Misurazione dell'attività della caspasi mediante un saggio fluorometrico o citometria a flusso

Le caspasi sono coinvolte in diverse forme di morte cellulare programmata. L'apoptosi è la forma più studiata di morte cellulare programmata ed è associata all'attività della caspasi¹. Tutte le caspasi possiedono una subunità catalitica grande e piccola. Caspase-1, caspasi-4, caspasi-5, caspasi-9 e caspasi-11 possiedono un dominio di attivazione e reclutamento della caspasi (CARD), e le caspasi-8 e caspasi-10 contengono domini effettori di morte (DED)2,3,4,5 (Tabella 1). L'apoptosi può essere iniziata da due percorsi principali: la via estrinseca e la via intrinseca. La via apoptotica estrinseca è innescata dai recettori di morte, che fanno parte della superfamiglia dei fattori di necrosi tumorale (TNFSF). I recettori di morte possiedono domini DED, facilitando l'attività della caspasi-8⁶. La via apoptotica intrinseca comporta l'attivazione della caspasi-9 dopo la formazione dell'apoptosoma, richiedendo il rilascio del citocromo c e Apaf-1⁷. L'attivazione della caspasi iniziatrice, caspasi-8 o caspasi-9, porta alla scissione e alla successiva attivazione delle caspasi del boia, che sono caspasi-3, caspasi-6 e caspasi-7. Identificare che le caspasi del boia sono attive indica che le cellule sono in fase di apoptosi, e questa attivazione è considerata un fattore importante nella definizione della modalità di morte cellulare.

L'attivazione della caspasi è anche un momento critico per regolare l'infiammazione e l'induzione di forme alternative di morte cellulare programmata. Ad esempio, l'attivazione della caspasi-1 porta alla maturazione delle citochine pro-infiammatorie della famiglia dell'interleuchina-1⁸. Il rilascio e l'attivazione delle citochine di questa famiglia, in particolare IL-1β e IL-18, derivano dalla scissione del gasdermina D e dalla formazione di pori alla membrana plasmatica ^9,10. Una riparazione inadeguata della membrana dei pori della gasdermina D può provocare un tipo di morte cellulare nota come piroptosi¹¹. Inoltre, l'attività della caspasi-8 provoca l'inibizione di una morte cellulare caspasi-indipendente nota come necroptosi¹². La proteina chinasi 1 serina/treonina che interagisce con i recettori (RIPK1) è uno dei fattori critici nella necroptosi e nel guidare l'infiammazione regolata da NF-kB. I modelli hanno dimostrato che RIPK1 è scisso dalla caspasi-8, con conseguente limitazione della segnalazione NF-kB, dell'apoptosi e della necroptosi^13,14. Pertanto, identificare l'attività delle diverse caspasi può aiutare a comprendere l'infiammazione risultante e la modalità di morte cellulare.

Indipendentemente dalla funzione delle caspasi nella regolazione delle modalità di morte cellulare, l'attività delle caspasi può anche regolare altre famiglie di citochine, come l'interferone (IFN), in risposta all'infezione^15,16. Inoltre, le caspasi sono coinvolte nelle funzioni di morte non cellulare, comprese le decisioni sul destino cellulare, la riparazione e la rigenerazione dei tessuti, la tumorigenesi attraverso la riparazione del DNA e la funzione delle sinapsi neuronali. Si ritiene che l'attività delle caspasi in questi ruoli non letali sia limitata dalla localizzazione cellulare e dalla quantità di caspasi. Pertanto, quantificare il livello di attività della caspasi può ben definire se una cellula subisce la morte cellulare o se la caspasi svolge un ruolo in una funzione di morte non cellulare 4,17,18.

L'attività della caspasi può essere valutata con più metodi. Il Western blotting per le caspasi scisse e i loro substrati è stato usato come indicatore di attività, ma questi test sono qualitativi nella migliore delle ipotesi. Per determinare se l'attività delle caspasi è associata alla morte cellulare, una misurazione quantitativa è l'ideale. Poiché le caspasi scindono i substrati in un sito di riconoscimento costituito da quattro amminoacidi, sono stati sviluppati metodi colorimetrici, luminescenziali o fluorometrici. Tuttavia, le caspasi sembrano avere plasticità nel loro riconoscimento del substrato^19,20. La sequenza di riconoscimento non è associata ai domini proteici (Tabella 1). La sequenza tetrapeptidica DEVD, tuttavia, può essere utilizzata per rilevare l'attività della caspasi-3 e della caspasi-7^20,21.

I mimetici Smac sono composti che prendono di mira gli inibitori delle proteine dell'apoptosi (IAP). L'uso di Mimetici Smac in un sottogruppo di cellule tumorali fa sì che le cellule diventino sensibili alla morte cellulare indotta dal TNF²². Nei macrofagi primari, i mimetici Smac causano la morte cellulare senza l'aggiunta esogena di TNF^23,24. La perdita di cIAP1 da parte della degradazione indotta da Smac mimetico provoca la produzione di TNF. Se viene rilevata l'attività della caspasi, ciò significa che le cellule non sono morte per necroptosi ma in modo apoptotico. In questo metodo, il rilevamento del substrato DEVD scisso viene utilizzato per identificare l'attività della caspasi-3/caspasi-7. Ulteriori esperimenti per confermare la morte cellulare apoptotica sono stati pubblicati in precedenza²⁴.

Il presente studio è stato condotto con l'approvazione e seguendo le linee guida del comitato etico animale dell'Università di Zurigo (#ZH149/19). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 8 e 16 settimane, allevati e alloggiati in specifiche condizioni di assenza di patogeni (SPF). Le ossa intatte possono essere conservate sul ghiaccio nella soluzione salina tamponata di Hank sterile (HBSS) con siero fetale bovino (FBS) inattivato dal calore al 2%. Il midollo osseo è stato raccolto dal femore e dalla tibia del topo²⁵ nel giorno della differenziazione. Entrambi i metodi per valutare l'attività delle caspasi possono essere utilizzati per altri tipi di cellule, sia primarie che trasformate.

1. Differenziazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM)

NOTA: Eseguire tutti i passaggi in una cappa a flusso laminare per coltura tissutale e utilizzare tecniche asettiche sterili.

1. Preparare una siringa da 1 mL con un ago da 21 G.
2. Aggiungere 5 ml di HBSS + 2% FBS in un tubo da 15 ml.
3. Usando una pinza sterile, prendere un femore asportato e inserire l'ago nell'apertura del femore. Tenendo il femore nell'HBSS + 2% FBS, lavare il midollo osseo fino a quando l'osso è bianco. Sciacquare la tibia allo stesso modo. Continuare a lavare la soluzione per ottenere una sospensione a cella singola.
4. Centrifugare la sospensione monocellulare a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente (RT).
5. Rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto. Picchiettare il tubo per risospendere delicatamente il pellet. Aggiungere 1 mL di tampone per lisi dei globuli rossi (vedere Tabella dei materiali) e mescolare delicatamente con una pipetta P1.000. Incubare a RT per 1 min.
6. Aggiungere 10 ml di HBSS + 2% FBS e centrifugare a 200 x g per 4 minuti a RT.
7. Rimuovere il surnatante e risospendere in 10 ml di terreno di coltura per macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM).
   NOTA: Il terreno di coltura BMDM è costituito da DMEM a basso contenuto di glucosio con l'aggiunta di FBS al 10%, M-CSF da 20 ng/ml, penicillina (50 U/ml) e streptomicina (50 μg/ml) (vedere Tabella dei materiali). In alternativa, il mezzo condizionato L929 al 20% può essere sostituito con l'M-CSF.
8. Aggiungere 15 ml di terreno di coltura BMDM in due piastre di Petri da 15 cm. Aggiungere 5 ml della soluzione monocellulare a ciascuna piastra.
   NOTA: Non utilizzare piastre trattate con coltura tissutale. Le piastre trattate con coltura tissutale limitano la differenziazione.
9. Porre i piatti a 37 °C, 5% CO₂, per 6 giorni.
   NOTA: I BMDM possono essere raccolti dopo 5-7 giorni. Tempi di incubazione più lunghi per la differenziazione portano ad una maggiore espressione proteica anti-apoptotica²⁶.

2. Raccolta, semina e trattamento delle cellule

NOTA: Eseguire tutti i passaggi in una cappa a flusso laminare per coltura tissutale e utilizzare tecniche asettiche sterili. I macrofagi completamente differenziati aderiscono alla piastra, consentendo una facile separazione, mentre le cellule galleggianti possono essere scartate. La soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) può essere utilizzata con o senza Ca 2+ e Mg²⁺.

1. Dopo 6 giorni di incubazione, rimuovere le cellule galleggianti e il mezzo dalla piastra utilizzando un aspiratore.
2. Aggiungere 5 ml di PBS a ciascuna piastra da 15 cm. Rimuovere il PBS dalla piastra utilizzando un aspiratore.
3. Aggiungere 2 mL di tripsina (vedere Tabella dei materiali) a ciascuna piastra. Incubare la piastra fino a quando un leggero tocco della piastra rimuove le cellule. Prendere 5 ml di terreno di coltura BMDM e raccogliere le cellule dalla piastra.
   1. Trasferire nella seconda piastra da 15 cm e raccogliere le cellule dalla piastra. Rimuovere la sospensione cellulare dalla piastra in un tubo da 50 ml. Prelevare altri 5 ml di terreno di coltura BMDM e lavare entrambe le piastre per assicurarsi che tutte le cellule siano state raccolte. Posizionare la sospensione cellulare nello stesso tubo da 50 ml.
4. Prendere 10 μL della sospensione cellulare e contare usando un emocitometro usando una diluizione 1:1 con tripano blu.
   NOTA: i contatori automatici delle celle possono essere utilizzati anche quando calibrati per le dimensioni dei macrofagi.
5. Seminare i macrofagi ad una densità di 1 x 10⁶ cellule / ml. I BMDM seminati a 2 x 10⁶ cellule/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti forniscono circa 2 mg/ml di proteine totali. Lasciare che le cellule aderiscano alla piastra per un minimo di 6 ore prima del trattamento.
   NOTA: Per altri tipi di cellule, è necessario determinare la concentrazione ottimale.
6. Trattare i macrofagi con Smac mimetico (Composto A, vedi Tabella dei Materiali)^{22 a 250} nM e 500 nM per 16 ore.
   NOTA: Includere un controllo positivo per indurre l'apoptosi e la scissione della caspasi-3 per garantire che il test funzioni. Gli induttori comuni dell'apoptosi includono staurosporina ed etoposide. Perché molte linee cellulari subiscano apoptosi, 0,1-10 μM per 16 ore di stimolazione sono sufficienti.

3. Preparazione di lisati cellulari da cellule trattate

NOTA: questa fase deve essere eseguita su ghiaccio e i reagenti e i materiali devono essere pre-raffreddati.

1. Trasferire le piastre contenenti le cellule trattate sul ghiaccio. Raccogliere il terreno dalla coltura cellulare in una provetta da 1,5 ml, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C, aspirare il terreno e mettere il tubo su ghiaccio. Ciò consente la raccolta delle celle che si sono staccate dalla piastra.
2. Aggiungere 1 mL di PBS freddo alla piastra di coltura cellulare per lavare le cellule e aspirare tutto il PBS. Aggiungere 100 μL di tripsina alle cellule (se si lavora con un piatto a 6 pozzetti). Lasciare che la tripsina sollevi le cellule dalla piastra e raccoglierle nel tubo da 1,5 ml. Utilizzare 1 ml di PBS freddo per assicurarsi che tutte le cellule siano state raccolte.
   NOTA: Se si lavora con celle di sospensione, trasferire delicatamente il mezzo e le celle in un tubo da 1,5 ml.
3. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere in tampone di lisi DISC da 100 μL (150 mM di cloruro di sodio, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% di glicerolo, 20 mM di Tris, pH 7,5, vedere Tabella dei materiali).
4. Incubare i campioni su ghiaccio per 20 minuti.
5. Centrifugare i lisati a ~12.000 x g per 10 minuti a 4 °C per pellettare la frazione insolubile.
6. Trasferire 25 μL di lisato in una piastra bianca a fondo piatto a 96 pozzetti per il saggio di attività caspasi-3/caspasi-7 (fase 5).
   NOTA: Non disturbare il pellet. Questa è la frazione insolubile del lisato cellulare.
7. Trasferire 10 μL del lisato rimanente in una piastra trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti per il saggio dell'acido bicinconinico (BCA) (fase 4). Questo verrà utilizzato per la normalizzazione dei campioni.
8. Conservare entrambe le piastre sul ghiaccio per ulteriori lavorazioni.
   NOTA: In questa fase, le piastre possono essere sigillate con un coperchio adesivo e conservate a -20 °C per circa 4 settimane.

4. Quantificazione delle proteine mediante il saggio BCA

NOTA: Altri reagenti o saggi possono essere utilizzati per quantificare la quantità di proteine in ciascun campione. Nel test basato sulla popolazione, i campioni possono essere confrontati normalizzando la quantità di proteine utilizzate nel test.

1. Preparare concentrazioni proteiche standard comprese tra 0 μg/mL e 2.000 μg/mL (0 μg/mL, 25 μg/mL, 125 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL, 100 μg/mL, 1.500 μg/mL, 2.000 μg/mL) con albumina sierica bovina (BSA). Preparare gli spazi vuoti solo con buffer di lisi.
2. Aggiungere 10 μL di ciascuna norma nella piastra a fondo piatto a 96 pozzetti contenente i campioni, menzionata al punto 3.7.
3. Miscelare il reagente BCA 1 con il reagente BCA 2 in un rapporto 50:1 (vedere la tabella dei materiali). Aggiungere 200 μL di reagente BCA misto a ciascun campione e standard.
4. Incubare a 37 °C per 30 min.
5. Misurare l'assorbanza a 562 nm su uno strumento fluorometrico e quantificare la concentrazione proteica con la curva standard.

5. Saggio basato sulla popolazione per l'attività della caspasi-3/caspasi-7

NOTA: Non lasciare che i lisati cellulari nella piastra rimangano sul ghiaccio per più di 3 ore. Se l'attività delle caspasi è presente, questa aumenta nel tempo nonostante il campione sia sul ghiaccio. Se i campioni sono stati congelati, scongelarli sul ghiaccio e procedere immediatamente una volta che i lisati si sono scongelati.

1. Avviare lo strumento fluorometrico (vedi Tabella dei materiali) e riscaldare la macchina a 37 °C. Prepara lo script come indicato:
   1. Eseguire letture individuali ogni minuto per 40 minuti al fine di determinare la cinetica della reazione.
   2. Impostare l'eccitazione a 360 nm e l'emissione a 465 nm. Sono sufficienti dieci lampi per pozzetto.
2. Preparare il controllo positivo della caspasi-3 ricombinante (vedi Tabella dei materiali). Miscelare 1 U dell'enzima ricombinante caspasi-3 in 50 μL di tampone di lisi (tubo 1). Aggiungere 25 μL di tampone di lisi ad altri tre provette. Trasferire 25 μL dal tubo 1 al tubo 2. Miscelare mediante pipettaggio.
   1. Ripetere l'operazione per il tubo 3 e il tubo 4. Il tubo 5 conterrà solo 50 μL di tampone di lisi. Aggiungere 25 μL di ciascun standard nella piastra bianca a fondo piatto a 96 pozzetti per il saggio di attività della caspasi-3, menzionato nella fase 3.6.
3. Preparare una miscela di reazioni master per il test dell'attività delle caspasi su ghiaccio. Per una reazione, mescolare 50 μL di tampone di scissione della caspasi 2x (0,2M HEPES pH 7,5; 20% saccarosio o PEG; 0,2% CHAPS), 5 μL di 1 mM DEVD-AMC (substrato tetrapeptidico della caspasi-3), 2 μL di 500 mM DTT e 18 μL di acqua deionizzata (vedere Tabella dei materiali).
4. Aggiungere 75 μL della miscela di reazione a ciascun campione e standard per ottenere un volume totale di reazione di 100 μL.
5. Misurare immediatamente la fluorescenza utilizzando lo strumento fluorometrico impostato al punto 5.1.
6. Per ogni misurazione fluorescente, sottrarre la lettura della fluorescenza per il bianco (solo tampone di lisi) dalla fluorescenza del campione. Normalizzare la lettura dividendo per la concentrazione proteica del campione (calcolata al punto 4.5)²⁷:
   
7. Calcolare la velocità di attività delle caspasi determinando la pendenza della fluorescenza normalizzata sull'asse y e il tempo sull'asse x.

6. Saggio a singola cellula (analisi citometrica a flusso) per l'attività della caspasi-3/caspasi-7

1. Seminare le cellule come descritto nel paragrafo 2.
2. Raccogliere le cellule in un tubo di polistirene da 5 ml. Se si lavora con cellule aderenti, raccogliere il mezzo nel tubo da 5 ml. Aggiungere 1 mL di PBS freddo alla piastra di coltura cellulare e raccogliere il PBS nel tubo da 5 ml. Aggiungere tripsina alle cellule (100 μL se si lavora con piatti a 6 pozzetti). Lasciare che la tripsina sollevi le cellule dalla piastra e si raccolga nel tubo da 5 ml. Utilizzare 1 ml di PBS freddo per assicurarsi che tutte le cellule siano state raccolte.
   NOTA: Se si lavora con celle di sospensione, trasferire delicatamente il mezzo e le celle in un tubo da 5 ml.
3. Centrifugare i campioni a 300 x g per 5 min, 4 °C. Rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto.
4. Preparare la miscela di colorazione. La concentrazione ottimale di colorazione è 1 x 10 6-2 x 10⁶ celle in 50 μL. Diluire il substrato fluorogenico secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali, citometria a flusso). Prelevare 1 μL del substrato madre e diluire in 150 μL di PBS. Aggiungere 50 uL per campione.
5. Incubare i campioni a 37 °C per 30 minuti al riparo dalla luce, con miscelazione ogni 15 minuti.
6. Con il citometro a flusso utilizzato in questo studio, utilizzare il laser rosso a 640 nm e rilevare utilizzando 675/25 nm. Eseguire prima il campione di controllo non colorato e acquisire un minimo di 10.000 eventi della popolazione desiderata. Escludere i detriti utilizzando un cancello (P1) su un dot plot FSC-A e SSC-A.
   1. Utilizzare un istogramma che mostri gli eventi nel gate P1 e il rilevamento per il substrato caspasi (asse y) per determinare l'intensità mediana della fluorescenza (MFI).
      NOTA: Il substrato di caspasi descritto in questo metodo richiede un'eccitazione a 590 nm ed emette a 628 nm.

I macrofagi primari di topo sono stati differenziati per 6 giorni. Dopo 6 giorni, le cellule sono state raccolte, contate e seminate. Sono stati utilizzati i seguenti trattamenti: nessun trattamento e Smac mimetico (composto A)22 a 250 nM e 500 nM per 16 ore (Figura 1). L'esperimento è stato eseguito in duplice copia per consentire di valutare l'attivazione della caspasi-3/caspasi-7 mediante un test basato sulla popolazione o un'analisi a singola cellula utilizzando la citometria a flusso.

La concentrazione proteica dei lisati cellulari è stata quantificata utilizzando il saggio BCA (Tabella supplementare 1). Ciò è necessario per garantire che la quantità di proteine utilizzate nel test di attività della caspasi-3/caspasi-7 sia la stessa tra i campioni. In questo test basato sulla popolazione, i dati possono essere presentati in due modi. Il primo è quello di mostrare la cinetica tracciando la fluorescenza regolata (asse y) rispetto al tempo (asse x) (Figura 2A). In alternativa, la pendenza può essere calcolata per confrontare direttamente i campioni (Figura 2B). L'aumento della pendenza sul trattamento mimetico Smac a 500 nM non era significativo sulla base di un normale ANOVA unidirezionale con confronti multipli (test di confronto multiplo di Dunnett28).

Per l'analisi dell'attività della caspasi-3/caspasi-7 mediante citometria a flusso, sono state raccolte le cellule e il surnatante . Le cellule non colorate o la fluorescenza meno uno sono state utilizzate come controllo negativo, così come le cellule non trattate. Un istogramma delle cellule raccolte mediante citometria a flusso ha mostrato uno spostamento della fluorescenza per le cellule trattate con Mimetici Smac rispetto alle cellule non trattate (Figura 2C). I dati possono essere mostrati sia come intensità mediana di fluorescenza (Figura 2D) o come variazione di piega sulle cellule non trattate (Figura 2E).

Figura 1: Diagramma di flusso dello studio . (A) I femori e le tibie sono stati asportati da topi C57Bl/6. Le ossa sono state lavate e differenziate in 20 ng/mL M-CSF per 6 giorni. (B) Il giorno 6, i macrofagi sono stati raccolti e riseminati per il trattamento. Un set di cellule è stato raccolto per lisati e valutato mediante attività fluorogenica, mentre l'altro set è stato raccolto, incubato con il substrato fluorogenico e valutato mediante citometria a flusso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Saggio cinetico per l'attività della caspasi-3/caspasi-7 e la scissione del substrato mediante citometria a flusso. (A,B) Dati rappresentativi del saggio cinetico per l'attività della caspasi-3/caspasi-7 (C-E) e della scissione del substrato mediante citometria a flusso. I macrofagi sono stati trattati con due concentrazioni di Smac mimetico (Composto A; 250 nM e 500 nM) per 16 ore. (A) Rilevazione del substrato DEVD AFC scisso nel tempo. I dati sono stati normalizzati alla concentrazione proteica nel campione. (B) Il tasso di scissione (pendenza) di DEVD AFC per ciascun campione è stato normalizzato alla pendenza non trattata e presentato come il cambiamento di piega sulle cellule non trattate. (C) Istogrammi citometrici a flusso delle cellule incubate con il substrato della caspasi-3. (D,E) Confronto MFI e variazione della piega nell'IFM rispetto al campione non trattato. Ogni punto dati rappresenta un campione indipendente; sono mostrati l'errore medio ± standard della media; *p < 0,05 utilizzando un ANOVA unidirezionale e test di confronto multipli (test di confronto multiplo di Dunnett). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Specificità del substrato e domini proteici delle caspasi. La tabella è adattata da McStay et al.20; Shalini et al.3; e van Opdenbosch e Lamkanfi4.

Tabella supplementare 1: Analisi cinetica DEVD. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.