Articolo metodologico

Microdissezione dell'occhio del roditore

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DOI:

10.3791/64414

21 aprile 2023

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo per la micro-dissezione oculare nei roditori. Il processo comporta l'enucleazione del bulbo oculare insieme alla membrana nittitante (cioè la terza palpebra). Questo è poi seguito dalla separazione delle conchiglie oculari posteriori e anteriori.

Abstract

La microdissezione oculare dell'occhio del roditore comporta la segmentazione del bulbo oculare enucleato con la membrana nittitante attaccata, o terza palpebra, per ottenere le cosce oculari anteriori e posteriori. Con questa tecnica, le sottoparti dell'occhio, tra cui il tessuto corneale, il tessuto neurale, il tessuto epiteliale pigmentato retinico (RPE) e il cristallino, possono essere ottenute per interi, crio-sezionamento e / o sospensioni monocellulari di uno specifico tessuto oculare. La presenza della terza palpebra presenta vantaggi unici e significativi, in quanto favorisce il mantenimento dell'orientamento dell'occhio, importante per comprendere la fisiologia oculare a seguito di qualsiasi intervento localizzato o in studi che coinvolgono l'analisi oculare relativa alla topografia spaziale dell'occhio.

In questo metodo, abbiamo enucleato il bulbo oculare alla presa insieme alla terza palpebra tagliando attentamente e lentamente i muscoli extraoculari e recidendo il nervo ottico. Il bulbo oculare è stato perforato attraverso il limbus corneale usando una microlama. L'incisione è stata utilizzata come punto di ingresso, consentendo di tagliare lungo la giunzione corneale-sclerale inserendo micro-forbici attraverso il punto di incisione. Piccoli e continui tagli lungo la circonferenza sono stati fatti fino a quando le coppe si sono separate. Questi potrebbero essere ulteriormente sezionati sbucciando delicatamente lo strato traslucido della retina neurale usando una pinza di sutura Colibri per ottenere la retina neurale e gli strati RPE. Inoltre, tre/quattro tagli equidistanti sono stati effettuati dalla periferia perpendicolarmente al centro ottico fino a raggiungere il nervo ottico. Questo aprì le coppe emisferiche a forma di fiore in modo che cadessero piatte e potessero essere facilmente montate. Questa tecnica è stata utilizzata nel nostro laboratorio per interi corneali e sezioni retiniche. La presenza della terza palpebra delinea l'orientamento naso-temporale, che consente lo studio di vari interventi di terapia cellulare post-trapianto e, quindi, la validazione fisiologica mirata vitale per la visualizzazione e la rappresentazione accurata in tali studi.

Introduzione

La dissezione oculare è una tecnica importante nella ricerca oftalmica e ha permesso ai ricercatori di accedere ai segmenti dell'occhio per studi mirati. In precedenza, i ricercatori oculari si affidavano al tessuto oculare di individui malati per i loro studi. Tuttavia, il numero progressivamente crescente di ceppi di roditori oftalmici modelli1 nel corso degli anni ha diminuito la necessità di tessuto oculare umano. Questi ceppi murini hanno permesso una comprensione più profonda delle malattie oculari e degli interventi. Tuttavia, hanno anche generato la necessità di tecniche innovative di micro-dissezione oculare. Le dimensioni ridotte e l'....

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Protocollo

Questa procedura è stata approvata dall'Institutional Animal Ethics Committee del National Institute of Immunology, New Delhi. Il numero di riferimento seriale dell'omologazione è IAEC#480/18. Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del regolamento del Comitato per il controllo e la supervisione degli esperimenti sugli animali, Ministero della pesca, della zootecnia e dei prodotti lattiero-caseari, governo indiano, sotto la supervisione di un veterinario professionista presso il SAF, NII.

1. Preparazione

  1. Dilatare gli occhi dei roditori usando una goccia di 0,8% di tropicamide e 5% di s....

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Risultati

Un intero tessuto corneale dell'occhio di topo rd1 è stato preparato per studiare la potenziale linfo-angiogenesi nel tessuto anteriore/corneale in uno stato patologico. Il tessuto congiuntivale attaccato dalla terza palpebra ha agito come un controllo positivo, poiché la cornea manca di vasi linfatici. Per lo studio, il tessuto corneale è stato sezionato con la congiuntiva ed è stato fissato con il 4% di PFA, seguito da permeabilizzazione e blocco. Il tessuto è stato quindi colorato con un anticorpo primario contro il m.......

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Discussione

La microdissezione oculare si è rivelata un compito difficile a causa delle piccole dimensioni e della forma sferica dell'occhio del roditore e l'occhio del roditore richiede tecniche innovative per una manipolazione efficiente8.

Nell'attuale metodo dimostrato, il bulbo oculare del topo enucleato è ottenuto con la terza palpebra attaccata per una manipolazione efficace e facile. Utilizzando la terza palpebra, il bulbo oculare può essere immobilizzato completamente, il .......

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Il Dr. Alaknanda Mishra, Dipartimento di Biologia Cellulare e Anatomia Umana, Università della California Davis, USA, ci ha addestrato in questo metodo presso l'Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione di base ricevuta dal Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India all'Istituto Nazionale di Immunologia, Nuova Delhi. P.S. ha ottenuto una borsa di ricerca dal Dipartimento di Biotecnologie.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Paracetamolo (Biocetamolo)EG PharmaceuticalsNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
Kit di fosfatasi alcalina (DEA)Coral Clinical System, IndiaNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
Analizzatore automatizzatoTulip, Alto Santracruz, IndiaScreen Maaster 3000Analizzatore biochimico per test funzionali epatici
Betadine ( Soluzione di iodio povidon)Win-Medicare;   IndiaNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
Armadio di sicurezza biologica (Classe I)Kartos international; IndiaNessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
Microscopio a campo chiaroOlympus, GiapponeLX51
CBA/JThe Jackson LaboratoryCodice 000654
Cefotaxime (Taxim)AlKem ; Indiacefotaxima sodio iniezione, nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
Cell StrainerSigma ; USCLS431752
Collagenasi Tipo IGibco di Life Technologies17100-017
Cotton BudsPure Swabs Pvt Ltd ; IndiaNessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
DPX MountantSigma ; US6522
Drape SheetJSD Surgicals, Delhi, IndiaNessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
Soluzione di eosina Y,Sigma alcolico; USHT110132
ForcepsMajor Surgicals; IndiaNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
Sistema di anestesia dei gasUgo Basile; Italia211000
GlucosioHimedia, IndiaGRM077
Crema depilatoria (Veet)Reckitt Benckiser, IndiaNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
Soluzione di ematossilina, Sigma di Mayer; USMHS16
Eparina sale sodicoHimedia; IndiaRM554
Ialuronidasi da Pecora TestesSigma ; USH6254
Cannula IV (Plusflon)Mediplus, IndiaRef 1732411420
Siringhe da insulinaBD ; USREF 303060
Isoflurano (Forano)Asecia QueenboroughNo B506Inalazione Anestetico
Ketamina (Ketamax)Troikaa Pharmaceuticals Ltd.Ketamina cloridrato IP, nessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
Meloxicam (Melonex)Intas Pharmaceuticals Ltd; IndiaNessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
Micro portaaghi dritti e curviMercian;   InghilterraBS-13-8
Micro portaaghi dritto &
curvo
merciano;   InghilterraBS-13-8
MicrotomoHisto-Line Laboratories, ItaliaMRS3500
Filo di nylonMighty ; IndiaNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
ParaformaldeideHimedia; IndiaGRM 3660
PercollGE Healthcare17-0891-01
Rinfresca lacrime/Gel per occhielliAllergan India Private Limited/Sun Pharma, IndiaP3060Nessun numero di catalogo specifico
RPMIHimedia; IndiaNessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
ScalpelMajor Surgicals; IndiaNessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
ForbiciMajor Surgicals; IndiaNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
SGOT (ASAT) KITCoral Clinical System, IndiaNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
SGPT (ALAT) KITCoral Clinical System, IndiaNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
Shandon Cryotome E CryostatThermo Electron Corporation ; Stati UnitiNessun numero di catalogo specifico
SaccarosioSigma ; USS0389
Lama chirurgica n. 22La Medcare, IndiaNessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
Scheda chirurgicaRealizzatoNessun numero di catalogo specifico (approvvigionamento locale)
Nastro bianco chirurgico3M India ; India1530-1Suture a nastro chirurgico microporoso
Ethicon, Johnson & Johnson, IndiaNW 5047
Siringhe (1ml, 26 G)Dispo Van; IndiaNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
Trimmer (Clipper)PhilipsNL9206AD-4 DRACHTEN QT9005
PesatriceBraunNessun numero di catalogo specifico (Approvvigionamento locale)
William's E MediaHimedia; IndiaAT125
Xilazina (Xylaxin)Immunologici indianiSedativi, pre-anestetici, analgesici e miorilassanti
Topi consanguinei localmente limitati

Riferimenti

  1. Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
  2. Sutherland, C., et al.

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Microdissezione dell occhio di roditoreisolamento del tessuto ocularedissezione della retina neuraleepitelio pigmentato retinicopreparati a piattezza della corneasospensione di singole celluletecnica di criosezionamentoimmobilizzazione della terza palpebrarecisione del nervo otticomicroscopio da dissezione

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