Saggio spot del vuoto in tempo reale

Summary

Questo articolo descrive un nuovo metodo per studiare il comportamento di minzione del topo incorporando il monitoraggio video nel test convenzionale del punto vuoto. Questo approccio fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento e sui dettagli del comportamento del mouse durante le fasi di luce e buio del giorno.

Abstract

Il normale comportamento minzionale è il risultato della funzione coordinata della vescica, dell'uretra e degli sfinteri uretrali sotto il corretto controllo del sistema nervoso. Per studiare il comportamento di minzione volontaria nei modelli murini, i ricercatori hanno sviluppato il void spot assay (VSA), un metodo che misura il numero e l'area di macchie di urina depositate su una carta da filtro che riveste il pavimento della gabbia di un animale. Sebbene tecnicamente semplice e poco costoso, questo test presenta dei limiti quando viene utilizzato come test end-point, tra cui la mancanza di risoluzione temporale degli eventi minzionali e le difficoltà nel quantificare le macchie di urina sovrapposte. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un VSA video-monitorato, che chiamiamo VSA IN TEMPO REALE (RT-VSA), e che ci consente di determinare la frequenza di svuotamento, valutare il volume vuoto e i modelli di svuotamento ed effettuare misurazioni su finestre temporali di 6 ore durante le fasi buie e chiare del giorno. Il metodo descritto in questo rapporto può essere applicato a un'ampia varietà di studi basati sui topi che esplorano gli aspetti fisiologici e neurocomportamentali della minzione volontaria negli stati di salute e malattia.

Introduction

La conservazione delle urine e la minzione sono coordinate da un circuito centrale (sistema nervoso centrale) che riceve informazioni sullo stato di riempimento della vescica attraverso i nervi pelvico e ipogastrico. L'urotelio, l'epitelio che riveste il tratto urinario dalla pelvi renale all'uretra prossimale, forma una stretta barriera ai prodotti di scarto metabolici e agli agenti patogeni presenti nelle urine. È parte integrante di una rete sensoriale, che rileva e comunica lo stato di riempimento della vescica ai tessuti sottostanti e ai nervi afferenti ^1,2. La rottura della barriera uroteliale, o alteraz....

Protocol

Topi uroteliali piezoelettrici a doppio knockout (Pz1/2-KO, genotipo: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE+/-) e controlli (Pz1/2-C, genotipo: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE-/-) sono stati generati internamente da ceppi parentali ottenuti dai laboratori Jax (ceppo # 029213 Piezo1 fl^/fl ; Ceppo Piezo2 fl^/fl # 027720; Upk2^CRE+/- ceppo # 029281). Negli esperimenti sono stati utilizzati topi sia femmine (1,5-3 mesi e 17-20 g di peso) che maschi (2-4 mesi e 23-29 g di peso). Per esperimenti di cistite indotta da ciclof....

Results

Comportamento minzionale dei topi knockout uroteliali piezo1/2

Durante la fase di conservazione del ciclo di minzione, si ipotizza che l'urotelio percepisca la tensione esercitata dall'urina accumulata nella vescica e trasduca questo stimolo meccanico in risposte cellulari come il rilascio sieroso di ATP ^1,3. Abbiamo precedentemente dimostrato che i canali PIEZO1 e PIEZO2 attivati meccanicamente sono espressi.......

Discussion

L'incorporazione del video-monitoraggio è una modifica economica che presenta diversi vantaggi rispetto al VSA classico. Nel VSA classico, che viene tipicamente utilizzato come test end-point, è difficile distinguere punti vuoti sovrapposti. Questa non è una preoccupazione banale, poiché i topi tendono a urinare più volte nella stessa area quando il test viene prolungato per diverse ore, in genere negli angoli della loro gabbia. Pertanto, il primo vantaggio di RT-VSA è che lo sperimentatore può facilmente identificare i .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,00 pollici X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte   taglio a 10 pollici	80/20	1010	Quantità: 20
1.00 " X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte   taglio a 12 pollici	80/20	1010	Quantità: 6
1.00 " X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte   taglio a 40 pollici	80/20	1010	Quantità: 4
1.00 " X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte taglio a 14,75 pollici	80/20	1010	Quantità: 12
1,00" X 1,00 pollici Profilo con scanalatura a T - Quattro scanalature a T aperte taglio a 32 pollici	80/20	1010	Quantità: 5
1/4-20 Dado a T economico a doppio scorrimento	80/20	3280	Importo: 16
1/4-20 Dado a T economico a triplo scorrimento	80/20	3287	Quantità: 18
10 e 25 Serie 2 fori - Staffa angolare interna scanalata da 18 mm con doppio supporto	80/20	14061	Quantità: 6
Serie 10 3 fori - Piastra piana diritta	80/20	4118	Pezzi: 8
Serie 10 5 Fori - Piastra Piana "L"	80/20	4081	Pezzi: 8
Serie 10 5 Fori - Piastra Piana a "T"	80/20	4080	Pezzi: 8
Serie 10 5 Fori - Piastra Piana a T	80/20	4140	Pezzi: 2
Serie 10 Cerniera Sollevabile Standard - Gruppo Destro	80/20	2064	Pezzi: 2
Serie da 10 a 15 a 2 fori - Transizione Lite Staffa angolare interna	80/20	4509	Quantità: 6
luci a tubo UV lunghe 24"	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Quantità: 2 lampadina da 20 W – 24" Lunghezza d'onda: 365nm
Foglio	specchio acrilico Plastica		Quantità: 1 82,5 cm x 26,5 cm
Foglio di specchio acrilico	Plastica		Quantità: 2 26,5 cm x 30,5 cm
Foglio di specchio	acrilico Plastica		Quantità: 2 82,5 cm x 30,5 cm
Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)	80/20	65-2641	Quantità: 2 4,5 mm di spessore, trasparente, 38,5 cm x 26,5 cm
Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)	80/20	65-2641	Quantità: 4 4,5 mm di spessore, trasparente, 38,5 cm x 21,5 cm
Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)	80/20	65-2641	Quantità: 4 4,5 mm di spessore, trasparente, 26,5 cm x 21,5 cm
Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)	80/20	65-2641	Quantità: 4 4,5 mm di spessore, trasparente 37,5 cm x 23,9 cm
Policarbonato AR (resistenza ai raggi UV)	80/20	65-2641	Quantità: 4 4,5 mm di spessore, trasparente, 24,4 cm x 23,9 cm
Carta per cromatografia (carta sottile)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos carta assorbente (carta spessa)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versione 9.4.0	software per grafici e statistiche
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		film trasparente
Quick Time Player 10.5 software	Lettore multimediale	Apple
Spia di sicurezza	Ben software		sistema software di videosorveglianza
Standard End Fastener, 1/4-20	80/20	3381	Quantità: 80
Acrilico a trasmissione UV	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Quantità: 2 38,5 cm x 26,5 cm
Gel d'acqua: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Quantità: 4