della posizione di rottura (quadrato rosso) sulle immagini. (A) Immagine della telecamera ad alta velocità, in cui viene identificata la rottura (cornice di rottura). (B) Immagine di una telecamera ad alta velocità, in cui viene applicata solo la preestensione (quadro di riferimento). (C) L'immagine di scansione delle piastrelle ottenuta al microscopio. (D) Una mappa codificata a colori che mostra i parametri strutturali locali del collagene in varie piastrelle. Vengono presentati i μp (linea nera di orientamento) e Pani (colore di sfondo) sull'intero campione di placca. Abbreviazioni: μp = angolo di fibra predominante; Pani = frazione anisotropa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'attuale studio si è concentrato sullo sviluppo di una pipeline di meccano-imaging per studiare la correlazione tra l'orientamento e la dispersione del collagene locale, le proprietà meccaniche locali e il comportamento di rottura del tessuto fibroso della placca aterosclerotica. Il protocollo qui descritto è innovativo per diversi motivi. In primo luogo, questa è la prima volta che la correlazione delle immagini digitali è stata applicata per misurare la deformazione locale del tessuto della placca fibrosa sotto carico meccanico. In secondo luogo, questo protocollo fornisce le informazioni necessarie per analizzare l'associazione tra il modello di deformazione locale e l'architettura locale del collagene del tessuto fibroso della placca. L'importanza della valutazione locale è sottolineata sia dai dati di ceppo che dai dati sul collagene presentati nella sezione dei risultati, che mostrano la natura eterogenea del tessuto. Pertanto, l'uso di tecniche che consentono la valutazione locale, come quelle utilizzate in questo protocollo, è raccomandato per studi futuri sulle proprietà della placca fibrosa.

La preparazione del campione di prova è tra le fasi critiche di questo protocollo. Le placche carotidei sono principalmente tessuti collagenosi; tuttavia, possono contenere calcificazioni che si ritiene influenzino il comportamento meccanico complessivo della placca36,37. Poiché lo studio si concentra sulla componente fibrosa della placca, le calcificazioni vengono evitate nei campioni di prova utilizzando l'imaging μCT38. Se la μCT non è disponibile, altre tecniche di imaging come la risonanza magnetica o l'OCT39 possono essere prese in considerazione per rilevare le regioni calcificate nella placca. Ottenere campioni di test di tessuto fibroso privi di calcificazioni e di dimensioni sufficientemente grandi da poter essere lavorati per test meccanici può essere un compito impegnativo per le placche che sono fortemente calcificate o contengono calcificazioni disperse. Un altro compito impegnativo nel protocollo è generare un modello di speckle ottimale per la correlazione delle immagini digitali. Il DIC ottimale richiede un rapporto bianco/nero di 50:5028 e macchia le dimensioni da tre a cinque pixel29 per garantire una qualità adeguata. Il mancato rispetto di questi requisiti può comportare misurazioni locali della deformazione imprecise. Infine, mappare la posizione di rottura alle immagini SHG può essere difficile se i punti di riferimento naturali di un tessuto non sono chiari. Per tali campioni, sarà utile l'applicazione di diversi marcatori fiduciali al tessuto prima dell'imaging.

La tecnica MPM-SHG utilizzata nel protocollo attuale è superiore a molte altre tecniche di imaging del collagene, in quanto è una tecnica ad alta risoluzione e non distruttiva con una profondità di penetrazione relativamente grande. Tuttavia, la profondità di penetrazione (<400 μm) di MPM-SHG pone un limite, in quanto non consente di visualizzare l'intero spessore dei campioni di prova, che variava tra 0,5 e 2 mm. In un recente studio con la risonanza magnetica del tensore di diffusione (DT-MRI), abbiamo dimostrato che l'orientamento predominante delle fibre nelle parti più profonde del tessuto della placca può essere diverso da quello nelle parti luminali più superficiali del tessuto14. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per studiare l'architettura locale del collagene nelle parti più profonde dei campioni di tessuto a placche fibrose spesse e la sua relazione con la meccanica dei tessuti locali. A tale scopo, è possibile utilizzare l'imaging nel dominio della frequenza spaziale polarizzata (pSFDI). Questa tecnica di imaging ottico recentemente sviluppata ha il potenziale per misurare l'orientamento delle fibre fino a 0,8 mm di profondità nei lembi della valvola mitrale12. Il pSFDI offre anche un'acquisizione rapida, che potrebbe anche facilitare la visualizzazione dell'intera area del campione anziché solo una selezione di piastrelle, come nel caso del protocollo attuale. Un'altra limitazione del protocollo attuale è che è possibile identificare solo la deformazione superficiale. In studi futuri, DIC40 multi-view assistita da specchio o correlazione di volume digitale (DVC)41 possono essere inclusi in questo protocollo per ottenere ulteriori informazioni sui ceppi volumetrici e sotterranei.

L'attuale protocollo sperimentale può essere ulteriormente esteso o modificato in diversi modi per ottenere ulteriori informazioni sulla meccanica della rottura della placca e sulla sua relazione con la microstruttura sottostante. In primo luogo, l'attuale protocollo include prove di trazione uniassiali nella direzione circonferenziale. Questo tipo di prova meccanica è stato scelto poiché la placca presenta prevalentemente un allungamento della trazione nella direzione circonferenziale in vivo. Per una caratterizzazione meccanica più completa, questo protocollo può essere ulteriormente esteso per incorporare test di gonfiaggio, test biassiali o test di trazione uniassiale in direzione longitudinale. In secondo luogo, l'attuale protocollo si concentra solo sull'ottenimento di ceppi locali attraverso DIC. Tuttavia, una visione più completa del comportamento meccanico della placca può essere acquisita includendo anche l'analisi delle sollecitazioni locali nel protocollo, ma ciò richiede la caratterizzazione della rigidità locale. Sebbene attualmente impegnativo, questo può essere ottenuto con tecniche computazionali come il metodo degli elementi finiti inversi 42,43 e il metodo dei campi virtuali44. Oltre all'adattamento sperimentale, alcuni passaggi aggiuntivi di post-elaborazione possono anche essere aggiunti al protocollo corrente. In primo luogo, invece di identificare solo la posizione della rottura, il percorso di propagazione della cricca può essere identificato tramite le immagini della telecamera ad alta velocità ottenute. Questo percorso di propagazione può essere correlato a parametri strutturali e meccanici locali. In secondo luogo, la posizione di inizio della rottura è stata identificata visivamente nel protocollo descritto. Uno studio precedente sui tessuti non biologici ha utilizzato le discontinuità nelle misurazioni della deformazione DIC per rilevare la rottura45. L'applicazione di tale rilevamento automatico della rottura sui tessuti della placca può migliorare l'accuratezza del rilevamento della rottura. Infine, un grande vantaggio di MPM-SHG rispetto ad altre tecniche di imaging del collagene è che visualizza le singole fibre di collagene. Pertanto, i dati ottenuti tramite questo protocollo possono anche essere utilizzati per studiare ulteriori caratteristiche locali del collagene, come il contenuto di collagene.

Questo protocollo può essere utilizzato per fornire una migliore comprensione delle caratteristiche locali del tessuto fibroso della placca, il componente che fallisce meccanicamente nella rottura della placca in vivo. Queste informazioni sono necessarie per stabilire nuovi marcatori di imaging strutturale e funzionale che predicono la rottura della placca nei pazienti. Questi nuovi marcatori sono necessari, poiché i biomarcatori di rischio precedentemente suggeriti hanno dimostrato di avere un valore predittivo subottimale per eventi clinici futuri 5,6. In futuro, OCT e ps-OCT possono eventualmente identificare e quantificare il tessuto fibroso nel sistema arterioso46,47,48. Inoltre, il ceppo è stato considerato un marcatore surrogato per la composizione della placca locale49. Pertanto, le misurazioni del ceppo in vivo 49 potrebbero potenzialmente aiutare nell'identificazione della stabilità della placca nei pazienti. Tuttavia, si dovrebbe fare attenzione a tradurre direttamente i risultati ottenuti nella rottura della placca in vivo. In primo luogo, il tessuto della placca fibrosa subisce un carico più complesso in vivo rispetto al carico di trazione unidirezionale utilizzato in questo protocollo. In secondo luogo, le placche aterosclerotiche sono strutture multicomponente; Le distribuzioni in vivo dello stress e della deformazione nel tessuto fibroso della placca possono essere influenzate dalla presenza e dalla posizione degli altri componenti della placca, come le calcificazioni37.

Questa pipeline di meccano-imaging può anche essere utilizzata per studiare altri tessuti collagenosi. I test meccanici globali e l'imaging strutturale del collagene sono già ampiamente utilizzati per i tessuti biologici. Tuttavia, la valutazione locale delle proprietà di pre-cedimento e fallimento, nonché dell'architettura del collagene, è fondamentale per un'accurata caratterizzazione meccanica di tessuti fibrosi eterogenei. Prevediamo che la struttura di questo nuovo protocollo fornirà ulteriori informazioni sull'interazione tra la microstruttura e la meccanica di diversi tessuti biologici.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione NWO-Vidi (18360).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anello di prolunga da 10 mmThorlabs Inc.CML10
Tubo da 15 mLVWR525-0150
20x APO Obiettivo ad immersione in acquaLeica507701
Software per affettatrice 3DN/AVersione 4.11
Tubi da 50 mLVWR525-0156
Pistola per aerografo AB 430- diametro ugello 0,3 mmConrad4.01614E+12
Oscurante, tessuto di nylon con Rivestimento in poliuretanoThorlabs
Colorante per tessuti neriPolysciences inc24113-2
Obiettivo della fotocamera, lunghezza focale 50 mmThorlabs Inc.
Supporto per telecameraVWR241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra laser multifotonecoerente
+ tubo dell'ariaJUN-AIR, ConradB07GB9HC62, 4016138577198
ExcelMicrosoftVersione 2208
Nastro in schiuma biadesivo, 1,9 x 150 cmPattex
Bagno di riscaldamentoN/A
Telecamera ad alta velocità su misura + software di imagingPixelink-Navitar Inc.PL-D725
Placche aterosclerotiche carotidee umane (da chirurgia di endoarteriectomia carotidea)N/A
Immagine JNational Institute of HealthN/A
LAS-AFLeicaVersione 2.3Software di imaging microscopio multifotone
LEICA TCS SP5 IILeicautilizzato per l'imaging SHG
Sistema di illuminazioneAMZ instrumentsLED-60TBUtilizzato per ottenere immagini nitide con la telecamera ad alta velocità
MATLABMathWorksVersione R2021A
Software FibLab basato su MATLABEindhoven University of TechnologyN/A
Strumento FOA (Fibre Orientation Analysis) basato su MATLABEindhoven University of TechnologyN/A
Software Ncorr basato su MATLABGeorgia Institute of TechnologyVersione 1.2
AghiEmeraldBDAM302986
Petri (diametro 10 cm)VWRBRND452000
ParafilmVWR291-1214
Pasteur PipetteVWRELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro tomografia computerizzata (μ Scanner CT) + Filtro a raggi X di Cu 0,06 mm + Al 0,5 mmPerkinElmerCLS149276
RighelloStrumenti di scienzafine 1800030
Carta vetrata (P180)Conrad4.00932E+12
Taglierina lateraleConrad4.25084E+12
Base di elastomero siliconico e agente indurente (Sylgard 184)VWR634165S
Tester di trazione + software + morsettiN/ARealizzato internamente utilizzando un attuatore lineare cilindrico (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.) e una cella di carico da 10 N (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Cacciavite dinamometricoGarant, gruppo Hoffman659906
MVL50M1 Compressore Microscopio

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5, 1-18 (2019).">Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5, 1-18 (2019).
  2. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).">Visseren, F., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).
  3. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).">Jang, I. K., et al. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).
  4. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).">Ohayon, J., et al. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).
  5. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).">SCOT-HEART investigators. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).
  6. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).">Williams, M. C., et al. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).
  7. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).">Kwak, B. R. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).
  8. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).">Akyildiz, A. C., Speelman, L., Gijsen, F. J. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).
  9. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).">Loree, H. M., Grodzinsky, A. J., Park, S. Y., Gibson, L. J., Lee, R. T. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).
  10. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).">Holzapfel, G. A., Sommer, G., Regitnig, P. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).
  11. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).">Maher, E., et al. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).
  12. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).">Teng, Z. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).
  13. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).">Lendon, C. L., Davies, M. J., Richardson, P. D., Born, G. V. R. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).
  14. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).">Akyildiz, A. C. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).
  15. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).">Johnston, R. D., Gaul, R. T., Lally, C. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).
  16. Multiphoton microscopy. Nature Photonics. 5 (1), (2010).">Larson, A. M. Multiphoton microscopy. Nature Photonics. 5 (1), (2010).
  17. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).">Pagiatakis, C., Galaz, R., Tardif, J. C., Mongrain, R. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).
  18. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).">Niestrawska, J. A., et al. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).
  19. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866(2021).">Woessner, A. E., Jones, J. D., Witt, N. J., Sander, E. A., Quinn, K. P. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866(2021).
  20. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).">Kujawinska, M., et al. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).
  21. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).">Luo, Y., Duprey, A., Avril, S., Lu, J. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).
  22. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).">Bonati, L. H., et al. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).
  23. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).">Hemmasizadeh, A., Darvish, K., Autieri, M. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).
  24. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).">Fedorov, A., et al. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
  25. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).">Mulvihill, J. J., Walsh, M. T. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).
  26. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).">Walsh, M. T., et al. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).
  27. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763(2020).">Walsh, D. R. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763(2020).
  28. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).">Palanca, M., Tozzi, G., Cristofolini, L. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).
  29. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).">Zhou, P., Goodson, K. E. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).
  30. Multiscale vessel enhancement filtering. Lecture Notes in Computer Science. 1496, (1998).">Frangi, A. F., Niessen, W. J., Vincken, K. L., Viergever, M. A. Multiscale vessel enhancement filtering. Lecture Notes in Computer Science. 1496, (1998).
  31. https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023).">Fibertracking Manual. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023).
  32. https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023).">FibLab Different Angle. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023).
  33. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).">van Haaften, E. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  34. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).">Blaber, J., Adair, B., Antoniou, A. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).
  35. http://www.ncorr.com/download/ncorrmanual_v1_2_2.pdf (2017).">NCorr Manual. , Available from: http://www.ncorr.com/download/ncorrmanual_v1_2_2.pdf (2017).
  36. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).">Barrett, H. E., Vander Heiden, K., Farrell, E., Gijsen, F., Akyildiz, A. C. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).
  37. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).">Gijsen, F. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).
  38. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).">Zhang, L. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).
  39. Imaging cardiovascular calcification. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-15 (2018).">Wang, Y., Osborne, M. T., Tung, B., Li, M., Li, Y. Imaging cardiovascular calcification. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-15 (2018).
  40. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).">Chen, B., Zhao, J., Pan, B. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).
  41. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).">Santamarıa, V. A. A., Garcıa, M. F., Molimard, J., Avril, S. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).
  42. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996(2022).">Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996(2022).
  43. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009(2021).">Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009(2021).
  44. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering - CMBE2019. , (2019).">vanden Berg, R., Avril, S., Gijsen, F. J. H., Akyildiz, A. C. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering - CMBE2019. , (2019).
  45. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).">Helm, J. D. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).
  46. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).">Nadkarni, S. K., et al. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).
  47. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).">Nadkarni, S. K., Bouma, B. E., de Boer, J., Tearney, G. J. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).
  48. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).">Villiger, M. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).
  49. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).">Schaar, M. D., et al. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Collagen StructureAtherosclerotic PlaqueFibrous TissueMechanical PropertiesMultiphoton MicroscopySecond Harmonic GenerationDigital Image CorrelationUniaxial Tensile TestingCollagen Fiber OrientationPlaque Rupture

Related Articles