Articolo metodologico

Isolamento dei vettori di terapia genica di prossima generazione attraverso l'ingegneria, il codice a barre e lo screening delle varianti del capside del virus adeno-associato (AAV)

DOI:

10.3791/64389

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18 ottobre 2022

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1Department of Infectious Diseases/Virology, Section Viral Vector Technologies, Medical Faculty, University of Heidelberg, 2BioQuant Center, BQ0030, University of Heidelberg, 3Cluster of Excellence CellNetworks, 4German Center for Infection Research (DZIF), 5German Center for Cardiovascular Research (DZHK)

In questo articolo

Sommario

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Generazione della libreria di visualizzazione dei peptidi AAV e successiva validazione attraverso il codice a barre di candidati con nuove proprietà per la creazione di AAV di nuova generazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I vettori di rilascio genico derivati dal virus adeno-associato (AAV) sono uno degli strumenti più promettenti per il trattamento delle malattie genetiche, evidenziato da dati clinici incoraggianti e dall'approvazione di diverse terapie geniche AAV. Due ragioni principali per il successo dei vettori AAV sono (i) il precedente isolamento di vari sierotipi virali naturali con proprietà distinte e (ii) la successiva creazione di potenti tecnologie per la loro ingegneria molecolare e il loro riutilizzo ad alto rendimento. A rafforzare ulteriormente il potenziale di queste tecniche sono state recentemente implementate strategie per la codifica a barre di capsidi AAV selezionati a livello di DNA e RNA, consentendo la loro stratificazione completa e parallela in vivo in tutti i principali organi e tipi di cellule in un singolo animale. Qui, presentiamo una pipeline di base che comprende questo insieme di strade complementari, utilizzando la visualizzazione del peptide AAV per rappresentare il variegato arsenale di tecnologie di ingegneria del capside disponibili. Di conseguenza, descriviamo prima i passaggi cruciali per la generazione di una libreria di visualizzazione del peptide AAV per la selezione in vivo di candidati con proprietà desiderate, seguita da una dimostrazione di come codificare a barre le varianti di capside più interessanti per lo screening secondario in vivo. Successivamente, esemplificamo la metodologia per la creazione di librerie per il sequenziamento di nuova generazione (NGS), tra cui l'amplificazione dei codici a barre e la legatura degli adattatori, prima di concludere con una panoramica dei passaggi più critici durante l'analisi dei dati NGS. Poiché i protocolli qui riportati sono versatili e adattabili, i ricercatori possono facilmente sfruttarli per arricchire le varianti ottimali di capside AAV nel loro modello di malattia preferito e per applicazioni di terapia genica.

Introduzione

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La terapia di trasferimento genico è l'introduzione di materiale genetico nelle cellule per riparare, sostituire o alterare il materiale genetico cellulare per prevenire, trattare, curare o migliorare la malattia. Il trasferimento genico, sia in vivo che ex vivo, si basa su diversi sistemi di veicola, non virali e virali. I virus si sono evoluti naturalmente per trasdurre in modo efficiente le loro cellule bersaglio e possono essere utilizzati come vettori di consegna. Tra i diversi tipi di vettori virali impiegati nella terapia genica, i virus adeno-associati sono stati sempre più utilizzati, a causa della loro mancanza di patogenicità, sicurezza, b....

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Protocollo

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1. Preparazione della libreria di visualizzazione del peptide casuale 7-mer AAV2

NOTA: Per la preparazione di una libreria di visualizzazione di peptidi casuali AAV2, sintetizzare gli oligonucleotidi degenerati come DNA a singolo filamento, convertirlo in DNA a doppio filamento, digerire, ligate al plasmide accettore ed elettromerato.

  1. Progettazione di oligonucleotidi degenerati
    1. Ordinare gli oligonucleotidi degeneri ed evitare la distorsione del codone. Nell'oligonucleotide 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)7 GCCCAGGCGGCTGACGAG 3', X01 corrisponde a 20 codoni, ciascuno dei quali codifica per uno dei 20....

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Risultati

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Generazione di una libreria di visualizzazione del peptide AAV2. Come primo passo verso la selezione di AAV ingegnerizzati, viene descritta la generazione di una libreria di plasmidi. L'inserto peptidico viene prodotto utilizzando primer degenerati. Ridurre la combinazione di codoni in quelli da 64 a 20 ha il vantaggio di eliminare i codoni di stop e facilitare l'analisi NGS, riducendo la diversità della libreria sul DNA ma non il livello proteico. L'inserto oligonucleotidico viene acquistato come DNA a.......

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Discussione

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In questo protocollo, vengono delineati i passaggi necessari per l'ingegneria del capside AAV di visualizzazione del peptide e per lo screening della libreria AAV con codice a barre, nonché per l'analisi bioinformatica della composizione della libreria e delle prestazioni del capside. Questo protocollo si concentra sui passaggi che facilitano l'analisi bioinformatica di questi tipi di librerie, perché la maggior parte dei laboratori di virologia sono in ritardo nelle capacità di programmazione per abbinare la loro compet.......

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Dichiarazioni

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D.G. è co-fondatore di AaviGen GmbH. D.G. e K.R. sono inventori di una domanda di brevetto pendente relativa alla generazione di varianti di capside AAV che eludono il sistema immunitario. Il resto degli autori non ha nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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D.G. apprezza molto il sostegno della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) attraverso i centri di ricerca collaborativa DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) e TRR179 (Projektnummer 272983813), nonché del Centro tedesco per la ricerca sulle infezioni (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Primer di amplificazioneELLA Biotech (Monaco di Baviera, Germania)-Sintesi del secondo filamento dell'inserto oligonucleotidico
Reagenti Agilent DNA 1000Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)5067-1504Validazione di frammenti di DNA
Sistema di bioanalizzatori Agilent 2100Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)Validazione di frammenti di DNAG2938C
AllPrep DNA/RNA Mini KitQiagen (Venlo, Paesi Bassi)80204Estrazione di DNA/RNA
Agilent DNA 1000 ReagentiAgilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)5067-1504Preparazione della libreria NGS
Sistema di bioanalizzatori Agilent 2100Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)G2938CPreparazione della libreria
NGS BC-seq fw: IDT (San Joce, CA, CA, USA)atcactctcggcatggacgagc Preparazione della libreria NGS
BC-seq rv:   IDT (San Joce, CA, CA, USA)ggctggcaactagaaggcaca Preparazione della libreria NGS
β-MercaptoetanoloMillipore Sigma (Burlington, MA, USA)44-420-3250MLEstrazione DNA/RNA
BglINew England Biolabs (Ipswich, MA, USA)R0143Digestione dell'inserto a doppio filamento
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad (Hercules, CA, USA)1851196dd-PCR
cycler dNTPS New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)N0447SPreparazione della libreria
NGS ddPCR Supermix per sonde (no dUTP)Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1863024dd-PCR supermix
Olio per generazione di goccioline per sondeBio-Rad (Hercules, CA, USA)1863005dd-PCR Olio per generazione di goccioline
DG8 Cartucce per generatore di gocce QX100 / QX200Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1864008Cartuccia per generazione di goccioline dd-PCR
DG8 Cartridge HolderBio-Rad (Hercules, CA, USA)1863051dd-PCR Generatore
gocce DG8 GasketBio-Rad (Hercules, CA, USA)1863009coperchio dd-PCR per cartuccia ddPCR
Piastre 96 pozzetti, Semi-SkirtedBio-Rad (Hercules, CA, USA)12001925dd-PCR Piastra a 96 pozzetti
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent CelleLucigen (Middleton, WI, USA)60081-1Celle elettrocompetenti
Cuvette per elettroporazione, 1mmBiozym Scientific (Oldendorf, Germania)748050
Miscela primer/sonda GAPDHThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)Mm00186825_cnPrimer Taqman qPCR
Genepulser XcellBio-Rad (Hercules, CA, USA)1652660
Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacitàApplied Biosystems (Waltham, MA, USA)4368814trascrizione inversa del cDNA
ITR_fwIDT (San Joce, CA, USA)GGAACCCCTAGTGATGGAGTAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)primer dd-PCR
ITR_rvIDT (San Joce, CA, USA)CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)Primer dd-PCR
ITR_probeIDT (San Joce, CA, USA)HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)Sonda dd-PCR
Illumina NextSistema Seq 500Illumina Inc (San Diego, CA, USA)SY-415-1001NGS Library sequenziamento
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*Roche AG (Basilea, Svizzera)KK2600 07958919001Preparazione dei campioni NGS
Dispositivo di separazione magnetica MagnaBot 96Promega GmbH (Madison, WI, USA)V8151Preparazione dei campioni per la libreria NGS
Spettrofotometro NanoDrop 2000Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)ND-2000Digestione dell'inserto a doppio filamento
NGS_frwSigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)Gtt CTG tat CTA CCA ACC TCNGS primer
NGS_revSigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)CGC CTT GTG TGT TGA CAT CNGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cicli)Illumina Inc (San Diego, CA, USA)FC-404-2005NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)9092-256NGS Preparazione della libreria
PX1 Sigillante per piastre Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1814000sigillante per piastre dd-PCR
Termosaldatore a foglio perforabileBio-Rad (Hercules, CA, USA)1814040foglio sigillante dd-PCR
Phusion DNA-Polymerase ad alta fedeltàThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)F530SSintesi del secondo filamento dell'inserto oligonucleotidico
PEI MAX - Polietilenimmina cloridrato lineare di grado di trasfezione (MW 40.000)Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)24765-1GPreparazione della libreria AAV
Sistema di purificazione selettivaProNex Promega GmbH (Madison, WI, USA)NG2002Preparazione del campione per la libreria NGS
Phusion Hot Start II Polimerasi Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)F549LNGS Preparazione della libreria
Proteinasi KRoche AG (Basilea, Svizzera)5963117103estrazione di DNA/RNA
pRep2Cap2_PISvettore ITR-Rep2Cap2-ITR. Sito di inserzione di peptidi all'interno dell'ORF Cap2, prodotto/preparato in laboratorio
Generatore di goccioline QX200Bio-Rad (Hercules, CA, USA)1864002generatore di gocce dd-PCR
QX200 Lettore di gocceBio-Rad (Hercules, CA, USA)1864003analisi delle goccioline dd-PCR
Kit di rimozione dei nucleotidi QIAquickQiagen (Venlo, Paesi Bassi)28306Sintesi del secondo filamento di purificazione dell'inserto di oligonucleotidi
Kit di estrazione su gel QIAquickQiagen (Venlo, Paesi Bassi)28704Purificazione di vettori plasmidici
QIAGEN Maxi KitQiagen (Venlo, Paesi Bassi)12162Preparazione del DNA della libreria plasmidica
Qiaquick PCR Kit di purificazioneQiagen (Venlo, Paesi Bassi)28104Preparazione del campione per la libreria NGS
Fluorimetro QubitInvitrogen (Waltham, MA, USA)Q32857Preparazione della libreria NGS
Qubit dsDNA HSThermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)Q32851NGS Preparazione della libreria
QuantiFast PCR Master MixQiagen (Venlo, Paesi Bassi)1044234Taqman qPCR
rep_fwIDT (San Joce, CA, USA)AAGTCCTCGGCCCAGATAGACdd-PCR primer
rep_rvIDT (San Joce, CACE,CAATCACGGCGCACATGTdd-PCR primer
rep_probeIDT (San Joce, CA, USA)FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1dd-PCR
RNasi libera DNasiQiagen (Venlo, Paesi Bassi)79254Estrazione di DNA/RNA
SfiINew England Biolabs (Ipswich, MA, USA)R0123Digestione del vettore
5 mm, acciaio PerleQiagen (Venlo, Paesi Bassi)69989Estrazione di DNA/RNA
TRIMERI-oligonucleotidiELLA Biotech (Monaco di Baviera, Germania)-Oligonucleotide degenere
T4 LigasiNew England Biolabs (Ipswich, MA, USA)M0202LLegatura della libreria plasmidica
TissueLyserLTQiagen (Venlo, Paesi Bassi)85600Estrazione di DNA/RNA
YFP_fwIDT (San Joce, CA, USA)GAGCGCACCATCTTCTTCAAGdd-PCR primer
YFP_rvIDT (San Joce, CA, USA)TGTCGCCCTCGAACTTCACprimer dd-PCR
YFP_probeIDT (San Joce, CA, USA)FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1sonda dd-PCR
Zymo DNA Clean & Concentratore-5 (Capped)Ricerca Zymo (Irvine, CA, USA)D4013Purificazione di vettori e ligazioni
di per elettroporazione per elettroporazione sonda

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  2. Muhuri, M., Levy, D. I., Schulz, M., McCarty, D., Gao, G. Durability of transgene expression after rAAV gene ....

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