Gli epatociti carichi di lipidi sono inerenti alla rigenerazione del fegato, ma di solito vengono persi con la centrifugazione a gradiente di densità. Qui, presentiamo un protocollo di isolamento cellulare ottimizzato che mantiene gli epatociti steatosici, producendo popolazioni rappresentative di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi.
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Articolo metodologico
Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'epatectomia parziale è stata ampiamente utilizzata per studiare la rigenerazione epatica nei topi, ma l'isolamento di alte rese di epatociti vitali per applicazioni a valle di singole cellule è impegnativo. Un marcato accumulo di lipidi all'interno degli epatociti rigeneranti si osserva durante i primi 2 giorni di normale rigenerazione epatica nei topi. Questa cosiddetta steatosi associata alla rigenerazione transitoria (TRAS) è temporanea ma si sovrappone parzialmente alla fase proliferativa principale. La purificazione a gradiente di densità è la spina dorsale della maggior parte dei protocolli esistenti per l'isolamento degli epatociti primari. Poiché la purificazione del gradiente si basa sulla densità e sulla dimensione delle cellule, separa le popolazioni di epatociti non steatotici da quelli steatotici. Pertanto, gli epatociti grassi spesso vengono persi, producendo frazioni epatocitarie non rappresentative.
Il protocollo presentato descrive un metodo semplice e affidabile per l'isolamento in vivo degli epatociti rigeneranti indipendentemente dal loro contenuto lipidico. Gli epatociti di topi maschi C57BL/6 vengono isolati 24-48 ore dopo l'epatectomia mediante un classico approccio di perfusione della collagenasi in due fasi. Una pompa peristaltica standard guida le soluzioni riscaldate attraverso la vena cava inferiore cateterizzata nel resto, utilizzando una tecnica di perfusione retrograda con deflusso attraverso la vena porta. Gli epatociti sono dissociati dalla collagenasi per il loro rilascio dalla capsula di Glisson. Dopo il lavaggio e un'attenta centrifugazione, gli epatociti possono essere utilizzati per eventuali analisi a valle. In conclusione, questo articolo descrive una tecnica semplice e riproducibile per l'isolamento di una popolazione rappresentativa di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi. Il metodo può anche aiutare lo studio della malattia del fegato grasso.
Introduzione
Il fegato può rigenerarsi anche dopo una grave perdita di tessuto. Questa capacità rigenerativa unica è esplicitamente illustrata dal modello sperimentale di epatectomia parziale (70%), descritto per la prima volta nei ratti da Higgins e Anderson nel 19311. In questo modello, il 70% del fegato viene rimosso chirurgicamente dagli animali tagliando i lobi del fegato più grandi. I lobi rimanenti crescono quindi attraverso l'ipertrofia compensatoria per ripristinare la massa epatica originale entro circa 1 settimana dopo l'intervento chirurgico, anche se senza ripristino dell'architettura epatica originale 2,3
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati conformi alle prescrizioni federali svizzere sugli animali e approvati dall'Ufficio veterinario di Zurigo (n. 007/2017, 156/2019) che garantisce l'assistenza umana. I topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 10 e 12 settimane sono stati tenuti in un ciclo giorno/notte di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua. Ogni gruppo sperimentale era composto da sei a otto animali. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature e i reagenti utilizzati in questo protocollo.
1. Epatectomia parziale nei topi
- Per l'epate....
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Risultati
La TRAS raggiunge il picco a 16 ore dopo l'epatectomia e gradualmente scompare 32-48 ore dopo l'epatectomia standard, ma persiste oltre le 48 ore dopo l'epatectomia prolungata. Macroscopicamente, TRAS è facilmente visibile come una carnagione pallida del residuo epatico (Figura 1F) e può essere osservato in topi epatectomizzati tra 16 h e 48 h dopo l'intervento chirurgico.
La resa finale stimata è di 10-15 × 10 6 epatociti dopo epatectomia al 70% e 4-9 .......
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Discussione
Il protocollo pubblicato fornisce un metodo affidabile e diretto per isolare un'alta resa di epatociti murini normali e steatotici per analisi a valle a singola cellula o analisi di massa di cellule dopo la selezione FACS. Il netto vantaggio rispetto alla purificazione del gradiente di densità è che il contenuto lipidico cellulare non ha essenzialmente alcun impatto sulla resa effettiva degli epatociti. Pertanto, la frazione di epatociti steatosici sarà mantenuta e inclusa nelle analisi a valle. Questo non è solo crucial.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero (sovvenzione 310030_189262).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Colorante di vitalità reattivo all'ammina |
| Attane Isoflurane ad us. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | ATTENZIONE: necessita di ventilazione |
| Soluzione EDTA | Sigma-Aldrich | E8008-100ML-Ethanol | |
| Sigma-Aldrich | V001229 | Diluire con acqua al 70% | |
| siero fetale bovino (FCS) | Gibco | A5256701-Hanks | |
| ' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, rosso fenolo | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | Per digestione/conservazione |
| Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), senza Ca2+, senza Mg2+, senza rosso fenolo | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | Per soluzione HEPES tampone di perfusione |
| , 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F-Adesivo | |
| tissutale istoacrilico (butil-2-cianoacrilato) | B. Braun | 1050052 | Per la stabilizzazione del sito di incannulamento |
| Soluzione colorante per colorazione Hoechst 33258 | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Collagenasi liofilizzate I/II |
| NaCl 0,9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123-Paralube | |
| Vet Unguento | Dechra | 17033-211-38-Soluzione | |
| salina tamponata con fosfato (PBS) | Gibco | A1286301-Sudan | |
| IV – Colorazione lipidica | Sigma-Aldrich | V001423-Temgesic | |
| (Buprenorfina cloridrato), soluzione iniettabile 0,3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotici. Conservare in modo sicuro. |
| Blu di tripano, 0,4%, filtrato sterile | Sigma-Aldrich | T8154 | Per il conteggio delle cellule |
| Williams' Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materiali | |||
| 25 mL pipetta sierologica, Greiner Cellstar | Merck | P7865-50 | |
| mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Catetere Pro IV 26 G | BD Falcon | 391349-Cell | |
| scraper, lama rotante larghezza 25 mm | TPP | 99004-Filtro | |
| cellulare Falcon 100 & micro; m Nylon | BD Falcon | 352360-Telo | |
| chirurgico sterile fenestrato | - | - | Materiale di stoffa riutilizzabile |
| Ugello di riempimento per tubo di misura 16# (ID 3,1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | Per entrare nelle provette |
| Provette per citometria a flusso, 5 mL | BD Falcon | 352008-Male | |
| Luer a Barb, Tubo ID 3,2 mm | Drifton | LM41 | Tubo di collegamento per siringare |
| piastre di Petri, 96 x 21 mm | TPP | 93100-Prolene | |
| 5-0 | Ethicon | 8614H | Per ritrarre lo sterno |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | Per sutura cutanea |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Legatura cistifellea |
| Tubo 16#, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, OD 6,4 mm | Drifton | SC0374T | Tubo di perfusione |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | |
| Rasoio per roditori Isis | Aesculap | GT421-Isofluran | |
| station | Provet | - | |
| Centrifuga a bassa velocità – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-camera di conteggio migliorata | Marienfeld | - | - |
| Concentratore di ossigeno – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700-Pompa | |
| di perfusione Shenchen YZ1515x | Shenchen | YZ1515x-Microscopio | |
| chirurgico - SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux tappetino riscaldante | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092-Bagno | |
| d'acqua – Precision GP 02 | Thermo | scientific-Regolare | a 42 ° E |
Riferimenti
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver....
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Ristampe e permessi
