Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali

La coltura organoide intestinale è un sistema tridimensionale (3D) ex vivo in cui le cellule staminali sono isolate dalle cripte intestinali del tessuto primario e placcate in una matrice di gel ^1,2. Queste cellule staminali sono capaci di auto-rinnovamento, auto-organizzazione e funzionalità degli organi². Gli organoidi imitano il microambiente tissutale e sono più simili ai modelli in vivo rispetto ai modelli di coltura cellulare in vitro bidimensionale (2D), sebbene meno manipolabili delle cellule ^3,4. Questo modello elimina gli ostacoli incontrati nei modelli 2D, come la mancanza di adeguate aderenze cellula-cellula, interazioni cellula-matrice e popolazioni omogenee, e riduce anche i limiti dei modelli animali, inclusi costi elevati e lunghi periodi di tempo⁵. Gli organoidi intestinali - noti anche come colonoidi per quelli cresciuti da cellule staminali derivate dalla cripta del colon - sono essenzialmente mini-organi che contengono un epitelio che include tutti i tipi di cellule che sarebbero presenti in vivo, così come un lume. Questo modello consente la manipolazione del sistema per studiare molti aspetti dell'intestino, come la nicchia delle cellule staminali, la fisiologia intestinale, la fisiopatologia e la morfogenesi intestinale ^3,5,6. Fornisce anche un ottimo modello per la scoperta di farmaci, studiando i disturbi intestinali umani come la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e il cancro del colon-retto, lo sviluppo di trattamenti personalizzati specifici per il paziente e lo studio della rigenerazione dei tessuti 4,7,8,9. Inoltre, il sistema organoide può anche essere utilizzato per studiare la comunicazione cellulare, il metabolismo dei farmaci, la vitalità, la proliferazione e la risposta agli stimoli ^7,8. Mentre i modelli animali possono essere utilizzati per testare potenziali terapie per le condizioni patologiche intestinali, sono piuttosto limitati, poiché lo studio di più farmaci contemporaneamente rappresenta una sfida. Ci sono più variabili confondenti in vivo, e il costo e il tempo associati sono rispettivamente alti e lunghi. D'altra parte, il sistema di coltura organoide consente lo screening di molte terapie contemporaneamente in un periodo di tempo più breve e consente anche un trattamento personalizzato attraverso l'uso di colture organoidi derivate dal paziente ^4,8. La capacità degli organoidi del colon di imitare l'organizzazione, il microambiente e la funzionalità dei tessuti li rende anche un modello eccellente per studiare la rigenerazione e la riparazione dei tessuti⁹. Il nostro laboratorio ha stabilito un sistema di coltura di organoidi dell'intestino tenue per studiare l'effetto della claudina-7 sulle funzioni delle cellule staminali dell'intestino tenue¹⁰. In questo studio, viene stabilito un grande sistema di coltura organoide intestinale per studiare la capacità, o la mancanza di capacità, delle cellule staminali di auto-rinnovarsi, differenziarsi e proliferare in un modello condizionale di knockout di claudina-7 (cKO).

La claudina-7 è una proteina a giunzione stretta (TJ) molto importante che è altamente espressa nell'intestino ed è essenziale per mantenere la funzione e l'integrità di TJ¹¹. I topi cKO soffrono di un fenotipo simile a IBD, che mostra grave infiammazione, ulcerazioni, desquamazione delle cellule epiteliali, adenomi e aumento dei livelli di citochine^11,12. Mentre è ampiamente accettato che le claudine sono vitali per la funzione di barriera epiteliale, stanno emergendo nuovi ruoli per le claudine; Sono coinvolti nella proliferazione, migrazione, progressione del cancro e funzione delle cellule staminali 10,12,13,14,15,16,17. Attualmente non è noto come la claudina-7 influenzi la nicchia e la funzione delle cellule staminali del colon. Poiché l'intestino si auto-rinnova rapidamente circa ogni 5-7 giorni, il mantenimento della nicchia delle cellule staminali e il corretto funzionamento delle cellule staminali attive è vitale¹⁸. Qui viene istituito un sistema per esaminare i potenziali effetti regolatori della claudina-7 sulla nicchia delle cellule staminali del colon.

Tutti gli esperimenti e le procedure sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della East Carolina University (ECU) e condotti in conformità con le linee guida del National Institutes of Health e dell'ECU sulla cura e l'uso degli animali da laboratorio. Topi knockout claudin-7 inducibili, intestinali-specifici sono stati generati incrociando topi transgenici claudin-7-flox C57BL6 con topi Villin-CreERT2¹⁹. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine di età pari o superiore a 3 mesi.

1. Preparazione del reagente/attrezzatura

1. Raffreddare i seguenti reagenti / apparecchiature prima di iniziare gli esperimenti associati: soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per il lavaggio del tessuto del colon durante l'isolamento della cripta; un bilanciere/rotatore (posto in frigorifero a 4 °C) per l'incubazione con mezzi di dissociazione epiteliale.
   1. Rimuovere la matrice di gel (vedere tabella dei materiali) da -20 °C e scongelare sul ghiaccio prima della placcatura.
   2. Pre-raffreddare la centrifuga a 4 °C prima di far girare le cripte per la placcatura.
   3. Raffreddare il tampone citrato di sodio allo 0,1% (vedere la tabella dei materiali) e mantenere il ghiaccio prima del rilevamento della morte cellulare in situ .
2. Riscaldare i seguenti reagenti prima di iniziare gli esperimenti associati: una piastra di coltura a 96 pozzetti per 24 ore prima della placcatura; Supporti L-WRN (vedi Tabella dei materiali) prima dell'aggiunta alle cripte placcate e prima di ogni cambio di supporto.
   1. Riscaldare il bagnomaria a 94 °C prima della colorazione.

2. Isolamento della cripta del colon murino

1. Preparare i supporti necessari seguendo i passaggi seguenti.
   NOTA: i volumi dei supporti sono calcolati qui per il tessuto del colon di due topi.
   1. Preparare i mezzi di dissociazione epiteliale: 30 ml di 1x PBS + 400 μL di 0,5 M EDTA + 50 μL di 10 mM di Y-27632 dicloridrato (vedere Tabella dei materiali). Conservare in ghiaccio fino all'uso.
   2. Preparare i mezzi di dissociazione della cripta: 10 ml di 1x PBS + 10 μL di 10 mM di Y-27632 dicloridrato. Conservare in ghiaccio fino all'uso.
   3. Supplemento L-WRN media: 50 mL di terreni L-WRN + 47,5 mL di DMEM ad alto glucosio con L-Glutammina + 500 μL di L-glutammina + 500 μL di pennicilina/streptomicina + 1.000 μL di integratore B-27 (50x) + 500 μL di supplemento di N2 (100x) + 50 μL di soluzione tampone HEPES (1 M) (vedi Tabella dei materiali).
   4. Filtrare il materiale L-WRN completo (integrato) e l'aliquota per la conservazione a -20 °C per un massimo di 3 mesi.
      NOTA: i fluidi scongelati sono stabili a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Eseguire l'isolamento della cripta.
   1. Per l'anestesia generale, aggiungere 1 mL di isoflurano al cotone e posizionarlo all'interno di una cassetta di plastica all'interno di una camera di anestesia di 0,09 piedi cubi (vedi Tabella dei materiali). Posizionare il topo nella camera di anestesia fino a quando la respirazione si ferma (circa 3-5 minuti) e quindi eseguire la dislocazione cervicale²⁰.
   2. Fai un'incisione di circa 2 in lungo la linea mediana del mouse, bloccando la pelle posteriore per esporre l'addome. Isolare il colon tagliando appena sotto il cieco dal lato prossimale e sopra il retto dal lato distale²¹.
   3. Usando una pinza, rimuovere il tessuto adiposo attaccato al colon. Spingere delicatamente le feci fuori utilizzando l'estremità piatta della pinza e tagliare il tessuto aperto longitudinalmente.
   4. Lavare il tessuto 10-15 volte con 1x PBS freddo usando una pinza per "ruotare" il tessuto intorno in PBS tra i lavaggi.
   5. Usando forbici pulite e affilate, tagliare il tessuto in piccoli pezzi, di circa 3-5 mm.
   6. Ripetere il processo per il secondo topo e combinare i pezzi di tessuto in una provetta da 50 mL contenente mezzi di dissociazione epiteliale fredda (punto 2.1.1).
   7. Incubare i pezzi di tessuto del colon in mezzi di dissociazione epiteliale per 90 minuti a 4 °C con un leggero dondolio.
   8. Lasciare che i frammenti di tessuto affondino sul fondo del tubo, quindi scartare con attenzione il mezzo di dissociazione epiteliale senza interrompere il tessuto. Ripetere questo processo quando si lava il tessuto 10-15 volte con freddo 1x PBS. Scartare quanto più PBS possibile durante il lavaggio finale.
   9. Aggiungere il mezzo di dissociazione criptato (punto 2.1.2) al tubo da 50 mL contenente pezzi di tessuto del colon e agitare continuamente per 5-10 minuti a mano.
      NOTA: I media devono diventare torbidi dalle cripte dissociate.
   10. Sotto il cappuccio della coltura cellulare, filtrare il tessuto e il supporto con un filtro per cellule di nylon da 70 μm (vedere Tabella dei materiali) in un tubo fresco da 50 ml.
   11. Centrifugare a 200 x g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante senza disturbare il pellet contenente la cripta.
       NOTA: A seconda dell'apparecchiatura, è possibile trasferire il fluido teso in un tubo da 15 ml per la centrifugazione.
   12. Risospendere il pellet in ~ 3-4 ml di freddo 1x PBS.
   13. Pipettare 10 μL delle cripte isolate in una linea su un vetrino da microscopio. Al microscopio, contare il numero di cripte piene e lunghe per stimare la concentrazione di cripta per 10 μL.
   14. Calcola il volume appropriato di cripte da far girare per placcare 10 cripte / μL in una piastra da 96 pozzetti.

3. Placcatura criptata

1. Centrifugare un volume appropriato di cripte isolate in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
2. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta da 1.000 μL senza interrompere le cripte pellettate.
3. Aggiungere 100 μL di matrice di gel (sufficiente per nove pozzetti) alle cripte pellettate e pipettare con attenzione per evitare l'introduzione di bolle d'aria.
   NOTA: Vedere la sezione Discussione per una descrizione dettagliata di come miscelare la matrice di gel e le cripte. In genere, 100 μL sono sufficienti per nove pozzetti.
4. Lasciare solidificare parzialmente la matrice di gel (~1-2 min).
5. Piastra 10 μL della matrice di gel mescolata con le cripte in ciascun pozzetto di una piastra di coltura preriscaldata a 96 pozzetti per formare una forma a cupola.
   NOTA: Posizionare la cupola al centro del pozzo. Fare attenzione a non permettere alla matrice di gel di diffondersi ai lati del pozzetto. Vedere la sezione Discussione per una descrizione dettagliata sulla solidificazione e la placcatura.
6. Lasciare riposare completamente la matrice di gel per 10-20 minuti in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO₂.
7. Preparare la soluzione di lavoro finale dei supporti L-WRN.
   1. Aggiungere 100 μL di pennicilina/streptomicina a un'aliquota di 10 mL di terreno di L-WRN (vedere punto 2.1.3) (stabile per 2 settimane a 4 °C).
   2. Aggiungere integratori a 900 μL di terreni L-WRN con pennicilina/streptomicina: 0,9 μL di 1 mg/mL EGF + 0,9 μL di 10 mM Y-27632 dicloridrato.
      NOTA: I volumi sono basati su nove pozzi. Il dicloridrato Y-27632 viene aggiunto solo il giorno 0 (al momento della placcatura).
8. Aggiungere 100 μL di supporto a ciascun pozzetto. Fai attenzione a non disturbare la cupola.
9. Incubare a 37 °C con 5% di CO₂ per 24 ore.

4. Creare il knockout claudin-7 nella cultura

1. Lasciare che le cripte crescano normalmente in coltura per 24 ore dopo la placcatura.
2. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, aggiungere 2,7 μL di 4-idrossitamoxifene (4OH-Tamoxifene) da 1 mmol/L a 900 μL di terreno L-WRN (concentrazione finale di 3 μmol/L) + 0,9 μL di 1 mg/mL EGF.
   NOTA: La soluzione madre di 4OH-Tamoxifen viene preparata miscelando 4OH-Tamoxifen in polvere (vedere Tabella dei materiali) con 1x PBS ad una concentrazione di 1 mmol / L.
3. Rimuovere i vecchi fluidi dai pozzetti tramite aspirazione a vuoto.
4. Aggiungere 100 μL di mezzi contenenti 4OH-Tamoxifen a ciascun pozzetto ed etichettarli come claudina-7 cKO/4OH-TAM.
   NOTA: DMSO deve essere aggiunto ai pozzetti di controllo. I nuovi supporti contenenti 4OH-Tamoxifen devono essere aggiunti ogni 2 giorni.
5. Incubare a 37 °C fino al successivo cambio di terreno (~2-3 giorni).

5. Mantenimento degli organoidi del colon

NOTA: i supporti devono essere cambiati ogni 2-3 giorni. Cultura fino a 12 giorni.

1. Preparare una nuova soluzione di lavoro finale di terreni L-WRN: 900 μL di terreno L-WRN + 0,9 μL di 1 mg/mL EGF.
2. Rimuovere i vecchi fluidi dai pozzetti tramite aspirazione a vuoto. Aggiungi nuovi media ai pozzi.
   NOTA: Fare attenzione a non disturbare la cupola.
3. Incubare a 37 °C fino al successivo cambio del fluido.
   NOTA: Le colture possono essere mantenute e fatte passare per la durata desiderata per l'esperimento. Le colture per il presente studio sono state in genere mantenute per un periodo compreso tra 9-12 giorni, ma si potrebbe desiderare di continuare ulteriormente, per 15 o 20 giorni.

6. Raccolta e incorporazione di organoidi del colon

1. Rimuovere i vecchi fluidi dai pozzetti tramite aspirazione a vuoto.
2. Fissare gli organoidi con paraformaldeide (PFA) al 4% per 1 ora a temperatura ambiente.
   NOTA: il PFA è un materiale tossico. Prendere precauzioni quando si utilizza questo reagente.
3. Rimuovere il 4% di PFA dai pozzetti tramite aspirazione sottovuoto e aggiungere il 30% di saccarosio per 24 ore a 4 °C.
4. Etichettare uno stampo di plastica e riempirlo al 90% con un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) (vedere la tabella dei materiali).
5. Rimuovere il 30% di saccarosio dai pozzetti tramite aspirazione sottovuoto. Aggiungere 10 μL di 1x PBS a ciascun pozzetto.
6. Con una punta per pipetta, grattare delicatamente il fondo del pozzetto per dissociare la cupola contenente organoidi.
7. Con una pipetta, rimuovere il PBS contenente gli organoidi dissociati e caricare il liquido nello stampo contenente OCT.
   NOTA: evitare di introdurre bolle nel composto dello Strumento di personalizzazione di Office.
8. Continuare questo processo fino a quando tutti gli organoidi sono stati rimossi da tutti i pozzi.
9. In un matraccio Dewar in acciaio inossidabile, aggiungere pellet di ghiaccio secco e 2-metilbutano (sufficienti a coprire i pellet di ghiaccio secco) (vedi Tabella dei materiali).
10. Tenere costantemente il blocco OCT contenente organoidi sopra il 2-metilbutano per congelare il flash.
11. Conservare il blocco OCT contenente organoidi a -80 °C fino al momento della sezione (può essere conservato fino a 1 anno).

7. Immunofluorescenza

1. Sezionare il blocco OCT contenente organoidi ad uno spessore di 5 μm utilizzando un criostato (vedi Tabella dei materiali) a -20 °C.
2. Per ogni sezione, controllare al microscopio per assicurarsi che sia stato catturato un organoide. Al termine del sezionamento, conservare i vetrini a -80 °C fino al momento della colorazione (possono essere conservati fino a 6 mesi).
3. Riscaldare i vetrini in tampone citrato di sodio da 10 mM per 10 minuti a 94 °C.
   NOTA: Il tampone viene prodotto sciogliendo il citrato di sodio in acqua deionizzata. Regolare il pH a 6 con acido cloridrico.
4. Lasciare raffreddare gli scivoli sul piano di lavoro per 20 minuti. Risciacquare con acqua distillata per 5 min.
5. Montare i vetrini in uno scaffale di colorazione (vedi Tabella dei materiali) con Triton X-100 allo 0,2% e incubare con glicina da 100 mM per 15 minuti.
6. Risciacquare tre volte con 1x PBS per 5 minuti ciascuno. Bloccare con albumina sierica bovina al 5% (BSA) per 45 minuti a temperatura ambiente.
7. Incubare con claudina-7 anticorpo primario²² del coniglio murino (diluito in BSA all'1%) per una notte a 4 °C. Risciacquare tre volte con 1x PBS per 10 minuti ciascuno.
8. Incubare con Cy3 anticorpo secondario anti-coniglio²³ (diluito in 1% BSA) per 1 h a temperatura ambiente. Risciacquare tre volte con 1x PBS per 10 minuti ciascuno.
9. Montare le guide con un supporto di montaggio appropriato (vedere Tabella dei materiali) con DAPI e aggiungere un coprivetrino.

8. Rilevamento della morte cellulare

1. Fissare gli organoidi all'interno dei pozzetti con paraformaldeide al 4% per 1 h a temperatura ambiente. Risciacquare con 1x PBS per 5 min.
2. Incubare la piastra di coltura su ghiaccio con Triton X-100 allo 0,1% in tampone freddo di citrato di sodio allo 0,1% per 2 minuti. Risciacquare due volte con 1x PBS per 5 minuti ciascuno.
3. Preparare la reazione TUNEL^24,25 utilizzando TMR Red^, un kit di rilevamento della morte cellulare in situ(vedere la tabella dei materiali). Aggiungere 50 μL di reagenti di reazione TUNEL a ciascun pozzetto.
4. Incubare in atmosfera umidificata per 1 h a 37 °C al buio.
   NOTA: tutti i passaggi rimanenti devono essere completati al buio.
5. Risciacquare tre volte con 1x PBS per 5 minuti ciascuno. Incubare con 1:2.500 Hoechst (diluito in 1x PBS, vedere Tabella dei materiali) per 3 min.
6. Risciacquare tre volte con 1x PBS per 5 minuti ciascuno. Utilizzare il filtro TRITC per visualizzare le immagini su un microscopio fluorescente (vedere Tabella dei materiali).

Al fine di esaminare gli effetti regolatori della claudina-7 sulle cellule staminali del colon, le cripte del colon sono state isolate dal tessuto del colon murino come descritto sopra e mostrato nella Figura 1A. Una volta isolate le cripte dal tessuto primario, sono state placcate in una matrice 3D in una piastra da 96 pozzetti per crescere per 11 giorni (Figura 1). Le normali cripte sane chiuderanno il lume e diventeranno sferoidi entro il giorno 2 e alla fine inizieranno a germogliare e formare i vari tipi di cellule epiteliali approssimativamente al giorno 5 (Figura 1B). I colonoidi sono stati lasciati crescere fino al giorno 11, dove sono stati poi raccolti per ulteriori esperimenti (Figura 1B). Per eliminare la claudina-7 in cultura, le cripte sono state lasciate crescere normalmente per 24 ore. Dopo 24 ore, le cripte sono state trattate con 3 μmol/L di 4OH-Tamoxifene (TAM) e coltivate per altri 10 giorni. Il terreno di coltura contenente 4OH-TAM fresco è stato cambiato ogni 2 giorni. DMSO è stato utilizzato come veicolo nei pozzi di controllo. Le cripte carenti di claudina-7 (claudin-7 KO) non sono riuscite a formare sferoidi adeguati e hanno iniziato a morire rapidamente dopo 1 giorno di trattamento 4OH-TAM (Figura 1B).

La figura 2A evidenzia la crescita di successo dei colonoidi da normali cripte contenenti claudina-7 (controllo) mentre progrediscono durante i 9 giorni di coltura. Queste cripte hanno iniziato a formare sferoidi entro il giorno 2, hanno iniziato a germogliare il giorno 5 e hanno continuato a crescere e germogliare fino a quando non sono state raccolte il giorno 9 (Figura 2A). Al contrario, le cripte prive di claudina-7 (claudina-7 KO) si sono deteriorate molto rapidamente (Figura 2B). Circa 2-3 giorni dopo il trattamento con 4OH-TAM, le cripte claudina-7 KO non avevano formato sferoidi dall'aspetto sano e apparivano solo come grumi circolari di cellule (Figura 2B). Le cripte isolate da topi wild-type sono state trattate con 4OH-TAM per confermare che non vi è alcun effetto tossico dovuto al trattamento con Tamoxifene; Queste cripte sono state in grado di sopravvivere e crescere normalmente. Per esaminare la delezione di claudina-7 e la condizione di sopravvivenza dei colonoidi di claudina-7 KO, sono stati utilizzati un metodo di immunocolorazione e un kit di rilevamento della morte cellulare in situ (Figura 3). La colorazione immunofluorescente per claudina-7 nel controllo raccolto e negli organoidi cKO ha confermato il successo del knockout di claudina-7 in coltura (Figura 3A). I colonoidi di controllo del giorno 9 hanno mostrato pochissimo segnale apoptotico (Figura 3B); tuttavia, i colonoidi di claudina-7 KO mostravano un'elevata apoptosi (Figura 3B). Senza claudina-7, le cellule staminali non potrebbero sopravvivere, auto-rinnovarsi o differenziarsi per formare colonoidi.

Figura 1: Rappresentazione schematica che mostra l'isolamento della cripta e la crescita dei colonoidi. (A) Rappresentazione grafica del processo di isolamento della cripta, placcatura nella matrice 3D e crescita fino al raccolto. (B) Cronologia degli esperimenti e della crescita dei colonoidi nelle cripte derivate da KO e claudina-7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: I colonoidi carenti di claudina-7 non sono in grado di sopravvivere e crescere . (A) Immagini rappresentative degli organoidi di controllo/DMSO il giorno 3 e il giorno 9. (B) Immagini rappresentative di organoidi 4OH-TAM/cKO il giorno 3 e il giorno 9, n = 10. Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: I colonoidi carenti di claudina-7 subiscono rapidamente apoptosi. (A) Colorazione di claudina-7 negli organoidi di controllo del giorno 9/DMSO e claudina-7 cKO/4OH-TAM, n = 3. Barre della scala = 250 μm. (B) Colorazione apoptotica nel controllo del giorno 9 e colonoidi claudina-7 cKO/4OH-TAM, n = 3. Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.