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Articolo metodologico

Valutazione dei cambiamenti nella plasticità sinaptica utilizzando un modello di trauma cranico chiuso sveglio di lieve lesione cerebrale traumatica

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DOI:

10.3791/64592

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20 gennaio 2023

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1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

Qui, è dimostrato come un modello di lesione a testa chiusa sveglia può essere utilizzato per esaminare gli effetti della lesione cerebrale traumatica lieve ripetuta (r-mTBI) sulla plasticità sinaptica nell'ippocampo. Il modello replica importanti caratteristiche di r-mTBI nei pazienti e viene utilizzato in combinazione con l'elettrofisiologia in vitro .

Abstract

Le lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI) sono un problema di salute prevalente in Nord America. Vi è una crescente pressione per utilizzare modelli ecologicamente validi di mTBI a testa chiusa in ambito preclinico per aumentare la traducibilità alla popolazione clinica. Il modello di lesione a testa chiusa (ACHI) utilizza un impattatore corticale controllato modificato per fornire lesioni a testa chiusa, inducendo deficit comportamentali clinicamente rilevanti senza la necessità di una craniotomia o l'uso di un anestetico.

Questa tecnica normalmente non induce decessi, fratture del cranio o emorragie cerebrali ed è più coerente con l'essere una lesione lieve. In effetti, la natura lieve della procedura ACHI la rende ideale per gli studi che indagano l'mTBI ripetitivo (r-mTBI). Prove crescenti indicano che r-mTBI può provocare una lesione cumulativa che produce sintomi comportamentali, cambiamenti neuropatologici e neurodegenerazione. r-mTBI è comune nei giovani che praticano sport e queste lesioni si verificano durante un periodo di robusta riorganizzazione sinaptica e mielinizzazione, rendendo la popolazione più giovane particolarmente vulnerabile alle influenze a lungo termine di r-mTBI.

Inoltre, r-mTBI si verifica nei casi di violenza intima del partner, una condizione per la quale ci sono poche misure di screening oggettive. In questi esperimenti, la funzione sinaptica è stata valutata nell'ippocampo in ratti giovani che avevano sperimentato r-mTBI utilizzando il modello ACHI. A seguito delle lesioni, è stata utilizzata un'affettatrice tissutale per realizzare fette di ippocampo per valutare la plasticità sinaptica bidirezionale nell'ippocampo a 1 o 7 giorni dopo l'r-mTBI. Nel complesso, il modello ACHI fornisce ai ricercatori un modello ecologicamente valido per studiare i cambiamenti nella plasticità sinaptica dopo mTBI e r-mTBI.

Introduzione

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è un problema di salute significativo, con ~ 2 milioni di casi in Canada e negli Stati Uniti ogni anno 1,2. Il trauma cranico colpisce tutte le fasce d'età e i generi e ha un tasso di incidenza maggiore di qualsiasi altra malattia, in particolare il cancro al seno, l'AIDS, il morbo di Parkinson e la sclerosi multipla3. Nonostante la prevalenza del trauma cranico, la sua fisiopatologia rimane poco conosciuta e le opzioni di trattamento sono limitate. In parte, ciò è dovuto al fatto che l'85% di tutti i TBI sono classificati come lievi (mTBI) e in precedenza si pensava che l'mTBI producesse solo cambiamenti comportamentali limitati e transitori senza conseguenze neuropsichiatriche a lungo termine 4,5. È ormai riconosciuto che il recupero di mTBI può richiedere settimane o anni5,6, precipitare condizioni neurologiche più gravi4 e che anche ripetuti impatti "sub-concussivi" influenzano il cervello7. Questo è allarmante in quanto gli atleti in sport come l'hockey / calcio hanno >10 impatti sub-concussivi per partita / sessione di allenamento 7,8,9,10.

Gli adolescenti hanno la più alta incidenza di mTBI, e in Canada, circa uno su 10 adolescenti cercherà assistenza medica per una commozione cerebrale correlata allo sport ogni anno11,12. In realtà, qualsiasi impatto sub-concussivo alla testa o mTBI può causare danni diffusi al cervello, e questo potrebbe anche creare uno stato più vulnerabile per lesioni successive e / o condizioni neurologiche più gravi 13,14,15,16,17. In Canada, è riconosciuto legalmente tramite la legge di Rowan che una lesione precedente può aumentare la vulnerabilità del cervello a ulteriori lesioni18, ma la comprensione meccanicistica di r-mTBI rimane tristemente inadeguata. È chiaro, tuttavia, che singoli e r-mTBI possono influire sulla capacità di apprendimento durante gli anni scolastici 19,20, avere esiti specifici per sesso 21,22,23,2 4 e compromettere la capacità cognitiva più tardi nella vita16,25,26. In effetti, le analisi di coorte associano fortemente r-mTBI all'inizio della vita con demenza più tardi27,28. r-mTBI è anche potenzialmente associato a encefalopatia traumatica cronica (CTE), che è caratterizzata dall'accumulo di proteina tau iperfosforilata e atrofia corticale progressiva e precipitata da infiammazione significativa 27,29,30,31. Sebbene i legami tra r-mTBI e CTE siano attualmente controversi32, questo modello consentirà di esplorarli in modo più dettagliato in un contesto preclinico.

Un mTBI è spesso descritto come una "lesione invisibile", poiché si verifica all'interno di un cranio chiuso ed è difficile da rilevare anche con le moderne tecniche di imaging33,34. Un modello sperimentale accurato di mTBI dovrebbe aderire a due principi. In primo luogo, dovrebbe ricapitolare le forze biomeccaniche normalmente osservate nella popolazione clinica35. In secondo luogo, il modello dovrebbe indurre esiti comportamentali eterogenei, qualcosa che è anche altamente prevalente nelle popolazioni cliniche36,37,38. Attualmente, la maggior parte dei modelli preclinici tende ad essere più grave, coinvolgendo craniotomia, contenzione stereotassica della testa, anestesia e impatti corticali controllati (CCI) che producono danni strutturali significativi e deficit comportamentali più estesi di quelli normalmente osservati clinicamente33. Un'altra preoccupazione con molti modelli preclinici di commozione cerebrale che coinvolgono craniotomie è che questa procedura stessa crea infiammazione nel cervello, e questo può esacerbare i sintomi di mTBI e neuropatologia da qualsiasi lesione successiva39,40. L'anestesia introduce anche diversi confondimenti complessi, tra cui la riduzione dell'infiammazione 41,42,43, la modulazione della funzione microgliale44, il rilascio di glutammato 45, l'ingresso di Ca2+ attraverso i recettori NMDA 46, la pressione intracranica e il metabolismo cerebrale 47. L'anestesia introduce ulteriormente confusioni aumentando la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB), l'iperfosforilazione tau e i livelli di corticosteroidi, riducendo la funzione cognitiva 48,49,50,51. Inoltre, le lesioni diffuse e a testa chiusa rappresentano la stragrande maggioranza degli mTBI clinici52. Consentono inoltre di studiare meglio la moltitudine di fattori che possono influenzare i risultati comportamentali, tra cui il sesso21, l'età 53, l'intervallo interlesionale15, la gravità54 e il numero di lesioni23.

La direzione delle forze accelerative / decelerative (verticali o orizzontali) è anche una considerazione importante per i risultati comportamentali e molecolari. La ricerca di Mychasiuk e colleghi ha confrontato due modelli di mTBI diffusi a testa chiusa: calo di peso (forze verticali) e impatto laterale (forze orizzontali)55. Sia le analisi comportamentali che quelle molecolari hanno rivelato esiti eterogenei dipendenti dal modello e dal sesso dopo mTBI. Pertanto, i modelli animali che aiutano a evitare le procedure chirurgiche, pur incorporando forze lineari e rotazionali, sono più rappresentativi delle condizioni fisiologiche in cui queste lesioni si verificano normalmente33,56. Il modello ACHI è stato creato in risposta a questa esigenza, consentendo l'induzione rapida e riproducibile di mTBI nei ratti evitando procedure (cioè l'anestesia) che sono note per influenzare le differenze di sesso57.

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Protocollo

L'approvazione per tutte le procedure animali è stata fornita dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Victoria in conformità con gli standard del Canadian Council on Animal Care (CCAC). Tutti i ratti Long-Evans maschi sono stati allevati internamente o acquistati (vedi la tabella dei materiali).

1. Condizioni di stabulazione e di allevamento

  1. Consentire agli animali di acclimatarsi al loro ambiente di stabulazione per 1 settimana prima dello svezzamento al giorno postnatale (PND) 21.
  2. Mantenere i ratti in gabbia standard a 22,5 °C ± 2,5 °C, con accesso ad libitum a cibo e acqua, con un ciclo luce/buio di 12 ore.
  3. Raggruppa e ospita gli animali con due o tre compagni di cucciolata abbinati al sesso e assegnali in modo casuale a condizioni fittizie o r-mTBI.
  4. Eseguire tutte le procedure tra le 7:30 e le 23:30.

2. Impostazione della procedura di trauma cranico chiuso sveglio

  1. Posizione a 2,75 pollici. tampone in schiuma a bassa densità (100 cm x 15 cm x 7 cm) sotto il dispositivo d'urto per consentire il movimento rotazionale della testa.
    NOTA: Il tampone di schiuma aveva una costante di molla di ~ 2.500 N / m ma può variare tra 3.100 e 5.600 N / m58. Il livello di fermezza (basso, medio e alto) non ha dimostrato di essere predittivo dell'esito dell'infortunio59. Il tampone di schiuma è un materiale non consumabile. Normalmente viene sostituito annualmente o se sporco o danneggiato.
  2. Accendere il dispositivo di impatto corticale modificato (Figura 1A) e impostare la velocità su 6 m/s.
    NOTA: Queste specifiche sono progettate per provocare una compromissione neurologica acuta nei ratti giovani e adolescenti in età analoga alle caratteristiche di un mTBI, ma tali parametri potrebbero non essere adatti per animali anziani o altre specie (ad esempio, topi o furetti). Per una revisione dei parametri ACHI comuni, vedere60.

3. Induzione di mTBI

  1. Quando i ratti raggiungono PND 24, spostarli nella stanza delle procedure dove verranno eseguite le procedure. Assicurati che questa stanza sia separata dal normale ambiente abitativo.
  2. Posizionare delicatamente il ratto in un cono di contenuta, assicurandosi che il muso e le narici siano vicini alla piccola apertura del cono per consentire un'adeguata ventilazione. Utilizzare un fermaglio per capelli di plastica per tenere il cono chiuso all'estremità caudale per impedire il movimento una volta che il topo è posizionato nel cono di cono.
    1. Utilizzare i punteggi di ritenuta per registrare la conformità o la tolleranza degli animali con il cono di ritenuta e la procedura ACHI.
      NOTA: Il punteggio di ritenuta può essere utilizzato come valutazione dello stress negli animali. Pertanto, i criteri di esclusione possono essere sviluppati utilizzando il punteggio di contenzione per ridurre la variabilità tra i soggetti che sorge a causa di un'eccessiva risposta allo stress.
      1. Dai un punteggio da 0 a 4 in base alla volontà dell'animale di entrare nel cono, ai suoi movimenti e vocalizzazioni. Dai un punteggio di 0 se non c'è resistenza al contenimento, mentre un punteggio di 1 corrisponde all'animale che gira 1-2x e poca o nessuna vocalizzazione o contorcersi. Dai un punteggio di 2 se l'animale ha compiuto 2-3 volte e mostra qualche vocalizzazione o contorcersi. Dare un punteggio di contenimento di 3 se l'animale ha girato 5-10x e mostra più vocalizzazioni e dimenarsi. Infine, dai un punteggio di 4 se l'animale ha girato più di 10x con frequenti vocalizzazioni e contorcersi.
        NOTA: Queste informazioni si trovano anche nella scheda di valutazione stessa (Tabella supplementare S1 e Tabella supplementare S2).
  3. Mentre il ratto è trattenuto, posizionare manualmente il casco (Figura 1B) sopra la linea mediana, con il disco di puntamento sopra il lobo parietale sinistro (Figura 1C,D).
  4. Posizionare il ratto sul tampone di schiuma e impostare manualmente il dispositivo d'urto sulla posizione Estendi . Abbassare manualmente la punta del dispositivo d'urto in modo che entri in contatto con il disco di puntamento sul casco. Impostare manualmente il dispositivo di simulazione sulla posizione Retrazione per fare in modo che il dispositivo d'urto si ritiri 10 mm sopra il casco.
  5. Utilizzare la manopola sul braccio stereotassico per abbassare la punta dell'impatto di 10 mm in modo che tocchi nuovamente il disco di puntamento sul casco. Ruotare l'interruttore Impact in modo che la testa dell'animale venga accelerata rapidamente per 10 mm a 6 m/s.
  6. Una volta attivato il dispositivo, rimuovere immediatamente l'animale dal cono di ritenuta e procedere all'esecuzione di un protocollo di valutazione neurologica immediato (NAP).
    NOTA: Per gli esperimenti attuali, questo protocollo è stato ripetuto otto volte in totale a intervalli di 2 ore.

4. Induzione di lesioni fittizie

  1. Seguire tutte le procedure sperimentali come descritto sopra nella sezione 3, ma posizionare il ratto adiacente al percorso del pistone d'impatto, in modo da non riportare lesioni.

5. Protocollo di valutazione neurologica

NOTA: Il NAP può essere utilizzato per misurare il livello di coscienza, così come il funzionamento cognitivo e sensomotorio.

  1. Al basale e immediatamente dopo l'induzione dell'mTBI o della lesione fittizia, valutare i ratti utilizzando il NAP come descritto in56,61. Su un tavolo, posizionare la gabbia domestica dei ratti e una gabbia di recupero distanziata di 100 cm. Centrare uniformemente la trave di bilanciamento sopra entrambe le gabbie. Inoltre, posizionare un asciugamano piegato o un'imbottitura aggiuntiva sotto la trave di equilibrio.
  2. Se necessario, valutare il livello di coscienza. Se gli animali non rispondono dopo l'mTBI, valutare l'apnea (cessazione della respirazione) e qualsiasi ritardo nel riflesso di raddrizzamento utilizzando un cronometro per registrare il tempo impiegato dall'animale per riprendere la respirazione e/o raddrizzarsi da posizione supina in posizione prona.
    NOTA: La perdita del riflesso raddrizzante e l'apnea sono rare con il modello ECCHI, ma possono occasionalmente essere osservate negli animali giovani.
  3. Valutare la funzione cognitiva e sensomotoria del ratto utilizzando la seguente sequenza di test. Somministrare rapidamente questi test in successione dopo la valutazione della coscienza.
    NOTA: La somma di questi quattro test produce un punteggio totale su 12, se non ci sono deficit comportamentali osservati. I deficit sminuiscono questo punteggio.
    1. Risposta di sorpresa
      1. Metti il topo nella gabbia di recupero vuota e batti forte (50 cm) sopra la gabbia. Registrare la risposta dell'animale al rumore utilizzando il seguente sistema di punteggio:
        3 = Reazione rapida al suono (ad esempio, movimento dell'orecchio / contrazioni, salto, blocco di tutto il corpo).
        2 = Reazione lenta o leggera reazione di congelamento al suono.
        1 = Si osservano solo movimenti dell'orecchio.
        0 = Nessuna reazione al suono.
    2. Estensione dell'arto
      1. Con il raggio (100 cm di lunghezza x 2 cm di larghezza x 0,75 cm di spessore) posizionato orizzontalmente attraverso la casa del ratto e le gabbie di recupero, raccogliere il ratto per la base della coda e tenerlo vicino al raggio. Assicurati che il topo sia abbastanza vicino da poterlo afferrare facilmente. Valuta la capacità del ratto di estendere entrambi gli arti verso il raggio con il seguente sistema di punteggio:
        3 = Estensione completa di entrambi gli arti anteriori e afferra la trave.
        2 = Solo un arto è esteso.
        1 = Estensione intermittente o retrazione degli arti anteriori.
        0 = Gli arti anteriori sono molli/nessuna estensione.
    3. Camminata a trave
      1. Posizionare l'animale al centro della trave orizzontale al segno di 50 cm di fronte alla sua gabbia domestica. Assicurarsi che il raggio sia equamente distanziato tra la gabbia domestica del ratto e la gabbia di recupero (posizionata a ~ 80 cm di distanza). Permetti al topo di camminare attraverso la trave. Valutare la capacità del ratto di bilanciare e camminare con il seguente sistema di punteggio:
        3 = Cammina con successo attraverso la trave con meno di due piedi scivola entro 10 s.
        2 = Cammina con successo il raggio, ma si osservano più di due scivolamenti del piede.
        1 = Movimento non locomotore, movimento "nuotatore".
        0 = Incapace di camminare lungo la trave o di muoversi entro 10 secondi.
    4. Trave rotante
      1. Riposizionare il ratto al centro del raggio, assicurandosi che il ratto sia bilanciato. Sollevare la trave di 80 cm sopra un asciugamano o una superficie imbottita e iniziare a ruotare manualmente la trave ad una velocità di rotazione al secondo per 4 s (per un totale di quattro rotazioni). Valuta la capacità del ratto di rimanere sul raggio mentre ruota con il seguente sistema di punteggio:
        3 = Il ratto rimane sulla trave per tutte e quattro le rotazioni.
        2 = Il ratto cade alla quarta rotazione.
        1 = Il ratto cade sulla seconda o terza rotazione.
        0 = Il ratto cade durante la prima rotazione.
  4. Al completamento del NAP, riportare mTBI e ratti fittizi nelle loro gabbie domestiche. Ripetere l'operazione se necessario per le procedure r-mTBI. Monitorare il benessere degli animali a seguito di lesioni con la lista di controllo per il monitoraggio lato gabbia (file supplementare 1). Se vi è qualche indicazione di anomalia (qualsiasi punteggio che non è N) durante il monitoraggio lato gabbia, un punteggio completo del dolore deve essere preso con la scala del dolore e la lista di controllo del monitoraggio avanzato dopo l'impatto della testa (file supplementare 2).

6. Preparazione delle fette

NOTA: Nel presente studio, la plasticità sinaptica è stata valutata negli animali dopo r-mTBI a 1 o 7 giorni dopo mTBI. In questi giorni, gli animali sono stati portati individualmente nel laboratorio in gabbie coperte prima del sacrificio.

  1. Conservare in frigorifero (-20 °C) durante la notte tutti gli strumenti chirurgici (Figura 2A) necessari per la realizzazione di fette di ippocampo: forbici standard, forbici da dissezione, pinze, rongeur, spatole e blocchi refrigeranti.
    NOTA: La colla per tessuti e la camera di incubazione non devono essere refrigerate.
  2. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) contenente 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaHPO 4, 25 mM NaHCO 3, 2 mM CaCl 2,1,3 mM MgCl 2 e 10 mM destrosio (300 ± 10 mOsm; pH 7,2-7,4).
    NOTA: La soluzione principale di aCSF deve essere continuamente bollente con carbogeno (95% O 2/5% CO2) per tutta la durata del protocollo.
  3. Prima di eutanasia l'animale (punto 6.8), preparare 12,5 ml di agarosio. Sciogliere 0,25 g di agarosio in 12,5 mL di soluzione salina tamponata fosfato (1x PBS) mediante microonde in un tubo conico da 50 mL con incrementi di 10 s.
  4. Tenere l'agarosio caldo (42 °C) e agitare in una piastra riscaldante per evitare che si solidifichi.
  5. Installare una stazione di taglio su ghiaccio, comprendente una capsula di Petri e un piccolo becher (50 ml) riempito con aCSF ghiacciato (4 °C) e una capsula di Petri rovesciata con un pezzo di carta da filtro bagnata sulla parte superiore (Figura 2A). Bollire continuamente l'aCSF nel piccolo becher con carbogen.
  6. Riscaldare il bagnomaria a 32 °C. Riempire la camera di recupero con aCSF e bollire continuamente con carbogeno (Figura 2B).
  7. Trasportare l'animale nella stanza sperimentale.
  8. Anestetizzare l'animale usando isoflurano al 5% come inalante (fino alla mancanza di un riflesso di ritiro) e poi decapitarlo rapidamente usando una piccola ghigliottina.
  9. Sezionare il cervello dal cranio nella capsula di Petri piena di aCSF ghiacciato (4 ° C), tenendo il cranio immerso nell'aCSF per aiutare a raffreddare rapidamente il tessuto.
    NOTA: Questa procedura richiede normalmente meno di 5 minuti, ma la velocità di rimozione del cervello non è un fattore critico se il cervello è immerso in aCSF refrigerato.
  10. Posizionare il cervello nel piccolo becher di aCSF raffreddato e carbogenato per pulire e raffreddare ulteriormente il campione.
  11. Sposta il cervello verso la piastra di Petri capovolta e posizionala sulla carta da filtro. Usa un bisturi affilato per rimuovere il cervelletto e la corteccia prefrontale per "bloccare" il cervello. Separare i due emisferi facendo un taglio lungo la linea mediana del cervello.
    Nota : il seguente protocollo viene eseguito un emisfero alla volta. È imperativo che l'emisfero attualmente in preparazione rimanga immerso nel becher di aCSF carbogenato ghiacciato (4 °C).
  12. Per creare fette di ippocampo trasversali, posizionare l'emisfero sulla superficie mediale. Inclinare la lama di un bisturi a ~ 30 ° verso l'interno e rimuovere una fetta sottile dalla superficie dorsale del cervello per fornire una superficie piatta per il cervello da montare sul pistone utilizzato dall'affettatrice. Capovolgere il cervello sulla superficie dorsale e tamponare delicatamente il tessuto su carta da filtro asciutta per rimuovere l'eccesso di aCSF. Usando la colla cianoacrilica, attaccare la superficie dorsale del cervello al pistone, lasciando la superficie ventrale in posizione verticale.
    NOTA: Assicurarsi che la colla non scorra oltre il bordo del pistone, in quanto ciò causerà l'adesione al tubo metallico utilizzato per contenere l'agarosio e impedirà il movimento del pistone.
  13. Estendere il tubo esterno del pistone sopra il cervello e versare l'agarosio liquido nel tubo fino a quando il cervello è completamente coperto. Solidificare rapidamente l'agarosio bloccando un blocco di raffreddamento sul tubo del pistone (Figura 2A).
  14. Posizionare il pistone nella camera dell'affettatrice e fissare la camera con una vite. Fissare la lama e aggiungere aCSF ossigenato e ghiacciato alla camera dell'affettatrice.
  15. Sul filtro dei dati (Figura 2B), impostare la velocità di taglio su 4, l'oscillazione su 6 e impostare l'interruttore di taglio continuo/singolo su continuo. Spingere start per iniziare a sezionare il cervello a 400 μm.
  16. Mentre l'affettatrice seziona il cervello, utilizzare una pipetta Pasteur di grande diametro per trasferire ogni fetta al bagno di recupero dell'aCSF ossigenato mentre viene sezionato (Figura 2C).
    NOTA: Quando ogni fetta viene tagliata, può essere posizionata in sequenza nei diversi pozzetti del bagno di recupero. Questo protocollo di solito produce tra sei e otto fette, contenenti l'ippocampo per ogni emisfero. Un atlante di ratto62 può essere utilizzato per identificare la posizione dorsale-ventrale delle singole fette nel cervello del ratto.
  17. Lasciare riposare le fette a 32 °C per 30 minuti e poi lasciare recuperare per altri 30 minuti a temperatura ambiente (23 °C).
  18. Ripetete questi passaggi per creare sezioni dal secondo emisfero.

7. Elettrofisiologia di campo

NOTA: per acquisire registrazioni del campo extracellulare dal giro dentato (DG), attenersi alla seguente procedura. Dopo il recupero di 60 minuti, le singole fette di ippocampo sono pronte per le registrazioni sul campo extracellulare.

  1. Utilizzando un estrattore di micropipette disponibile in commercio, tirare elettrodi di registrazione (1-2 MΩ) da capillari di vetro borosilicato da 10 cm con un diametro esterno di 1,5 mm e un diametro interno di 1,1 mm.
    NOTA: l'elettrodo di registrazione deve avere una resistenza di ~1 MΩ e le punte devono avere una dimensione di ~1 mm. La coerenza nei parametri dell'elettrodo è importante per una buona registrazione.
  2. Accendere il computer e le apparecchiature da utilizzare per le registrazioni: amplificatore, digitalizzatore, stimolatore, micromanipolatore, regolatore di temperatura, luce del microscopio e pompa per vuoto.
  3. Riempire un becher con aCSF e collegarlo a un sistema di perfusione a gravità controllata. Aprire la valvola aCSF sul sistema di perfusione per iniziare un flusso di aCSF attraverso la camera di perfusione. Mantenere una portata di circa uno o due gocciolamenti/s o 2 ml/min. ACSF carbogenato continuo per la durata delle registrazioni elettrofisiologiche.
    NOTA: È imperativo mantenere un tasso di gocciolamento costante di aCSF carbogenato durante le registrazioni sul campo. È inoltre imperativo che l'elettrodo di riferimento sia completamente immerso in aCSF.
  4. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire una fetta di ippocampo dal bagno di recupero alla camera di perfusione che viene continuamente perfusa con aCSF carbogenato e mantenuta a 30 ± 0,5 °C. Orientare la fetta di cervello in modo che il giro dentato e lo strato di cellule granulari siano visibili nel campo visivo. Stabilizzare la fetta con pesi di filo piegati. Avviare il software del computer per l'acquisizione dei dati.
    NOTA: può essere utile spegnere la pompa per vuoto durante questa fase per consentire la libera manipolazione del tessuto. Questo dovrebbe essere fatto rapidamente in quanto troppa manipolazione può danneggiare il tessuto. Inoltre, la camera di perfusione può traboccare con aCSF se questo richiede troppo tempo. Una volta che il tessuto è orientato correttamente e stabilizzato, accendere la pompa per vuoto.
  5. Utilizzare un microscopio verticale per visualizzare il DG con ottica obliqua. Posizionare un elettrodo concentrico bipolare stimolante per attivare le fibre del percorso perforante mediale (MPP) nel terzo centrale dello strato molecolare. Quindi, posizionare una micropipetta di vetro, riempita con aCSF nell'MPP (Figura 3A,B). Inizia con gli elettrodi più distanti (cioè l'elettrodo stimolante vicino a CA3 e l'elettrodo di registrazione appena sopra il genu del DG), poiché toccando il tessuto causerà danni alle fibre.
    NOTA: In modo ottimale, tutte le registrazioni dovrebbero avere gli elettrodi posizionati equidistanti dallo strato cellulare, a circa 200 μm di distanza.
  6. Una volta posizionati gli elettrodi stimolanti e di registrazione, visualizzare le risposte di campo evocate utilizzando un amplificatore, un digitalizzatore e un software di registrazione.
  7. Per trovare un potenziale postsinaptico eccitatorio di campo adatto (fEPSP), stimolare il tessuto con impulsi di corrente di 0,12 ms a 0,2 Hz (ogni 5 s) quando l'utente è abile nel trovare risposte, o a 0,067 Hz (ogni 15 s) per gli utenti meno esperti per evitare la sovrastimolazione. Assicurarsi che la fEPSP abbia un'ampiezza minima di 0,7 mV con una volée di fibre chiare inferiore alla fEPSP.
    NOTA: È fondamentale posizionare entrambi gli elettrodi equidistanti dallo strato cellulare per ottenere le massime risposte di campo e abbastanza distanti (cioè ~ 200 μm) per generare una piccola raffica di fibre. Piccoli aggiustamenti nella posizione dell'elettrodo possono aiutare a migliorare l'ampiezza della risposta, anche se questi dovrebbero essere ridotti al minimo per evitare danni ai tessuti.
  8. Determinare l'ampiezza massima della fEPSP aumentando l'intensità di stimolazione e quindi impostare l'intensità di simulazione in modo che la fEPSP sia al 70% dell'ampiezza massima.
    NOTA: l'ampiezza massima è impostata al 70% per gli studi sulla depressione a lungo termine (LTD) e al 50% per gli studi di potenziamento a lungo termine (LTP). L'ampiezza massima viene determinata regolando la forza di stimolazione fino a quando la fEPSP non aumenta più di ampiezza. Per un fEPSP con un'ampiezza massima di 2 mV, la dimensione della risposta verrebbe quindi regolata a 1,4 mV per gli studi LTD e 1,0 mV per gli studi LTP, per consentire al fEPSP di deprimersi o potenziarsi (rispettivamente).
  9. Stabilire una linea di base di precondizionamento stabile per 20 minuti con impulsi di 0,12 ms erogati a 0,067 Hz. Affinché le sezioni siano considerate stabili, cercare una variabilità del <10% nella pendenza iniziale della fEPSP e che la pendenza della linea di migliore adattamento attraverso le pendenze fEPSP tracciate sia <0,5. Procedere con i passaggi successivi della registrazione quando gli EPSP sono verificati per essere stabili per 20 minuti.
    NOTA: Vari antagonisti del recettore possono essere aggiunti all'aCSF per bloccare o migliorare LTD e LTP. Se sono necessari, assicurarsi che le fette siano esposte a questi agenti farmacologici durante questo periodo di riferimento e che siano soddisfatti i requisiti per registrazioni stabili. Per alcuni esempi, vedere63,64,65.
  10. In primo luogo, determinare i cambiamenti nelle proprietà sinaptiche di base utilizzando stimoli a impulsi accoppiati e costruendo curve input-output stimolo-risposta. Per il test a impulsi accoppiati, applicare una serie di impulsi accoppiati con un intervallo di interimpulso di 50 ms a 0,033 Hz. Per le curve input-output, applicare una serie (10) di intensità di stimolo crescenti (0,0-0,24 ms) a 0,033 Hz per tracciare la variazione delle dimensioni della risposta fEPSP.
  11. Per studiare LTD che dipende principalmente dall'attivazione dei recettori CB164,66, utilizzare un protocollo a 10 Hz (6.000 impulsi a 10 Hz). Questo protocollo richiede 10 minuti per essere somministrato.
  12. Per le registrazioni post-condizionamento, riprendere utilizzando la stimolazione a impulso singolo (0,12 ms a una frequenza di 0,067 Hz) per altri 60 minuti.
  13. Dopo la registrazione post-condizionamento, somministrare nuovamente gli stimoli a impulsi accoppiati, seguiti da una curva input-output. Confronta questi con le registrazioni basali per osservare le alterazioni nelle proprietà di rilascio presinaptico e aiutare a valutare la salute della fetta per le registrazioni a lungo termine.
  14. Durante l'analisi, essere prudenti e rispettare i criteri di esclusione nel determinare se i dati delle singole sezioni debbano essere conservati nel set di dati sulla plasticità sinaptica. Escludere le sezioni che mostrano una grande pendenza in una linea di adattamento migliore delle pendenze fEPSP durante la linea di base di precondizionamento (pendenza >0,5), instabilità nella linea di base di precondizionamento (variazione >10%) e o instabilità nel periodo di postcondizionamento (pendenza >1,5 in 50-60 minuti di postcondizionamento).

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Risultati

Il modello di trauma cranico chiuso sveglio è un metodo praticabile per indurre r-mTBI nei ratti giovani. I ratti esposti a r-mTBI con il modello ACHI non hanno mostrato deficit comportamentali evidenti. I soggetti in questi esperimenti non hanno mostrato latenza a destra o apnea in nessun momento durante la procedura r-mTBI, indicando che si trattava effettivamente di una procedura TBI lieve. Sottili differenze comportamentali sono emerse nel NAP; Come descritto sopra, i ratti sono stati valutati su quattro compiti sens...

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Discussione

La maggior parte della ricerca preclinica ha utilizzato modelli di mTBI che non ricapitolano le forze biomeccaniche osservate nella popolazione clinica. Qui, viene mostrato come il modello ACHI può essere utilizzato per indurre r-mTBI nei ratti giovani. Questo modello a testa chiusa di r-mTBI presenta vantaggi significativi rispetto alle procedure più invasive. In primo luogo, l'ACHI normalmente non causa fratture craniche, emorragie cerebrali o decessi, che sarebbero tutte controindicazioni di un TBI "lieve" nelle popol...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo tutti i membri del Christie Laboratory presso l'Università di Victoria, passati e presenti, per il loro contributo allo sviluppo di questo protocollo. Questo progetto è stato sostenuto con fondi del Canadian Institutes for Health Research (CIHR: FRN 175042) e NSERC (RGPIN-06104-2019). La grafica del cranio Figura 1 è stata creata con BioRender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Elmetto stampato in 3D Progettato e costruito dal laboratorio Christie (Vedi le specifiche in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience) 
AgarosioFisher Scientific (BioReagenti)BP160500
Camera per anestesiaFatto in casaN / APlexiglass Contenitore
Riscaldatore automaticoController Warner ElectricTC-324B
Axon DigidataMolecular Devices1440ASistema di acquisizione dati a basso rumore
Trave di bilanciamento Può essere costruito o acquistato (100 cm di lunghezza x 2 cm di larghezza x 0,75 cm di spessore)
Cloruro di calcioBio Basic Canada Inc.CD0050Per aCSF
CameraDage MTINC-70
Serbatoio CarbogenPraxairMM OXCD5C-KAnidride Carbonica 5%, Ossigeno 95%
Clampex SoftwareMolecular DevicesClampex 10.5 Versione
Compresstome Microtomo vibrantedi precisioneVF 310-0Z
Elettrodo bipolare concentricoFHC Inc.
Destrosio (D-glucosio)Fisher Scientific (chimico)D16-3aCSF
Amplificatore di isolamento dello stimolo digitale   Ottenere strumenti, Inc.Modello 4D
Fosfato disodicoFisher Scientific (Chemical)S373-500PBS
Strumenti
Feather Double Edge Blade Microscopiaelettronica Scienze72002-10
Carta da filtroWhatman 11001-055
Estrattore per micropipette fiammeggiante/marroneStrumento SutterP-1000
FermaglioPuò essere ottenuto da qualsiasi grande magazzino
GabbieGabbie per ratti normali dall'unità di cura degli animali.
Hum Bug Noise EliminatorQuest Scientific 726300
Isoflurano USPFresenius KabiCP0406V2
Isotemp 215 Bagno d'acqua digitaleFisher Scientific 15-462-15
Unità Leica Impact One CCIBiosystemsè stata modificata per contenere la punta d'impatto in gomma da 7 mm
Ratti Long-Evans, maschioCharles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Pad in schiuma a bassa densità Foglioschiuma poliuretanica da 3" 
Cloruro di magnesioFisher Scientific (Chimico)M33-500aCSF
Maschio Long Evans RattiCharles River LaboratoriesAnimali ordinati da Charles River Laboratories, o cuccioli allevati presso l'Università di Victoria
MultiClamp 700B AmplificatoreDispositivi molecolariModello 700B
Strisce reattive per pHVWR Chemicals BDHBDH83931.601
Cloruro di potassioFisher Scientific (chimico)P217-500ACSF, PBS
fosfato di potassioSigmaP9791-500GPBS
Push Button ControllerSiskiyou CorporationMC1000epulsante a pulsante con controller a circuito chiuso
ELITechGroupSS-033Per l'uso con osmometro a pressione
di vapore Asciugamano
Bicarbonato di sodioFisher Scientific (chimico)S233-500aCSF
Cloruro di sodioFisher Scientific (chimico)S271-3Per aCSF, PBS
sodico PhosphateFisher Scientific (Chemical)S369-500aCSF
Coni di ritenuta in plastica morbidaBraintree Scientificmodello DC-200
CronometroMolti membri del laboratorio usano il loro iPhone per questo
tavolo o un grande carrello con bordi rialzati.NAP e ACHI
(con filamento)Sutter InstrumentBF150-110-10Diametro esterno: 1,5 mm; Diametro interno: 1,10 mm; Lunghezza: 10 cm
Microscopio verticaleOlympusOlympus BX5OWI5x MPlan 0.10 NA Obiettivo Osmometro
pressione di vapore VaproModello 5600aCSF dovrebbe essere 300-310 mOSM
Vetbond Adesivo tissutale3M1469SB
Tavolo di isolamento dalle vibrazioni del piano di vibrazioneSistemi cinetici9101-01-45
CBAPC75di dissezione per artigli per capelli per la casa e il recupero La punta Leica di Dischi campione a MC1000epiccolo Per vetro borosilicato a parete sottile a

Riferimenti

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