Microcosmi di compost come ambienti microbicamente diversi e simili a quelli naturali per la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans

Il nematode Caenorhabditis elegans sta emergendo come un modello utile per studiare le interazioni tra gli ospiti e i loro microbiomi intestinali ^1,2. Come modello, offre diversi vantaggi. In primo luogo, gli animali privi di germi o gnotobiotici sono facili da ottenere e mantenere; La candeggina può essere usata per uccidere i vermi gravidi e i microbi associati, lasciando illese le loro uova resistenti alla candeggina per crescere come popolazioni sincronizzate per età che possono essere colonizzate da batteri di interesse ^3,4. Inoltre, quando coltivato in presenza di batteri, C. elegans, un batterivoro, ingerisce i batteri incontrati, con specie sensibili digerite o escrete, mentre le specie resistenti e persistenti colonizzano stabilmente l'intestino del verme. Inoltre, i C. elegans sono per lo più ermafroditi, producendo popolazioni di progenie geneticamente identica, che riduce la variazione genetica confondente. Insieme alla disponibilità di ceppi di vermi mutanti e transgenici, lavorare con C. elegans offre ai ricercatori un modello gnotobiotico e geneticamente trattabile per studiare le basi molecolari delle interazioni ospite-microbo^5,6,7,8.

Mentre gli esperimenti con batteri ben caratterizzati possono facilitare l'analisi dei meccanismi molecolari, identificare e studiare i batteri con cui i vermi interagiscono in natura sono essenziali per esplorare la diversità di tali meccanismi, svelare il contesto naturale per la loro funzione e comprendere le forze selettive che hanno modellato la loro evoluzione. Al di fuori del laboratorio, C. elegans si trova a livello globale in climi temperati umidi, dove si pensa che le popolazioni subiscano un ciclo di vita "boom-and-bust", caratterizzato da una rapida crescita della popolazione quando le risorse sono abbondanti, seguita da uno spostamento evolutivo verso pionieristici e tolleranti allo stress quando le risorse sono esaurite⁹. Sebbene sia considerato un nematode del suolo, le popolazioni selvatiche proliferanti di C. elegans si trovano più comunemente a nutrirsi di materiale organico in decomposizione come fiori o frutti in decomposizione, dove le popolazioni batteriche sono abbondanti e diversificate.

Gli studi sul microbioma intestinale nei nematodi isolati in natura hanno identificato comunità batteriche diverse, ma caratteristiche, 10,11, la cui composizione è stata ulteriormente supportata da studi condotti con vermi allevati in ambienti microcosmo simili a quelli naturali ^12,13. Insieme, tali studi hanno permesso la delineazione di un microbioma intestinale del verme principale². Mentre il campionamento delle popolazioni di C. elegans in natura rappresenta l'esame più diretto delle interazioni naturali verme-microbo, non è fattibile ovunque e in qualsiasi momento, poiché è limitato a regioni e stagioni con abbondanti precipitazioni^10,11. In alternativa, invece di isolare i vermi dal loro habitat naturale, gli esperimenti che utilizzano microcosmi portano l'habitat naturale in laboratorio 6,8,12,13,14,15. Gli ambienti del microcosmo sono preparati da terreno compostato con vari tipi di frutta o verdura, il che consente un'ulteriore diversificazione della comunità del suolo di partenza. Offrono metodi sperimentali trattabili che combinano la diversità microbica e l'ambiente tridimensionale del suolo selvaggio con i vantaggi sperimentali di una struttura di laboratorio controllata e ceppi di vermi geneticamente definiti. Il protocollo seguente descrive in dettaglio i passaggi coinvolti nel lavoro con i microcosmi del compost, dimostrando il loro uso nella comprensione dell'assemblaggio di un caratteristico microbioma intestinale di vermi da ambienti diversi.

1. Preparazione del compost

1. Ottenere compost o terriccio da giardino da qualsiasi fonte conveniente e conservare all'interno del laboratorio in un contenitore di plastica da cucina standard con fori tagliati nel coperchio per far entrare l'aria. Tappare i fori con cotone idrofilo per tenere lontani i moscerini della frutta e altri invertebrati (Figura 1A).
   NOTA: Cinquecento grammi di terreno (adatto in un contenitore da 1,5 galloni, dimensioni: 30 cm x 20 cm x 10 cm) forniranno materiale sufficiente per 12 microcosmi.
2. Arricchire il compost o il terreno con prodotti tritati o una miscela di prodotti diversi in un rapporto di massa 1: 2 tra prodotti e terreno.
3. Incubare per 7-14 giorni a 20-25 °C, mescolando una volta al giorno e aggiungendo M9 mezzo se necessario per mantenere l'umidità senza renderla fangosa.
   NOTA: I terreni non arricchiti con prodotti di solito non supportano la crescita di C. elegans , ma quale prodotto specifico utilizzare spetta al ricercatore, con molti tipi e miscele in grado di supportare la crescita del verme. L'arricchimento con prodotti diversi promuoverà la diversificazione della comunità batterica in modi diversi, consentendo lo studio dell'assemblaggio del microbioma intestinale da diversi punti di partenza (vedere la sezione di discussione).

2. Preparazione di microcosmi di compost

1. Per ciascun microcosmo, aggiungere 10 g di compost arricchito in un becher di vetro da 30 ml ricoperto di carta stagnola e autoclave (figura 1B).
2. Per preparare l'estratto microbico per reintegrare il compost autoclavato, iniziare aggiungendo 30 g dello stesso compost utilizzato nella fase 2.1 a ciascuno dei tre tubi da 50 ml e riempire con M9. Vortice per 1 minuto (Figura 1C).
   NOTA: Questo dovrebbe fornire abbastanza batteri per nove microcosmi, ognuno dei quali supporta lo sviluppo di centinaia di nematodi.
3. Centrifugare i tubi a 560 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Facendo attenzione a non disturbare il pellet, rimuovere i surnatanti con una pipetta sierologica e combinare in un nuovo tubo da 50 ml.
5. Concentrare l'estratto batterico centrifugando alla massima velocità (2.000 × g) per 15 minuti a RT. Risospendere i pellet in sufficiente M9 per avere 200 μL per ogni microcosmo e 200 μL in più da aggiungere a una piastra che servirà come proxy visibile dello sviluppo dei vermi all'interno dei microcosmi.
   NOTA: Ad esempio, per nove microcosmi, risospendere il pellet microbico in 2 ml di M9.
6. Aggiungere 200 μL dell'estratto microbico concentrato a ciascun becher di compost autoclavato, nonché a una piastra NGM che fungerà da piastra proxy visibile.
7. Incubare microcosmi e piastra proxy per 24 h a 20-25 °C prima dell'aggiunta di vermi.

3. Allevare vermi nei microcosmi del compost

1. Aggiungere 500-1000 uova o larve L1³ a ciascun microcosmo e alla piastra proxy (passo 2.7) per iniziare l'esperimento (Figura 1D).
   NOTA: Gli esperimenti qui descritti utilizzano vermi wild-type N2. Tuttavia, altri ceppi di C. elegans (e potenzialmente altri nematodi) possono essere utilizzati.
2. Portare i vermi all'età adulta a 20 °C (in genere 3 giorni).

Figura 1: Preparazione dei microcosmi del compost, allevamento di vermi e raccolta . (A) Arricchire il suolo locale o il compost con prodotti e incubare per 2 settimane. Combinare (B) terreno arricchito in autoclave con (C) estratto microbico e (D) incubare per almeno 24 ore prima di aggiungere vermi L1s sincronizzati ai microcosmi per iniziare l'esperimento. (E, F) Quando è pronto per la raccolta, aggiungere il compost dal microcosmo in un cilindro di supporto a imbuto Baermann e coprire con M9. (G) Dopo 15 minuti, rilasciare il filtrato in una provetta da 50 ml. Abbreviazione: sup. = supernatante. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

4. Preparazione di un imbuto Baermann per la raccolta dei vermi

1. Assemblare un imbuto Baermann attaccando 5-8 cm di tubo di gomma rigida all'estremità di un imbuto di plastica.
2. Far scorrere un morsetto sul tubo e bloccarlo.
3. Posizionare nell'imbuto un tubo cilindrico in PVC lungo 7 cm e diametro 5 cm con una rete di nylon da 1 mm incollata sul fondo (Figura 1E). Foderare il cilindro con due fogli di carta velina.
4. Inserire l'imbuto Baermann in un matraccio (Figura 1F).

5. Raccolta di vermi da microcosmi e raccolta dei rispettivi campioni di terreno

1. Aggiungere 20 ml di M9 al microcosmo in cui sono stati sollevati i vermi, agitare la miscela e quindi versare la miscela dal becher nel cilindro rivestito di carta velina nella configurazione dell'imbuto Baermann. Aggiungi più M9 per immergere completamente il compost nell'imbuto.
   NOTA: Le popolazioni di C. elegans (N2) raggiungono l'età adulta in microcosmi di compost ad un ritmo simile a quello delle piastre di agar standard seminate con Escherichia coli. Per ulteriori accuratezze nella raccolta dei vermi in una specifica fase di sviluppo, fare riferimento alla piastra proxy del passaggio 3.3.
2. Dopo 30 minuti, sganciare il morsetto per rilasciare il filtrato contenente i vermi raccolti in una provetta da 50 ml (Figura 1G).
3. Aggiungi più M9 al cilindro e ripeti per un secondo round per raccogliere più vermi, e ancora una volta se sono necessari altri vermi.
   NOTA: quando si ripetono i cicli di raccolta, fare attenzione a non compromettere l'integrità della carta velina, che potrebbe consentire il passaggio delle particelle di terreno. Un massimo di quattro cicli di raccolta dovrebbero isolare almeno il 50% dei vermi originariamente aggiunti al microcosmo senza compromettere l'integrità della carta velina.
4. Concentrare i vermi centrifugando a 560 × g per 2 minuti (RT). Rimuovere 35 mL di surnatante con una pipetta sierologica.
5. Trasferire i restanti 15 ml in una provetta da 15 ml e centrifugare nuovamente a 560 × g per 1 minuto per concentrare ulteriormente i vermi. Rimuovere 14 ml del surnatante con una pipetta sierologica.
6. In parallelo, raccogliere 1 g del terreno del microcosmo rimanente in un tubo da 1,5 ml. Trattare immediatamente i campioni di terreno contenenti la comunità batterica ambientale o conservarli a -20 °C per la successiva estrazione degli acidi nucleici, come descritto di seguito per i campioni di vermi.

6. Lavaggio e sterilizzazione superficiale dei vermi raccolti

1. Trasferire 1 mL dei vermi concentrati e raccolti dal punto 5.5 a un tubo da 1,5 mL usando una pipetta di vetro. Incubare per 2 minuti per consentire ai vermi di depositarsi sul fondo del tubo. Rimuovere il surnatante, lasciando indisturbati i 100 μL inferiori.
2. Lavare 6 volte con 1,5 ml di M9+T (0,025% Triton-X in M9), lasciando che i vermi si depositino sul fondo ogni volta.
3. Trasferire i vermi lavati in un volume di 100 μL in una nuova provetta da 1,5 mL utilizzando una pipetta di vetro.
   NOTA: A questo punto del protocollo, dovrebbero essere trascorsi circa 30 minuti dal primo lavaggio (passaggio 6.2). Si raccomanda di lasciare che i vermi rimangano senza cibo per almeno 1 ora prima dell'aggiunta di levamisolo per consentire l'escrezione di batteri transitori e la completa digestione dei batteri alimentari.
4. Aggiungere 100 μL di 25 mM di levamisolo cloridrato per paralizzare i vermi. Incubare per 5 minuti a RT.
5. Aggiungere 200 μL di soluzione di candeggina al 4%. Incubare per 2 min.
6. Rimuovere il surnatante, lasciando indisturbato il fondo da 150 μL, e lavare 3x con M9+T, come sopra.
   NOTA: Per ridurre al minimo la contaminazione dei campioni, si consiglia di utilizzare M9+T filtrato (attraverso un filtro da 0,2 μm) e di indossare guanti da questo punto in poi.
7. Dopo i lavaggi, prelevare 50 μL dei restanti 150 μL dall'ultimo lavaggio e placcare su una piastra LB, incubando a 25 °C per 48 ore per confermare l'effettiva rimozione dei batteri esterni.
   NOTA: L'osservazione di un massimo di 30 colonie nell'ultimo lavaggio (che rappresentano 60 cellule batteriche esterne totali rimanenti nel campione) è consentita e ci si aspetta che abbia solo un contributo marginale alla composizione del microbioma analizzata, date le migliaia di batteri che tipicamente colonizzano ogni verme adulto¹⁵. Quando se ne osservano di più, l'integrità del campione potrebbe essere compromessa.
8. Utilizzare immediatamente i vermi sterilizzati in superficie (ad esempio, per estrarre batteri vivi per la coltura [conteggi CFU]) o conservare a -20 °C per la successiva estrazione di acidi nucleici.

7. Estrazione del DNA

NOTA: I seguenti passaggi descrivono l'estrazione del DNA dei vermi raccolti utilizzando un kit commerciale progettato per l'estrazione di DNA microbico dal suolo (vedi Tabella dei materiali), con le modifiche descritte di seguito per facilitare l'estrazione del DNA microbico dai vermi.

1. Trasferire il campione contenente vermi sterilizzati in superficie (sbrinare a RT se necessario) nelle provette fornite dal kit, sostituendo le perle di vetro fornite con circa 30-50 perle di zirconia del diametro di 1 mm (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Le rese di DNA osservate sono più elevate con le perle di zirconia rispetto alle perle di vetro fornite dal kit. Sebbene la ragione alla base di questa osservazione rimanga indeterminata, le perle di zirconia possono aprire la cuticola del nematode in modo più efficiente, rilasciando più batteri.
2. Per i campioni di compost, aggiungere circa 250 mg del terreno raccolto ai tubi del kit senza sostituire le perle di vetro.
3. Dopo l'aggiunta della soluzione tampone fornita dal kit a tutti i campioni, omogeneizzare con un omogeneizzatore di potenza a RT (vedi Tabella dei materiali) per due giri di 2.000 giri/min per 30 s ciascuno, fermandosi per 30 s in mezzo.
4. Completare le restanti fasi di purificazione del DNA secondo il protocollo del kit. Eluire i campioni di vermi in non più di 50 μL di tampone di eluizione per garantire concentrazioni di DNA sufficientemente elevate per il sequenziamento.

Per esplorare la capacità di diversificare la comunità dei microcosmi del suolo, abbiamo confrontato le comunità microbiche nei microcosmi di compost preparati arricchendo lo stesso terreno iniziale, un compost di livello industriale disponibile dalla città di Berkeley, in California, con prodotti diversi: mele, peperoni, arance o patate (ciascuno impostato in triplice copia). Abbiamo inoltre confrontato le comunità microbiche di ciascun ambiente di compostaggio con il microbioma intestinale di C. elegans selvatici allevati nel rispettivo microcosmo. L'analisi è stata eseguita con campioni di DNA estratti da circa 500 adulti sterilizzati in superficie per microcosmo e da campioni di compost da 250 mg dei rispettivi microcosmi.

La caratterizzazione dei microbiomi ambientali del suolo e dell'intestino dei vermi si è basata sul sequenziamento di nuova generazione della regione V4 del gene rRNA batterico 16S. La preparazione della libreria di sequenziamento è stata ottenuta utilizzando i kit standard ed eseguita secondo le istruzioni dei produttori, con il sequenziamento eseguito su un sequenziatore commerciale (vedi Tabella dei materiali). Le sequenze demultiplexate sono state elaborate utilizzando DADA2, tassonomia assegnata basata sul database di riferimento SILVA v132 e analizzate con phyloseq16,17,18 (vedi file supplementare 1, figura supplementare S1, figura supplementare S2, figura supplementare S3, tabella supplementare S1 e tabella supplementare S2 per una descrizione dettagliata del sequenziamento e dell'analisi; la pipeline computazionale completa è disponibile in GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). I dati grezzi sono disponibili presso l'NCBI Sequence Read Archive (Bioproject ID PRJNA856419).

In media, sono state ottenute 73.220 sequenze per campione. Queste sequenze rappresentano 15.027 varianti di sequenza amplicon (ASV), che coprono 27 phyla e 216 famiglie, comprese le famiglie considerate parte del microbioma intestinale13 di C. elegans, come Rhizobiaceae, Burkholderiaceae e Bacillaceae. Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae, che in precedenza erano risultati essere membri dominanti, erano una minoranza questa volta, ma erano ancora arricchiti (2-10 volte) rispetto ai rispettivi ambienti del suolo. I confronti basati su distanze UniFrac19,20 non ponderate e ponderate hanno dimostrato una buona riproducibilità tra microcosmo triplicati arricchiti con lo stesso prodotto, come indicato dal clustering ravvicinato. Al contrario, i microbiomi ambientali del suolo arricchiti con prodotti diversi raggruppati l'uno dall'altro, dimostrando la capacità di diversificare una comunità microbica iniziale attraverso l'aggiunta di prodotti diversi (Figura 2).

Nel confronto tra microbiomi intestinali di vermi e comunità ambientali, l'analisi delle coordinate principali (PCoA) con distanze UniFrac non ponderate o ponderate ha mostrato un raggruppamento distinto di microbiomi intestinali di vermi lontano da quello dei rispettivi ambienti per ciascun tipo di microcosmo (Figura 2). Mentre il PCoA basato su distanze UniFrac non ponderate non distingueva tra microbiomi del suolo e dei vermi (Figura 2A), il raggruppamento basato su distanze ponderate ha rivelato una chiara separazione dei microbiomi dell'intestino del verme e del compost (Figura 2B). Questi risultati supportano un processo in cui il filtraggio dell'ospite opera sulla disponibilità ambientale per modellare un microbioma intestinale che non è completamente distinto dalla sua fonte ambientale per quanto riguarda la presenza di taxa, ma modula la loro abbondanza arricchendo per un sottoinsieme dei taxa disponibili, risultando in definitiva in un microbioma intestinale di vermi centrale condiviso tra vermi allevati in ambienti diversi.

Figura 2: I microbiomi intestinali dei vermi si raggruppano lontano dai rispettivi ambienti microbici diversificati per i prodotti. La composizione del microbioma è stata determinata con il sequenziamento 16S e le comunità di microcosmi arricchiti con i prodotti designati o da vermi allevati in essi sono state raggruppate utilizzando PCoA basato su (A) distanze UniFrac non ponderate o (B) ponderate. Gli assi mostrati sono quelli che spiegano la maggiore variazione nella composizione della comunità tra i campioni (N = 3 per ogni tipo di microcosmo). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: sequenziamento di nuova generazione e analisi dei dati. Di seguito sono presentati i passaggi per la preparazione della libreria, il sequenziamento in laboratorio e l'analisi dei dati. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S1: Un esempio di grafico di controllo qualità per le letture inverse da un campione. L'asse X (ciclo) mostra la posizione del nucleotide lungo la sequenza letta. L'asse Y sinistro mostra il punteggio di qualità. La mappa di calore in scala di grigi rappresenta la frequenza del punteggio di qualità in ciascuna posizione nucleotidica; La linea verde rappresenta il punteggio di qualità mediano in ciascuna posizione nucleotidica; la linea arancione superiore rappresenta i quartili della distribuzione del punteggio di qualità; la linea rossa inferiore rappresenta la percentuale di letture di sequenza che hanno esteso quella posizione nucleotidica (asse Y destro, qui 100%). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Tassi di errore per diversi campioni. La frequenza di errore nei diversi campioni (punti neri) dovrebbe diminuire con l'aumentare del punteggio di qualità per ogni possibile sostituzione della coppia di basi rappresentata, riflettendo la tendenza prevista. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Un esempio di PCoA basato su distanze UniFrac ponderate. I nomi dei gruppi riportati nella legenda rappresentano i prodotti utilizzati per arricchire il compost utilizzato nei diversi microcosmi. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: Filtraggio sequenziale delle sequenze. un Numero di letture della sequenza prima del filtraggio. b-d Ogni colonna rappresenta il numero di letture di sequenza rimanenti dopo una fase di filtraggio: filtraggio delle letture di bassa qualità (passaggio 2.5), algoritmo di denoising eseguito da dada() (passaggio 2.8), unione di letture in avanti e indietro (passaggio 2.9) e rimozione delle chimere (passaggio 2.11). Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S2: tabella dei metadati. Clicca qui per scaricare questo file.

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