Rapido sviluppo di circuiti di identificazione dello stato cellulare con poli-trasfezione

Summary

I circuiti genetici complessi richiedono molto tempo per progettare, testare e ottimizzare. Per facilitare questo processo, le cellule di mammifero vengono trasfettate in modo da consentire il test di più stechiometrie di componenti del circuito in un singolo pozzetto. Questo protocollo delinea le fasi per la pianificazione sperimentale, la trasfezione e l'analisi dei dati.

Abstract

I circuiti genetici dei mammiferi hanno dimostrato il potenziale per rilevare e trattare una vasta gamma di stati patologici, ma l'ottimizzazione dei livelli dei componenti del circuito rimane impegnativa e laboriosa. Per accelerare questo processo, il nostro laboratorio ha sviluppato la poli-trasfezione, un'estensione ad alto rendimento della trasfezione tradizionale dei mammiferi. Nella poli-trasfezione, ogni cellula della popolazione trasfettata esegue essenzialmente un esperimento diverso, testando il comportamento del circuito a diversi numeri di copie del DNA e consentendo agli utenti di analizzare un gran numero di stechiometrie in una reazione single-pot. Finora sono state dimostrate poli-trasfezioni che ottimizzano i rapporti di circuiti a tre componenti in un singolo pozzetto di cellule; In linea di principio, lo stesso metodo può essere utilizzato per lo sviluppo di circuiti ancora più grandi. I risultati della poli-trasfezione possono essere facilmente applicati per trovare rapporti ottimali tra DNA e co-transfettazione per circuiti transitori o per scegliere livelli di espressione per componenti circuitali per la generazione di linee cellulari stabili.

Qui, dimostriamo l'uso della poli-trasfezione per ottimizzare un circuito a tre componenti. Il protocollo inizia con i principi di progettazione sperimentale e spiega come la poli-trasfezione si basa sui tradizionali metodi di co-trasfezione. Successivamente, viene eseguita la poli-trasfezione delle cellule e seguita dalla citometria a flusso pochi giorni dopo. Infine, i dati vengono analizzati esaminando fette dei dati di citometria a flusso a singola cellula che corrispondono a sottoinsiemi di cellule con determinati rapporti componenti. In laboratorio, la poli-trasfezione è stata utilizzata per ottimizzare classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward, motivi bistabili e molti altri. Questo metodo semplice ma potente accelera i cicli di progettazione per circuiti genetici complessi nelle cellule di mammifero.

Introduction

Il campo della biologia sintetica dei mammiferi è progredito rapidamente, dallo sviluppo di semplici parti senso-e-risposta in linee cellulari in coltura all'ottimizzazione di reti complesse di geni per affrontare le sfide del mondo reale nella diagnostica e nella terapia¹. Questi sofisticati circuiti sono in grado di rilevare input biologici dai profili di microRNA alle citochine ai farmaci a piccole molecole e di implementare circuiti di elaborazione logica tra cui transistor, filtri passa-banda, interruttori a levetta e oscillatori. Hanno anche mostrato risultati promettenti in modelli animali di malattie come cancro, artrite, diabete e molt....

Protocol

NOTA: la Tabella 1 e la Tabella 2 fungono da riferimenti significativi per questo protocollo. La Tabella 1 mostra il ridimensionamento del reagente per le reazioni, e la Tabella 2 mostra l'aritmetica del rapporto DNA per un esempio di poli-trasfezione descritta nel protocollo (metà superiore) e per un possibile esperimento di follow-up (metà inferiore).

1. Preparare le cellule per la trasfezione

1. Assicurarsi che la coltura di cellule di rene embrionale umano (HEK293) sia confluente al 60% -80% prima di iniziare il protocollo. Per fare questo, semin....

Results

Nella Figura 1, confrontiamo la co-trasfezione con la poli-trasfezione. In una co-trasfezione, tutti i plasmidi vengono consegnati nello stesso mix di trasfezione, con conseguente alta correlazione tra la quantità di ciascun plasmide che ogni singola cellula riceve (Figura 1A). Mentre il numero di plasmidi totali consegnati a ciascuna cellula varia in modo significativo, la fluorescenza delle due proteine reporter nelle singole cellule in tutta la popolazione è .......

Discussion

I metodi di prototipazione rapida come la progettazione assistita da computer (CAD), il breadboard e la stampa 3D hanno rivoluzionato le discipline meccaniche, elettriche e di ingegneria civile. La capacità di cercare rapidamente tra molte possibili soluzioni a una determinata sfida accelera notevolmente i progressi in un campo. Riteniamo che la poli-trasfezione sia una tecnologia analoga per l'ingegneria biologica, che consente la prototipazione rapida dei circuiti genetici. Inoltre, altre tecnologie di prototipazione r.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette coniche Corning Falcon da 15 ml	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Piastra di Petri a 24 pozzetti	Qualsiasi azienda di scelta		(non pirogena, sterile, RNasi, DNasi, DNA e pirogeno)
Albumina sierica bovina	NEB	B9000S
Centrifuga	Qualsiasi azienda di scelta		In grado di esporre provette Falcon da 15 ml a 300 rcf
Contacellule automatizzato Countess 3	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Conta le cellule Slide ThermoFisher	Scientific	C10228
Cytoflow	Pacchetto		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Utilizzare il terreno corretto per il tipo di cella
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Siero fetale bovino	Sigma Aldrich	F4135
Cellule HEK	ATCC	CRL-1573	Usa il tipo di cellula pertinente per i tuoi esperimenti. Le cellule HEK tendono a trasfettare in modo molto efficiente.
Cellule HeLa	ATCC	CRL-12401	Usa il tipo di cellula pertinente per i tuoi esperimenti.
Potenziatore di lipofectamina 3000 e P3000	ThermoFisher Scientific	L3000001	Utilizzare il reagente corretto per il proprio tipo di cellula; reagente di trasfezione e potenziatore
LSRConcitometro a flusso a flusso BD	Biosciences	N/A
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali	Gibco	11140050
Provette per microcentrifuga, 1,5 mL	Qualsiasi azienda di scelta
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific 31985070		siero ridotto Terreno
salino tamponato con fosfati	ThermoFisher Scientific	70011044
Perle di calibrazione Rainbow	Spherotech	URCP-100-2H
Azoturo di sodio	Sigma Aldrich	S2002
Tripsina	VWR	25-053-CI