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Articolo metodologico

Approccio chirurgico, sfide e risoluzioni per il trapianto di utero nei ratti

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⸱

DOI:

10.3791/64757

⸱

14 aprile 2023

 ,  ,  ,  , 
1Swiss HPB Laboratory, Department of Visceral & Transplant Surgery, University Hospital Zürich

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive tutti i passaggi essenziali per il successo del trapianto uterino (UTx) nei ratti. Il modello di ratto si è dimostrato adatto a promuovere l'implementazione clinica di UTx; tuttavia, rat UTx è una procedura molto complessa che richiede istruzioni accurate.

Abstract

Il trapianto uterino (UTx) è un nuovo approccio per il trattamento delle donne con infertilità assoluta del fattore uterino (AUFI). Si stima che il 3% -5% delle donne soffra di AUFI. Queste donne sono state private della possibilità di avere figli fino all'avvento di UTx. L'applicazione clinica di UTx è stata guidata da studi sperimentali su animali e il primo UTx di successo è stato raggiunto nei ratti. Date le loro caratteristiche fisiologiche, immunologiche, genetiche e riproduttive, i ratti sono un sistema modello adatto per tali trapianti. In particolare, il loro breve periodo di gestazione è un chiaro vantaggio, poiché l'endpoint abituale dell'UTx sperimentale è la gravidanza di successo con parto vivo. La sfida più grande per i modelli di ratto rimane la piccola anatomia, che richiede competenze microchirurgiche avanzate ed esperienza. Sebbene UTx abbia portato alla gravidanza in clinica, la procedura non è stabilita e richiede una continua ottimizzazione sperimentale. Qui viene presentato un protocollo dettagliato, inclusa la risoluzione dei problemi essenziali per il ratto UTx, che dovrebbe rendere l'intera procedura più facile da comprendere per coloro che non hanno esperienza in questo tipo di microchirurgia.

Introduzione

Il trapianto uterino (UTx) è un nuovo trattamento per l'infertilità assoluta del fattore uterino (AUFI). L'AUFI deriva da un'assenza (congenita o acquisita) o da una malformazione dell'utero e colpisce il 3%-5% delle donne in tutto il mondo1. Ragioni etiche, legali o religiose escludono l'adozione o la maternità surrogata per molte donne che hanno un desiderio di maternità ma soffrono di AUFI2. Per queste donne, UTx rimane l'unica opzione per iniziare la propria famiglia. UTx è stato applicato in clinica, anche se con successo misto; La procedura è tecnicamente impegnativa e richiede un miglioramento costante per il suo stabilimento clinico.

Nel 2014, il primo trapianto di utero da un donatore vivente (LD), con conseguente gravidanza di successo, è stato eseguito dal pionieristico gruppo svedese di Brännström3. La prima nascita dopo UTx da un donatore deceduto (DD) è stata segnalata nel 2016 in Brasile4. Entro il 2021, più di 80 UTx sono stati eseguiti in tutto il mondo, tuttavia con un tasso di successo di circa il 50% e con innesti provenienti da LD per la maggior parte1.

Sebbene non salvi la vita, UTx è una procedura sempre più popolare per soddisfare i desideri della propria progenie. Pertanto, la domanda di innesti sta aumentando, ponendo la donazione DD in un focus futuro. Tuttavia, la donazione di DD è complicata a causa di esposizioni ischemiche notevolmente più lunghe al freddo (e nel caso di morte cardiaca, anche a caldo), aumentando i rischi di disfunzione e rigetto del trapianto 5,6. La tecnica chirurgica, la corrispondenza di compatibilità richiesta e l'immunosoppressione associata rimangono problemi critici per quanto riguarda gli esiti UTx7.

Per gestire i rischi di cui sopra nella clinica, sono necessari modelli animali appropriati per l'esplorazione dell'ischemia e dell'immunosoppressione. L'endpoint clinicamente più rilevante per i modelli animali rimane la nascita positiva; ad oggi, gravidanze a seguito di UTx sperimentale sono state raggiunte in topi, ratti, pecore, conigli e scimmie cynomolgus8. Mentre gli animali più grandi sono predestinati all'acquisizione e all'ottimizzazione delle tecniche chirurgiche, i roditori hanno il netto vantaggio di brevi periodi di gestazione. Pertanto, i modelli di roditori sono superiori per quanto riguarda le considerazioni pratiche, finanziarie ed etiche9. Tuttavia, la sfida principale di UTx nei topi è la piccola anatomia, con la chirurgia altamente impegnativa legata alla bassa riproducibilità di UTx10 murino. Al contrario, i ratti sono chirurgicamente più accessibili e conservano i vantaggi di brevi tempi di gestazione. Come tale, il ratto è diventato il modello di scelta per UTx9. Wranning et al. hanno introdotto il modello di ratto di UTx ortotopico nel 2008, e utilizzando questo modello, il primo parto vivo dopo UTx e accoppiamento naturale è stato riportato11,12,13. Studi successivi hanno avuto contributi critici all'implementazione di UTx negli esseri umani9.

Tuttavia, UTx rimane impegnativo nei ratti e solo pochi gruppi hanno ancora padroneggiato questa tecnica chirurgica. Un ostacolo rilevante alla diffusione dell'UTx nel ratto tra i ricercatori è la mancanza di una descrizione precisa delle singole fasi microchirurgiche, delle insidie e delle misure appropriate per la risoluzione dei problemi14. Questo protocollo mira a fornire una guida dettagliata per questa procedura microchirurgica altamente complessa per facilitare l'implementazione di questo modello animale nella ricerca futura.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le prescrizioni federali svizzere sugli animali e approvati dall'Ufficio veterinario di Zurigo (n° 225/2019), garantendo la cura dell'uomo. Le femmine di ratto vergine di Lewis (peso corporeo di 170-200 g) e le femmine di ratto vergine bruno norvegese (170-200 g) sono stati utilizzati come donatori / riceventi dell'utero, mentre i ratti Lewis maschi (300-320 g) sono stati utilizzati per l'accoppiamento. I ratti avevano un'età compresa tra 12 e 15 mesi. Gli animali sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali) e sono stati alloggiati in condizioni controllate e in un ambiente arricchito con libero accesso all'acqua e al cibo standard.

1. Recupero dell'utero

NOTA: Per i dettagli sulla procedura, consultare le relazioni 12,13,15 pubblicate in precedenza.

  1. Indurre l'anestesia con isoflurano e ossigeno all'interno di un contenitore di plexiglas chiuso (14 cm x 25 cm x 13 cm) per 1-2 minuti (isoflurano 5 vol% in O2).
    1. Somministrare buprenorfina per via sottocutanea (0,05 mg/kg) e bupivacaina (0,5%, 8 mg/kg) per via sottocutanea nella regione dell'incisione addominale pianificata 30 minuti prima dell'intervento.
    2. Rasare tutta la pelle addominale del ratto con un rasoio elettrico.
    3. Utilizzare nastri per mantenere l'animale fissato su una piastra riscaldante durante l'intervento chirurgico. Applicare un unguento per gli occhi su entrambi gli occhi.
    4. Mantenere l'anestesia durante la procedura con 2-4 vol% di isoflurano in ossigeno mediante somministrazione continua attraverso un piccolo cono nasale.
    5. Monitorare la profondità dell'anestetico in base ai parametri clinici senza strumenti specializzati (frequenza respiratoria di ~ 70-120 / min-una caduta lenta del 50% è accettabile durante l'anestesia; controllare la profondità dell'anestetico con pizzicare la punta; il colore delle mucose dovrebbe essere rosa, non blu o grigio)16 e regolare la concentrazione di isoflurano di conseguenza.
      NOTA: Opzionale: il monitoraggio frequente della respirazione durante l'intervento chirurgico è fattibile con l'aiuto di un assistente.
    6. Confermare la profondità dell'anestetico eseguendo un pizzico della punta.
    7. Pulire la pelle addominale con un movimento circolare con tre tamponi alternati di una soluzione antisettica e alcool al 70%. Lasciare asciugare.
    8. Posizionare un drappo sterile (vedi Tabella dei materiali) con una finestra addominale sopra l'animale.
  2. Eseguire laparotomia mediana.
    1. Aprire l'addome attraverso un'incisione lunga 6-8 cm sulla linea mediana, a partire da 0,5 cm sotto lo xiphisternum verso l'ipogastrio. Utilizzare un bisturi n. 10 per l'incisione cutanea e piccole forbici affilate per l'incisione linea alba. Non danneggiare il fegato o la vescica.
    2. Spostare l'intestino all'esterno della cavità addominale usando tamponi di cotone, coprirli delicatamente con una garza inumidita con soluzione salina sterile e proteggerli con un sacchetto di plastica sterile per un migliore isolamento.
    3. Inserire divaricatori o clip (vedi Tabella dei materiali) nelle cartelle della parete addominale sinistra e destra per mantenere il muscolo peritoneale da parte e l'addome aperto, per ottenere un accesso e una visibilità ottimali dell'utero e dei vasi associati. Fissare le clip/riavvolgitori con dei nastri.
    4. Applicare soluzione salina preriscaldata per mantenere umida la zona chirurgica e l'intestino ed evitare l'essiccazione dei visceri.
  3. Raccogli il corno uterino destro con la cavità uterina comune e la cervice più i peduncoli vascolari, compresi i vasi iliaci interni, interni e comuni.
    1. Ligate (poliglactina 4/0; vedi Tabella dei materiali), cauterizzare e recidere il corno uterino sinistro adiacente alla ramificazione dalla cavità uterina comune.
    2. Rimuovere il grasso in eccesso che circonda l'utero e la vagina.
      NOTA: Mantenere il grasso intorno al sistema uterino-vascolare.
    3. Sezionare la vescica al suo attaccamento alla cervice con cauterizzazione di tutti i vasi vescicali drenanti e nutrienti. Durante la cauterizzazione, mantenere un'adeguata distanza tra la cervice e la vagina per evitare la cauterizzazione inutile su queste due strutture. Altrimenti, aumenta il rischio di necrosi del trapianto.
      NOTA: La maggior parte delle manipolazioni chirurgiche dovrebbe interessare la vescica. Ritrarre o tirare la vescica caudalmente con un morsetto vascolare (vedere la tabella dei materiali) per ottenere una migliore visione dell'excavatio vesicouterina.
    4. Cauterizzare e recidere i vasi uterini discendenti a livello dell'uretere il più distale possibile alla cervice.
      NOTA: Mantenere la microcircolazione intorno alla vagina e alla cervice il più possibile durante la divisione.
    5. Separare la porzione cervicale/vaginale del futuro innesto dall'attacco rettale e dai legamenti paravaginali e paracervicali.
      NOTA: Evitare qualsiasi cauterizzazione sulla vagina dell'innesto.
    6. Sezionare attentamente la vagina tramite diatermia intorno a 2-3 mm caudale della cervice.
      NOTA: Nessun villi (cervice) è visibile all'interno del lume vaginale.
    7. Localizzare sia l'arteria uterina che la vena alle loro origini. Ligate (poliammide 8/0; vedi Tabella dei materiali), cauterizzare e recidere i vasi glutei e tutti i vasi caudali dei vasi uterini.
      NOTA: La legatura diretta della vena iliaca caudale comune alla vena uterina è solitamente possibile.
    8. Con la dissezione smussata, liberare i vasi iliaci comuni l'uno dall'altro, dalla biforcazione dell'aorta e della vena cava fino alla divisione dei vasi uterini.
      NOTA: Si può ottenere un migliore accesso chirurgico all'area rimuovendo uno o due linfonodi adiacenti.
    9. Asportare il corno uterino destro a 3 mm dalla tuba di Falloppio, dopo aver cauterizzato il peduncolo utero-ovarico allo stesso livello. Ciò consente l'anastomosi del corno uterino innesto nella parte superiore del corno uterino ricevente.
    10. Posizionare le legature (poliammide 8/0) direttamente attorno all'arteria iliaca e alla vena comune destra, prossimali alle biforcazioni aortica e cavale. Fare una piccola incisione (0,5-1 mm) nell'arteria iliaca comune destra adiacente alla biforcazione e inserire un ago da 30 G piegato e smussato o un ago dritto e smussato da 25 G nel lume (per il lavaggio). Fissarlo con una legatura (poliammide 6/0).
      NOTA: Un'ulteriore opzione è il fissaggio aggiuntivo con un morsetto bulldog per evitare lo spostamento dell'ago e/o del vaso.
    11. Sezionare la vena iliaca comune caudalmente della legatura nella vena iliaca comune destra per consentire il deflusso durante il lavaggio.
  4. Lavare l'innesto seguendo i passaggi seguenti.
    1. Lavare manualmente l'utero utilizzando siringhe da 3 ml con circa 9 ml di soluzione fredda di Ringer (RHX: Ringer integrato con 50 UI/mL di eparina e 0,4 mg/mL di xilazina) ad una velocità di flusso di 6 ml/min. Sciacquare nuovamente con 6 mL di soluzione per la conservazione degli organi integrata con eparina (50 UI/ml) e xilazina (0,4 mg/ml) (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: Evitare un'elevata pressione di lavaggio e garantire il corretto posizionamento dell'ago.
    2. Rimuovere il trapianto quando il tessuto uterino è diventato pallido. Tagliare l'arteria iliaca comune caudalmente della legatura alla biforcazione dell'aorta addominale.
  5. Posizionare il trapianto in una soluzione refrigerata per la conservazione degli organi (4 °C) per la preparazione e la conservazione della tavola posteriore prima del trapianto.
  6. Dopo aver rimosso l'innesto, eutanasia l'animale ruotando prima l'impostazione dell'isoflurano al massimo e quindi inducendo il pneumotorace bilaterale seguito dal dissanguamento17.

2. Trapianto di utero singeneico

NOTA: Per i dettagli sulla procedura, consultare le relazioni 12,13,15 pubblicate in precedenza.

  1. Indurre l'anestesia e preparare l'animale come indicato al punto 1.1.
    1. Somministrare analgesia efficace (come descritto al punto 1.1.1) e 200 UI/kg di eparina ad alto peso molecolare 30 minuti prima dell'intervento.
  2. Eseguire laparotomia mediana.
    1. Aprire l'addome attraverso un'incisione della linea mediana lunga 6-8 cm a partire da 0,5 cm sotto lo xifisno verso l'ipogastrio. Utilizzare un bisturi n. 10 per l'incisione cutanea e piccole forbici affilate per l'incisione linea alba. Non danneggiare il fegato e la vescica.
    2. Spostare l'intestino tenue all'esterno della cavità addominale usando tamponi di cotone, avvolgerli con una garza inumidita sterile e coprirli con un sacchetto di plastica sterile per un migliore isolamento.
    3. Inserire divaricatori o clip nelle cartelle della parete addominale sinistra e destra per mantenere il muscolo peritoneale da parte e l'addome aperto, per ottenere un accesso e una visibilità ottimali dell'utero e dei vasi associati. Fissare le clip/riavvolgitori con dei nastri.
    4. Applicare soluzione salina preriscaldata per mantenere umida la zona chirurgica e l'intestino ed evitare l'essiccazione dei visceri.
  3. Eseguire un'isterectomia con dissezione e mobilizzazione del terzo superiore della vagina dal retto e dalla vescica.
    1. Cauterizzare la microvascolarizzazione intorno all'utero, alla cervice e alla vagina. Tagliare e separare l'utero dalle strutture circostanti vicino all'organo per proteggere la microcircolazione del sinistro uterino.
    2. Rimuovere il tessuto adiposo dall'ambiente circostante.
    3. Amputare il corno sinistro mediante cauterizzazione. Sul lato destro, conservare un segmento di 7-8 mm della parte superiore dell'utero per la successiva anastomosi all'innesto uterino.
  4. Eseguire il trapianto di utero.
    1. Mobilitare e separare i giusti vasi iliaci comuni, dall'origine dei vasi uterini fino alla biforcazione aortica/cavale.
    2. Posizionare l'innesto nella cavità addominale. Avvolgere l'innesto in una garza imbevuta di soluzione di conservazione dell'organo freddo.
      NOTA: L'innesto deve essere mantenuto freddo durante l'anastomosi.
    3. Posizionare morsetti vascolari atraumatici sulla vena iliaca comune destra su ciascun lato, inquadrando il futuro sito di anastomosi.
      NOTA: Abbassare l'anestesia a 1-1,5 vol% isoflurano per adattarsi all'improvvisa diminuzione del precarico cardiaco e alla conseguente ipotensione.
    4. Tagliare una fessura leggermente più grande dell'apertura della vena dell'innesto nella vena iliaca comune.
    5. Posizionare la vena dell'innesto.
    6. Posizionare una sutura di sospensione (poliammide 10/0; vedi Tabella dei materiali) in ciascun angolo della fessura sulla vena iliaca comune destra.
      NOTA: Tenere il nodo di sutura allentato nell'angolo caudale per una migliore regolazione e per evitare effetti di corde della borsa.
    7. Lavare regolarmente l'area di anastomosi con RHX raffreddato durante la procedura per prevenire trombosi.
    8. Anastomosi un lato della vena dell'innesto nella vena del ricevente con sei-otto anelli di una sutura continua (Figura 1).
      NOTA: Iniziare con la sutura cranica (poliammide 10/0) e prima anastomizzare la parte in entrata dei vasi.
    9. Anastomosi l'altro lato della nave allo stesso modo, questa volta partendo dall'esterno.
    10. Legare un nodo alla sutura cranica, e poi uno alla sutura di soggiorno caudale (poliammide 10/0), dopo aver terminato le anastomosi su entrambi i lati.
      NOTA: Stringere le suture continue solo quanto necessario per evitare effetti di corda della borsa.
    11. Posizionare morsetti vascolari atraumatici sull'arteria iliaca comune destra su ciascun lato, inquadrando il futuro sito di anastomosi.
    12. Eseguire l'anastomosi arteriosa (arteria iliaca comune destra [RCIA] tramite 8-10 anelli utilizzando suture interrotte (poliammide 10/0).
      NOTA: Le suture interrotte sono più facili da controllare rispetto a quelle continue (opzionali con la tecnica "bocca di pesce")18. Il lavaggio costante dell'area di anastomosi con RHX raffreddato durante la procedura aiuta a prevenire le trombosi. Quando si utilizzano suture continue, eseguire questo passaggio analogo all'anastomosi venosa.
  5. Eseguire la riperfusione dell'innesto.
    1. Quando entrambi i siti di anastomosi appaiono evidenti e qualsiasi sanguinamento viene fermato, rilasciare i morsetti vascolari sui vasi dell'innesto (Figura 2).
    2. Ispezionare l'innesto per segni di riperfusione, come arrossamento, riempimento della vena o pulsazione nell'arteria dell'innesto.
    3. Collegare il bracciale vaginale del trapianto alla volta vaginale della ricevente utilizzando da sei a sette suture interrotte intraluminali (poliglactina 6/0).
      NOTA: Iniziare con una singola sutura a ore 12 e posizionare prima quelle successive nelle posizioni a ore 10 e 1. Le due suture a ore 9 e 3 dovrebbero essere legate dopo le suture in prima fila19,20.
    4. Anastomosi il corno uterino dell'innesto end-to-end al segmento uterino cranico rimanente dell'utero ricevente utilizzando da cinque a sette suture interrotte (poliammide 7/0).
      NOTA: Non cucire attraverso il lume.
  6. Chiudere l'addome con una sutura continua. Utilizzare poliglactina 4/0 per suturare lo strato muscolare e poliammide 6/0 o clip per ferite chirurgiche per la pelle.
  7. Lascia che l'animale si riprenda in una gabbia riscaldata una volta completato il trapianto. Rimanere con l'animale fino a quando non ha riacquistato la capacità di sdraiarsi sternale e mantenere un alloggiamento singolo fino al suo completo recupero. Fornire un trattamento di analgesia psotopertativa somministrando per via sottocutanea buprenorfina (0,05 mg/kg) e FANS adatti, tuttavia non prima di 4-8 ore dopo la prima dose di anestesia. Fornire continuamente buprenorfina attraverso l'acqua potabile (1 mg/kg, orale, 5 mL di buprenorfina in 160 mL di acqua potabile (0,3 mg/ml)) per tre giorni dopo l'intervento.
  8. La sutura della pelle viene rimossa 10-14 giorni dopo la sicurezza.

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Risultati

Vengono presentati i risultati di due gruppi di ratti. UTx è stato effettuato prima (gruppo 1, n = 8) e dopo (gruppo 2, n = 8) aggiustamento del protocollo (Tabella 1) per dimostrare gli effetti delle nostre modifiche (si veda la Discussione per una spiegazione delle nostre modifiche)12,15,21.

L'esito dell'UTx del ratto è associato a tre fasi chiave. La prima fase è i...

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Discussione

Il protocollo qui presentato offre istruzioni dettagliate per l'approccio chirurgico alla base del trapianto di utero nei ratti. Il protocollo è stato ottimizzato per aumentare le probabilità di nascite vive dopo UTx e successivo accoppiamento. Il protocollo originale è stato ripreso dal gruppo Brännström 12,13, ispirato al lavoro sui topi di Akouri et al.10, e modificato in base alle esperienze degli autori negli ultimi anni. In quanto ta...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (sovvenzione del progetto n. 310030_192736). Ringraziamo la dottoressa Frauke Seehusen dell'Istituto di patologia veterinaria dell'Università di Zurigo per il suo sostegno istopatologico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Forbice angolata su laterale 5 mmF.S.T15008-08
Graffetta grandeNo specificoUsato come divaricatore
Ago per piega smussata G30Unimed S.A.
Bupivacaina 0,5%Sintetica
Buprenorfina 0,3 mg/mLTemgesic
Dosiernadel G25H.SIGRIST& PARTNER AG
Dumont #5SF PinzeF.S.T11252-00
Ethilon 10/0Ethicon2810G
Ethilon 6/0Ethicon667H
Ethilon 7/0EthiconEH7446H
Ethilon 8/0Ethicon2808G
Femal Brown Norway Rats (150-170 g)Janvier
Ratti Lewis femmina (150-170 g)Charles River Deutschland
Forbici fini - SharpF.S.T14060-09Qualsiasi altra piccola forbice funziona troppo
Halsey Micro Needle HolderF.S.T12500-12Qualsiasi altro piccolo needholder funziona troppo
Heparin Natrium 25000 I.E./ 5 mLB. Braun
Institute Georges Lopez Perfusion Solution ( IGL)Institute Georges LopezSoluzione per la conservazione degli organi   
Ratti Lewis maschi (300-320 g)Charles River Deutschland
Micro Serrefines 13 mmF.S.T18055-04   
Micro Serrefines 16 mm gebogenF.S.T18055-06
Micro-Serrefine Applicatore a morsetto con serratura   F.S.T18056-14   
Mö lnlyncke Op asciugamanoMö lnlyncke800300Telo sterile
NaCl 0,9%B.Braun
OcteniseptSchü lke
Nastro di cartaTesaPer fissare l'animale
Philips Avent Schneller Flaschenwä rmer SCF358/02Philips12824216
RingerfundinB.Braun
Rompun 2%BayerXylazine
Portaaghi con manico rotondoF.S.T12075-12
Portaaghi con manico rotondoFST12075-12
S & Pinza dilatatrice per vasi a T - Angolata 45 gradiF.S.T00276-13
Sacryl NahtKRUUSE152575
Scapel No 10Swann Morton201
Small Histo-ContainerQualsiasi piccolo histo-container
Piccoli sacchetti di plastica Plastik Qualsiasisacchetto di plastica trasparente va bene
Steril Cotton fiocLohmann-RauscherQualsiasi batuffolo di cotone sterillo va bene
Garza sterileLohmann-RauscherQualsiasi garza sterile va bene
Forbice dritta 8mmF.S.T15024-10
Microscopio operatorio - ndash; SZX9OlympusOLY-SZX9-B
Sutter Antiaderente GLISS 0,4 mmSutter78 01 69 SLS
Pinza per legatura di sutura F.S.T00272-13
Tappetino riscaldante ThermoLuxtessuti ThermoLux
per pelleTutte le pinze per tessuti vanno bene
Pinze per dilatatori per vasiF.S.T00125-11
Vicryl più 4/0EthiconVCP292H
funziona bene per la conservazione a freddo dell'innesto Pinze per

Riferimenti

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