Articolo metodologico

Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi

DOI:

10.3791/64493

⸱

2 dicembre 2022

 , 
1Swiss HPB Laboratory, Department of Visceral & Transplant Surgery, University Hospital Zurich (USZ)

In questo articolo

Sommario

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Gli epatociti carichi di lipidi sono inerenti alla rigenerazione del fegato, ma di solito vengono persi con la centrifugazione a gradiente di densità. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento cellulare ottimizzato che mantiene gli epatociti steatosici, producendo popolazioni rappresentative di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi.

Abstract

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L'epatectomia parziale è stata ampiamente utilizzata per studiare la rigenerazione epatica nei topi, ma l'isolamento di alte rese di epatociti vitali per applicazioni a valle di singole cellule è impegnativo. Un marcato accumulo di lipidi all'interno degli epatociti rigeneranti si osserva durante i primi 2 giorni di normale rigenerazione epatica nei topi. Questa cosiddetta steatosi associata alla rigenerazione transitoria (TRAS) è temporanea ma si sovrappone parzialmente alla fase proliferativa principale. La purificazione a gradiente di densità è la spina dorsale della maggior parte dei protocolli esistenti per l'isolamento degli epatociti primari. Poiché la purificazione del gradiente si basa sulla densità e sulla dimensione delle cellule, separa le popolazioni di epatociti non steatotici da quelli steatotici. Pertanto, gli epatociti grassi spesso vengono persi, producendo frazioni epatocitarie non rappresentative.

Il protocollo presentato descrive un metodo semplice e affidabile per l'isolamento in vivo degli epatociti rigeneranti indipendentemente dal loro contenuto lipidico. Gli epatociti di topi maschi C57BL/6 vengono isolati 24-48 ore dopo l'epatectomia mediante un classico approccio di perfusione della collagenasi in due fasi. Una pompa peristaltica standard guida le soluzioni riscaldate attraverso la vena cava inferiore cateterizzata nel resto, utilizzando una tecnica di perfusione retrograda con deflusso attraverso la vena porta. Gli epatociti sono dissociati dalla collagenasi per il loro rilascio dalla capsula di Glisson. Dopo il lavaggio e un'attenta centrifugazione, gli epatociti possono essere utilizzati per eventuali analisi a valle. In conclusione, questo articolo descrive una tecnica semplice e riproducibile per l'isolamento di una popolazione rappresentativa di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi. Il metodo può anche aiutare lo studio della malattia del fegato grasso.

Introduzione

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Il fegato può rigenerarsi anche dopo una grave perdita di tessuto. Questa capacità rigenerativa unica è esplicitamente illustrata dal modello sperimentale di epatectomia parziale (70%), descritto per la prima volta nei ratti da Higgins e Anderson nel 19311. In questo modello, il 70% del fegato viene rimosso chirurgicamente dagli animali tagliando i lobi del fegato più grandi. I lobi rimanenti crescono quindi attraverso l'ipertrofia compensatoria per ripristinare la massa epatica originale entro circa 1 settimana dopo l'intervento chirurgico, anche se senza ripristino dell'architettura epatica originale 2,3

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati conformi alle prescrizioni federali svizzere sugli animali e approvati dall'Ufficio veterinario di Zurigo (n. 007/2017, 156/2019) che garantisce l'assistenza umana. I topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 10 e 12 settimane sono stati tenuti in un ciclo giorno/notte di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua. Ogni gruppo sperimentale era composto da sei a otto animali. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Epatectomia parziale nei topi

  1. Per l'epate....

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Risultati

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La TRAS raggiunge il picco a 16 ore dopo l'epatectomia e gradualmente scompare 32-48 ore dopo l'epatectomia standard, ma persiste oltre le 48 ore dopo l'epatectomia prolungata. Macroscopicamente, TRAS è facilmente visibile come una carnagione pallida del residuo epatico (Figura 1F) e può essere osservato in topi epatectomizzati tra 16 h e 48 h dopo l'intervento chirurgico.

La resa finale stimata è di 10-15 × 10 6 epatociti dopo epatectomia al 70% e 4-9 .......

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Discussione

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Il protocollo pubblicato fornisce un metodo affidabile e diretto per isolare un'alta resa di epatociti murini normali e steatotici per analisi a valle a singola cellula o analisi di massa di cellule dopo la selezione FACS. Il netto vantaggio rispetto alla purificazione del gradiente di densità è che il contenuto lipidico cellulare non ha essenzialmente alcun impatto sulla resa effettiva degli epatociti. Pertanto, la frazione di epatociti steatosici sarà mantenuta e inclusa nelle analisi a valle. Questo non è solo crucial.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (sovvenzione 310030_189262).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagents
Alexa Fluor 488 Zombie greenBioLegend423111Colorante di vitalità reattivo all'ammina
Attane Isoflurane ad us. 99.9%Provet AGQN01AB06ATTENZIONE: necessita di ventilazione
Soluzione EDTASigma-AldrichE8008-100ML-Ethanol
Sigma-AldrichV001229Diluire con acqua al 70%
siero fetale bovino (FCS)GibcoA5256701-Hanks
' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, rosso fenoloSigma-AldrichH9269-6x600MLPer digestione/conservazione
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), senza Ca2+, senza Mg2+, senza rosso fenoloSigma-AldrichH6648-6x500MLPer soluzione HEPES tampone di perfusione
, 1 MSigma-Aldrich83264-100ML-F-Adesivo
tissutale istoacrilico (butil-2-cianoacrilato)B. Braun1050052Per la stabilizzazione del sito di incannulamento
Soluzione colorante per colorazione Hoechst 33258Abcamab228550-
Liberase Research GradeRoche5401119001Collagenasi liofilizzate I/II
NaCl 0,9% 500 mL EcotainerB. Braun123-Paralube
Vet UnguentoDechra17033-211-38-Soluzione
salina tamponata con fosfato (PBS)GibcoA1286301-Sudan
IV – Colorazione lipidicaSigma-AldrichV001423-Temgesic
(Buprenorfina cloridrato), soluzione iniettabile 0,3 mg/mLIndivior Europe Ltd.345928Narcotici. Conservare in modo sicuro.
Blu di tripano, 0,4%, filtrato sterileSigma-AldrichT8154Per il conteggio delle cellule
Williams' Medium ESigma-AldrichW4128-500ML-
Materiali
25 mL pipetta sierologica, Greiner CellstarMerckP7865-50
mL Falcon tubesTPP--
BD Neoflon, Catetere Pro IV 26 GBD Falcon391349-Cell
scraper, lama rotante larghezza 25 mmTPP99004-Filtro
cellulare Falcon 100 & micro; m NylonBD Falcon352360-Telo
chirurgico sterile fenestrato--Materiale di stoffa riutilizzabile
Ugello di riempimento per tubo di misura 16# (ID 3,1 mm)DriftonFILLINGNOZZLE#16Per entrare nelle provette
Provette per citometria a flusso, 5 mLBD Falcon352008-Male
Luer a Barb, Tubo ID 3,2 mmDriftonLM41Tubo di collegamento per siringare
piastre di Petri, 96 x 21 mmTPP93100-Prolene
5-0Ethicon8614HPer ritrarre lo sterno
Prolene 6-0Ethicon8695HPer sutura cutanea
Prolene 8-0EthiconEH7470ELegatura cistifellea
Tubo 16#, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, OD 6,4 mmDriftonSC0374TTubo di perfusione
Equipment
BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow CytometerBD-
Rasoio per roditori IsisAesculapGT421-Isofluran
stationProvet-
Centrifuga a bassa velocità – Scanspeed 416Labogene--
Neubauer-camera di conteggio migliorataMarienfeld--
Concentratore di ossigeno – EverFloPhilips10200070 – 5 L/min
Pipetboy – Pipettor Turbo-FixTPP94700-Pompa
di perfusione Shenchen YZ1515xShenchenYZ1515x-Microscopio
chirurgico - SZX9Olympus--
ThermoLux tappetino riscaldanteThermo Lux--
Vortex Genie 2, 2700 UpMNeoLab7-0092-Bagno
d'acqua – Precision GP 02Thermoscientific-Regolarea 42 ° E
di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
  2. Taub, R. Liver....

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Isolamento degli epatocitiRigenerazione epaticaPerfusione con collagenasiPerfusione retrogradaEpatociti carichi di lipidiEpatociti steatosiciCapsula di GlissonApplicazioni a cellula singola

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