Microdissezione dell'occhio del roditore

La dissezione oculare è una tecnica importante nella ricerca oftalmica e ha permesso ai ricercatori di accedere ai segmenti dell'occhio per studi mirati. In precedenza, i ricercatori oculari si affidavano al tessuto oculare di individui malati per i loro studi. Tuttavia, il numero progressivamente crescente di ceppi di roditori oftalmici modelli¹ nel corso degli anni ha diminuito la necessità di tessuto oculare umano. Questi ceppi murini hanno permesso una comprensione più profonda delle malattie oculari e degli interventi. Tuttavia, hanno anche generato la necessità di tecniche innovative di micro-dissezione oculare. Le dimensioni ridotte e l'area operativa limitata limitano fortemente l'accesso efficace alle sottoparti oculari. Inoltre, a causa dell'assemblaggio cellulare omogeneo delle conchiglie oculari posteriori e anteriori, è difficile condurre interventi mirati post-dissezione. Le attuali tecniche di microdissezione del laser² e della microdissezione chirurgica ^3,4 sono inadeguate a soddisfare tali requisiti della ricerca oculare. La micro-dissezione laser è molto efficace nell'analisi di singole cellule, ma il tessuto specifico deve essere micro-sezionato prima della procedura laser². La tecnica può isolare piccole regioni di interesse da un tessuto pre-sezionato per l'analisi molecolare. Pertanto, la tecnica non è adatta per la preparazione di interi supporti o per l'isolamento di strati oculari assialmente imballati per una visualizzazione ottimale.

Il metodo chirurgico è la tecnica più utilizzata; Questo metodo prevede l'immobilizzazione dell'occhio attraverso il nervo ottico⁵ e quindi l'esecuzione della dissezione. Questa pratica è ardua e può danneggiare qualsiasi tessuto fragile, poiché l'occhio sferico continua a muoversi durante la dissezione. Nonostante sia utile per isolare le varie sezioni degli strati retinici, la tecnica non può delimitare l'orientamento spaziale del tessuto al momento della dissezione.

Durante la dissezione, mantenere la presenza della membrana nittitante attaccata o della terza palpebra (Figura 1) presenta vantaggi unici e significativi. In questo metodo, in primo luogo, il bulbo oculare viene enucleato con la terza palpebra. Quindi, la terza palpebra viene utilizzata per immobilizzare l'occhio⁶ (Figura 2A). Questo è seguito perforando il bulbo oculare attraverso il limbus corneale e usando l'incisione come punto di ingresso (Figura 2B, C). Quindi, le conchiglie oculari vengono separate tagliando lungo la circonferenza anteriormente e posteriormente (Figura 2D-G). Sezionando ulteriormente la coppa oculare posteriore, lo strato traslucido della retina neurale può essere identificato e rimosso delicatamente. Vengono quindi effettuati tre o quattro tagli equidistanti nelle coppe emisferiche anteriori e posteriori ottenute, che consentono a queste coppe a forma di fiore di cadere piatte su un vetrino (Figura 2H).

La terza palpebra aiuta a maneggiare facilmente ed efficacemente durante la dissezione, garantendo così danni minimi al tessuto durante l'accesso ai vari strati oculari e durante la produzione di interi. Inoltre, la presenza della terza palpebra aiuta a individuare ed esaminare gli interventi localizzati durante la visualizzazione.

La procedura, nel nostro laboratorio, è stata eseguita su un ceppo di topo CBA/J o rd1 a P28 di qualsiasi sesso. La procedura può essere eseguita su qualsiasi ceppo, età o sesso dell'animale e non ha pregiudizi in base a queste caratteristiche.

Gli animali sono stati acquistati da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e mantenuti presso la Small Animal Facility (SAF) presso l'Istituto Nazionale di Immunologia (NII). Sono stati tenuti in gabbie ventilate individuali (IVC) e hanno ricevuto accesso ad libitum ad acqua e cibo acidificati in autoclave. Sono stati mantenuti a 21-23 °C e con un ciclo luce/buio di 14 h/10 h.

Di seguito è riportato un metodo chirurgico modificato per la micro-dissezione di un occhio di topo.

Questa procedura è stata approvata dall'Institutional Animal Ethics Committee del National Institute of Immunology, New Delhi. Il numero di riferimento seriale dell'omologazione è IAEC#480/18. Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida del regolamento del Comitato per il controllo e la supervisione degli esperimenti sugli animali, Ministero della pesca, della zootecnia e dei prodotti lattiero-caseari, governo indiano, sotto la supervisione di un veterinario professionista presso il SAF, NII.

1. Preparazione

1. Dilatare gli occhi dei roditori usando una goccia di 0,8% di tropicamide e 5% di soluzioni oftalmiche di fenilefrina in ciascun occhio. Posizionare l'animale in una zona buia per 30 minuti prima della procedura.
   NOTA: Non è richiesto un analgesico in quanto l'animale viene eutanasia immediatamente dopo aver completato i 30 minuti. L'adattamento scuro e la dilatazione degli occhi dell'animale consentono all'osservatore di verificare la presenza di lacrime oculari e danni prima della procedura. Inoltre, la dilatazione è vantaggiosa quando si lavora con il tessuto pigmentato del bulbo oculare.
2. Eutanasia l'animale somministrando per via intraperitoneale una dose 5x di anestesia. Una dose tipica è di 200 μL di PBS contenente 10 mg di ketamina e 1 mg di xilazina.
   NOTA: La dose per l'eutanasia dell'animale è ketamina a 400-500 mg/kg di peso corporeo e xilazina a 50 mg/kg di peso corporeo somministrata per via intraperitoneale. Per un topo tipico del peso di 20 g, la dose sarebbe di 200 μL di PBS contenente 10 mg di ketamina (100 μL di una soluzione madre di 100 mg/mL di ketamina) e 1 mg di xilazina (100 μL di una soluzione madre di 10 mg/ml di xilazina).
3. Conferma la completa mancanza di risposta a uno stimolo esaminando il riflesso del pedale. Anche l'assenza di battito cardiaco e respirazione sono indicatori importanti.
4. Posizionare il mouse in posizione sdraiata laterale per consentire l'accesso completo all'occhio.
5. Preparare una pinza da sutura Colibri, una pinza curva, una microlama (15°, 3 mm di dimensione), micro-forbici a molla e micro-forbici a molla angolata pronte per la procedura.

2. Enucleazione dell'occhio del topo insieme alla terza palpebra

1. Posizionare il mouse in posizione sdraiata laterale per consentire un accesso completo all'occhio. Aprire le palpebre esterne con la pinza per visualizzare in modo ottimale la terza palpebra.
   NOTA: La terza palpebra, nota anche come membrana nittitante, si trova verso l'angolo superiore della tangente nasale (Figura 1A).
2. Identificare la terza palpebra come una protuberanza traslucida minore con un bordo pigmentato (Figura 1B).
3. Posizionare una pinza curva attorno al bulbo oculare e pizzicare per liberare l'occhio da attacchi estranei. Ciò ridurrà al minimo il sanguinamento nell'occhio dal tessuto circostante.
4. Sostituire le pinze curve con micro-forbici a molla e tagliare intorno al bulbo oculare con la terza palpebra attaccata ad esso. Utilizzare piccoli tagli continui per rilasciare il bulbo oculare dagli attacchi del tessuto circostante.
5. Posizionare micro-forbici a molla curva sotto il bulbo oculare per liberare l'occhio tagliando il nervo ottico. Assicurarsi che il bulbo oculare sia completamente rilasciato dall'orbita oculare.

3. Eliminazione del tessuto estraneo

1. Posizionare l'occhio enucleato dal topo eutanasia in una capsula di Petri con tampone salino tamponato fosfato (PBS) a pH 7,4, con la capsula di Petri riempita in modo tale che il bulbo oculare sia immerso in PBS.
2. Immobilizzare il bulbo oculare enucleato del topo con la terza palpebra attaccata con una mano usando una pinza.
3. Sospendere il bulbo oculare in mezzo liquido per consentire una manipolazione più efficiente. Alcuni muscoli o tessuti extraoculari inizieranno a galleggiare lontano dal bulbo oculare. Rimuovili tagliandoli dal bulbo oculare usando micro-forbici a molla.
4. Tagliare e rimuovere il nervo ottico dalla base del bulbo oculare utilizzando micro-forbici per consentire una migliore separazione della retina per i preparati a montaggio intero.
   NOTA: Non è necessario rimuovere il nervo ottico per il sezionamento dei tessuti.
5. Lavare il bulbo oculare con PBS e trasferirlo in un tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% per un minimo di 2 ore a 4 °C per la fissazione dei tessuti.
   NOTA: La procedura può essere sospesa in questa fase lasciando il tessuto in PFA per un massimo di 12 ore a 4 °C. Tuttavia, per l'isolamento delle cellule vive, le fasi di fissazione non devono essere eseguite e l'intera procedura deve essere eseguita senza pause.

4. Dissezione dell'occhio enucleato per ottenere le conchiglie oculari anteriori e posteriori

1. Dopo la fissazione PFA (se si raccolgono cellule vive, procedere senza la fissazione del bulbo oculare), trasferire il bulbo oculare in una capsula di Petri contenente PBS e metterlo sotto un microscopio da dissezione per eseguire la procedura successiva.
2. Immobilizzare il bulbo oculare tenendo saldamente la terza palpebra con una pinza da sutura Colibri.
3. Fai una piccola incisione al limbus perforandolo usando una micro-lama. Il limbus è la giunzione corneale-sclerale. Fai l'incisione preferibilmente di fronte alla terza palpebra, creando così un punto di accesso per le micro-forbici a molla.
   NOTA: L'uso di una microlama di 15° e 3 mm di dimensione può fornire un migliore controllo sulla profondità di questa incisione.
4. Successivamente, utilizzando questa incisione come punto di partenza, con un paio di microforbici, eseguire piccoli e continui tagli lungo la circonferenza del limbus corneale-sclerale. Per prima cosa, completa un semicerchio di tagli a partire dal punto di incisione fino alla terza palpebra. Quindi, completate il semicerchio rimanente di tagli sull'altro lato. Infine, fai un taglio intorno alla terza palpebra per separare la coppa posteriore e la coppa anteriore.
   NOTA: A seconda della coppa oculare di interesse, la membrana nittitante può essere lasciata attaccata all'oculare anteriore o posteriore.
5. Rimuovere la lente dalla coppa posteriore usando una pinza per ottenere la coppa posteriore che comprende la retina neurale e gli strati dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). La lente, la coppa posteriore e la coppa anteriore dell'occhio sono, quindi, separate.
   NOTA: Se si lavora con tessuti non fissi, le coppe anteriore e posteriore possono ora essere digerite enzimaticamente per ottenere una sospensione unicellulare corneale o retinica.
6. Per fissare i tessuti, trasferire queste coppette in un tubo da 1,5 mL contenente 1 mL di PFA al 4% per 12 ore a 4 °C.
   NOTA: Dopo la fissazione, il tessuto può essere incorporato in un mezzo appropriato e la criosezione o il sezionamento della paraffina possono essere eseguiti per ottenere sezioni corneali o retiniche.

5. Isolamento della retina neurale e degli strati RPE

1. Reintrodurre la coppa posteriore nella capsula di Petri contenente tampone PBS per immergere il tessuto.
2. Verificare la presenza della retina neurale. Questo può essere visualizzato come uno strato opaco sullo strato RPE pigmentato, che è attaccato alla circonferenza periferica della tazza.
3. Tenere la terza palpebra con una pinza per immobilizzare la coppa posteriore e staccare la retina neurale partendo dalla periferia usando un secondo paio di pinze.
   NOTA: Movimenti molto delicati e leggeri della mano sono altamente raccomandati per non danneggiare il tessuto. All'uscita del nervo ottico, le forbici a molla curve possono essere inserite sotto la retina neurale e un taglio può essere effettuato per liberare completamente gli strati se la retina neurale rimane attaccata come illustrato nella Figura 3. Facoltativamente, liberare o staccare la retina con tratti delicati usando una spazzola morbida. Tuttavia, non sarebbe opportuno farlo se si raccoglie la retina per l'istologia.
   NOTA: La retina neurale e lo strato di RPE pigmentato con la terza palpebra sono, quindi, ottenuti.

6. Segmentazione degli strati retinici e RPE per wholemount

1. Reintrodurre le coppe anteriore e posteriore nella capsula di Petri contenente tampone PBS e posizionare il piatto sotto il microscopio da dissezione.
2. Immobilizzare la coppa anteriore tenendo premuto la terza palpebra.
3. Utilizzare micro-forbici a molla angolate per effettuare un taglio di circa 3/4 del diametro della concia oculare accanto alla terza palpebra, tagliando dalla periferia perpendicolarmente verso il centro ottico.
4. Mantieni una presa sulla terza palpebra e fai un taglio accanto al primo taglio.
5. Fai un taglio simile tra il secondo taglio e la terza palpebra.
   NOTA: Tre o quattro tagli equidistanti aprono le coppe emisferiche in una forma di fiore, che cade piatta e può essere facilmente montata.
6. Immobilizzare la coppa posteriore tenendo premuta la terza palpebra.
7. Seguire gli stessi passaggi indicati per effettuare i tagli (passi 6.3-6.5) sulla coppa anteriore per effettuare tre o quattro tagli equidistanti sulla coppa posteriore.
   NOTA: Per l'istologia della retina neurale isolata nel passaggio 5, eseguire tagli simili per assicurarsi che cada piatta su una superficie. Non fare tagli molto profondi al centro della tazza, in quanto ciò potrebbe far cadere le sezioni fogliari a pezzi o separarsi facilmente.
8. Eseguire la colorazione e montare integralmente i tessuti per una visualizzazione efficace ^7,8.
   NOTA: La presenza della membrana nittitante funge da indicatore fisico costante del lato nasale della coppa oculare nei wholemount. Aiuta a demarcare il lato dorsale / ventrale della coppa oculare, poiché la terza palpebra del bulbo oculare indica l'orientamento nasale / ventrale.

Un intero tessuto corneale dell'occhio di topo rd1 è stato preparato per studiare la potenziale linfo-angiogenesi nel tessuto anteriore/corneale in uno stato patologico. Il tessuto congiuntivale attaccato dalla terza palpebra ha agito come un controllo positivo, poiché la cornea manca di vasi linfatici. Per lo studio, il tessuto corneale è stato sezionato con la congiuntiva ed è stato fissato con il 4% di PFA, seguito da permeabilizzazione e blocco. Il tessuto è stato quindi colorato con un anticorpo primario contro il marcatore endoteliale linfatico (LYVE1)9. Questo è stato seguito dall'incubazione con un anticorpo secondario marcato con Alexa Fluor 488 (verde). Le immagini rappresentative (Figura 4) sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza a 4x e 10x.

Un intero monte della retina neurale dalla coppa oculare posteriore è stato preparato per visualizzare la vascolarizzazione retinica per studi morfologici, strutturali e funzionali della retina7. La retina neurale è stata accuratamente staccata dallo strato coroideo-RPE e sono stati fatti tagli per posarla piatta in una struttura a fiore. Per visualizzare la struttura vascolare retinica, il foglietto è stato sottoposto a colorazione con Isolectina IB4-Alexa Fluor 488 per 1 ora a temperatura ambiente e visualizzato con ingrandimento 2x e 20x (Figura 5).

Figura 1: La terza palpebra o membrana nittitante del topo. (A) La terza palpebra si trova verso l'angolo superiore della tangente nasale e (B) ha spesso un confine pigmentato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Fasi nell'isolamento delle conchiglie oculari anteriori e posteriori da un bulbo oculare enucleato. (A) La terza palpebra viene utilizzata per immobilizzare l'occhio, e (B) viene praticata un'incisione attraverso il limbus corneale. (C) Si effettua un'entrata dopo aver formato l'incisione e tagliato lungo la circonferenza, come indicato in (D-F). (G) Le conchiglie oculari anteriori e posteriori sono, quindi, separate. Uno strato traslucido della retina neurale è presente sulla coppa dell'occhio posteriore, che viene staccata. (H) Tre tagli equidistanti vengono quindi effettuati nelle coppe per farle cadere piatte. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Diagramma schematico che mostra come le forbici a molla curve possono essere inserite sotto la retina neurale per liberare gli strati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Wholemount della coppa anteriore. Il tessuto corneale è stato microdissezionato come descritto per rivelare i vasi linfatici. Il tessuto è stato colorato con il marcatore endoteliale linfatico (LYVE1) e un anticorpo secondario marcato con Alexa Fluor 488 (verde). (A) Immagini a 4x e (B) a 10x ingrandimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: L'intero monte della retina neurale. L'Isolectina IB4 colora la vascolarizzazione retinica, che può essere facilmente visualizzata in verde. (A) Il supporto piatto retinico ottenuto dalla coppa oculare posteriore è stato colorato con Isolectina IB4 marcata con Alexa Fluor 488 (2x). (B) Un ingrandimento 20x della vascolarizzazione retinica che mostra il plesso vascolare intermedio nella retina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.