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Articolo metodologico

Istituzione e coltura di organoidi mammari derivati da pazienti

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⸱

DOI:

10.3791/64889

⸱

17 febbraio 2023

 ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2Genetics Graduate Program, Stony Brook University

In questo articolo

Sommario

Qui viene fornito un protocollo dettagliato per stabilire organoidi mammari umani da resezioni di tumore al seno derivate da pazienti o tessuto mammario normale. Il protocollo fornisce istruzioni dettagliate complete per la coltivazione, il congelamento e lo scongelamento degli organoidi mammari derivati dal paziente umano.

Abstract

Il cancro al seno è una malattia complessa che è stata classificata in diversi sottotipi istologici e molecolari. Gli organoidi del tumore mammario derivati dal paziente sviluppati nel nostro laboratorio consistono in un mix di più popolazioni cellulari derivate dal tumore e rappresentano quindi una migliore approssimazione della diversità e dell'ambiente delle cellule tumorali rispetto alle linee cellulari tumorali 2D stabilite. Gli organoidi fungono da modello ideale in vitro , consentendo interazioni cellula-matrice extracellulare, note per svolgere un ruolo importante nelle interazioni cellula-cellula e nella progressione del cancro. Gli organoidi derivati dal paziente hanno anche vantaggi rispetto ai modelli murini in quanto sono di origine umana. Inoltre, hanno dimostrato di ricapitolare l'eterogeneità genomica, trascrittomica e metabolica dei tumori dei pazienti; Pertanto, sono in grado di rappresentare la complessità del tumore e la diversità del paziente. Di conseguenza, sono pronti a fornire informazioni più accurate sulla scoperta e la convalida del target e sui saggi di sensibilità ai farmaci. In questo protocollo, forniamo una dimostrazione dettagliata di come gli organoidi mammari derivati dal paziente sono stabiliti da tumori al seno resecati (organoidi tumorali) o tessuto mammario derivato da mammoplastica riduttiva (organoidi normali). Questo è seguito da un resoconto completo della coltura di organoidi 3D, dell'espansione, del passaggio, del congelamento e dello scongelamento delle colture di organoidi mammari derivate dal paziente.

Introduzione

Il cancro al seno (BC) è il tumore maligno più comune nelle donne, con 287.850 nuovi casi stimati per essere diagnosticati negli Stati Uniti nel 20221. Nonostante i recenti progressi nella diagnosi precoce con screening annuali, terapie mirate e una migliore comprensione della predisposizione genetica, prevale per essere la seconda causa di morte per cancro nelle donne negli Stati Uniti, con > 40.000 decessi attribuiti al cancro al seno ogni anno1. Il cancro al seno è attualmente classificato in più sottotipi sulla base della valutazione istopatologica e molecolare del tumore primario. Una migliore stratificazione dei sottotipi ha migliorato gli esiti dei pazienti con opzioni di trattamento specifiche per sottotipo2. Ad esempio, l'identificazione di HER2 come proto-oncogene3 ha portato allo sviluppo di Trastuzumab, che ha reso questo sottotipo altamente aggressivo gestibile nella maggior parte dei pazienti4. Ulteriori ricerche sulla genetica e la trascrittomica di questa complessa malattia in modo specifico per il paziente aiuteranno a sviluppare e prevedere migliori regimi di trattamento personalizzati specifici per il paziente 2,5. Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) sono un nuovo modello promettente per ottenere informazioni sul cancro a livello molecolare, identificando nuovi bersagli o biomarcatori e progettando nuove strategie di trattamento 6,7,8.

Le DOP sono strutture multicellulari, tridimensionali (3D) derivate da campioni di tessuto primario appena resecati 8,9. Sono coltivati tridimensionalmente essendo incorporati in una matrice di idrogel, tipicamente composta da una combinazione di proteine della matrice extracellulare (ECM), e quindi possono essere utilizzati per studiare le interazioni cellula tumorale-ECM. Le DOP rappresentano la diversità dei pazienti e ricapitolano l'eterogeneità cellulare e le caratteristiche genetiche del tumore10,11,12. Essendo modelli in vitro, consentono la manipolazione genetica e screening farmacologici ad alto rendimento13,14,15. Inoltre, le PDO possono essere plausibilmente utilizzate per valutare la sensibilità ai farmaci del paziente e le strategie di trattamento in parallelo alla clinica e aiutare a prevedere gli esiti dei pazienti16,17,18. Oltre alla chemioterapia, alcuni modelli organoidi sono stati utilizzati anche per esaminare le risposte individuali dei pazienti alla chemioradioterapia19,20. Data la promettente applicabilità delle DOP per la ricerca e l'uso clinico, il National Cancer Institute ha avviato un consorzio internazionale, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, per generare e fornire questi nuovi modelli di cancro derivati dal tumore. Molti dei modelli organoidi di vari tipi di cancro sviluppati attraverso l'HCMI sono disponibili tramite l'American Type Culture Collection (ATCC)22.

È stato dimostrato che gli organoidi mammari normali sono composti da diverse popolazioni di cellule epiteliali presenti nella ghiandola mammaria 11,23 e quindi servono come grandi modelli per studiare i processi biologici di base, per analizzare le mutazioni driver che causano la tumorigenesi eper gli studi sulla linea delle cellule tumorali 6,15 . I modelli di organoidi del tumore al seno sono stati utilizzati per identificare nuovi bersagli che stanno incoraggiando le prospettive per lo sviluppo di nuove terapie, in particolare per i tumori resistenti24,25,26. Utilizzando modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e organoidi derivati da PDX (PDxO) abbinati di tumori al seno resistenti al trattamento, Guillen et al. hanno dimostrato che gli organoidi sono potenti modelli per la medicina di precisione, che possono essere sfruttati per valutare le risposte ai farmaci e indirizzare le decisioni terapeutiche parallelamente28. Inoltre, lo sviluppo di nuovi metodi di co-coltura per la coltura di DOP con varie cellule immunitarie27,28,29, fibroblasti 30,31 e microbi 32,33 offre l'opportunità di studiare l'impatto del microambiente tumorale sulla progressione del cancro. Mentre molti di questi metodi di co-coltura sono attivamente stabiliti per le DOP derivate da tumori pancreatici o del colon-retto, simili metodi di co-coltura stabiliti per le DOP mammarie sono stati riportati solo per le cellule natural killer34 e i fibroblasti35.

La prima biobanca di >100 organoidi derivati da pazienti che rappresentano diversi sottotipi di cancro al seno è stata sviluppata dal gruppo Hans Clevers36,37. Come parte di questo sforzo, il gruppo Clevers ha anche sviluppato il primo terreno di coltura complesso per la crescita degli organoidi mammari, che è attualmente ampiamente utilizzato36. Uno studio di follow-up ha fornito un resoconto completo della creazione e della cultura delle DOP mammarie e degli xenotrapianti organoidi derivati dal paziente (PDOX)38. Il laboratorio Welm ha sviluppato una vasta collezione di modelli BC PDX e PDxO che sono coltivati in un mezzo di crescita relativamente più semplice contenente siero bovino fetale (FBS) e meno fattori di crescita39,40. Abbiamo sviluppato e caratterizzato in modo indipendente una vasta gamma di modelli di organoidi di carcinoma mammario naïve derivati da pazienti11 e abbiamo partecipato allo sviluppo di modelli BC DOP come parte dell'iniziativa HCMI21. Qui, miriamo a fornire una guida pratica che descriva in dettaglio la metodologia da noi impiegata nella generazione di sistemi modello di organoidi mammari derivati dal paziente.

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Protocollo

Le resezioni tumorali di pazienti con cancro al seno, insieme al tessuto normale distale e adiacente, sono state ottenute da Northwell Health in conformità con i protocolli dell'Institutional Review Board IRB-03-012 e IRB 20-0150 e con il consenso informato scritto delle pazienti.

NOTA: Tutte le procedure menzionate di seguito sono state eseguite in una sala BSL2 per la coltura di tessuti di mammiferi designata per i campioni dei pazienti previa approvazione del comitato di biosicurezza. Tutte le procedure devono essere eseguite seguendo i protocolli di sicurezza che mantengono le condizioni asettiche negli armadi di biosicurezza. Ogni fase di centrifugazione viene eseguita a temperatura ambiente (RT), salvo diversa indicazione. I tessuti / organoidi e le scorte di matrice della membrana basale sono sempre posti sul ghiaccio, salvo diversa indicazione. Le nuove piastre vengono incubate durante la notte per il preriscaldamento. La placcatura delle cupole su piastre preriscaldate garantisce i migliori risultati per ottenere cupole arrotondate che non si appiattiscono durante la placcatura o il sollevamento successivo dalla superficie della piastra.

1. Preparazione media e ricette

  1. Preparare i mezzi condizionati da R-spondina1 come descritto di seguito (in alternativa può essere acquistato commercialmente).
    1. Preparare due substrati di coltivazione separati composti dal terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM), 10% FBS, 5% penicillina-streptomicina e con o senza 300 μg / mL di supplementazione di zeocina.
    2. Scongelare una fiala di cellule HEK293T-HA-Rspondin1-Fc (ottenute dal laboratorio di Calvin Kuo alla Stanford University e disponibili anche in commercio) in un matraccio di coltura tissutale da 75 cm2 con 15 ml di terreno.
    3. Dividere le cellule in 2 palloni di coltura da 175 cm2 , ciascuno con 35 ml di terreno contenente zeocina.
    4. Far passare nuovamente le cellule per ottenere tutti i palloni necessari per generare il lotto desiderato di mezzo condizionato da R-spondina1. Utilizzare il terreno di coltura senza zeocin.
    5. Quando i matraccio contenenti terreno senza zeocin sono confluenti, rimuovere e sostituire il substrato di coltivazione con Ad-DF+++ (punto 1.2; Tabella 1). Mettere le celle in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per 1 settimana.
    6. Ruotare il mezzo a 400 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali celle non attaccate. Filtrare il fluido attraverso un filtro da 0,22 μm. Preparare 25 ml di aliquote e conservarle a -20 °C (possono essere conservate fino a 6 mesi).
    7. Utilizzando cellule HEK293T, eseguire un doppio test TOPFLASH41,42 della luciferasi utilizzando un reagente commerciale di trasfezione del DNA con un rapporto reagente 4,8: 1 / DNA con il diluente DMEM (alto glucosio, piruvato). Aggiungere 100 μL di terreno condizionato R-spondina1 (o mezzo basale per il controllo negativo) a 100 μL di cellule trasfettate. Quindi, eseguire il doppio test della luciferasi secondo il protocollo del produttore per verificare l'attività Wnt del mezzo condizionato R-spondina1.
      NOTA: Il test utilizza un plasmide TOP con lettura dell'attività della luciferasi Firefly e il plasmide FOP viene utilizzato come controllo negativo.
  2. Preparare il mezzo basale (Ad-DF+++ medium, come precedentemente pubblicato da Sachs et al.36).
    ReagenteConcentrazione delle scorteConcentrazione finale
    DMEM/F12 avanzato1x1x
    GlutaMax100x1x
    HEPES1 m10 mM
    Penicillina-streptomicina10.000 U/ml; 10.000 μg/ml100 U/ml; 100 μg/mL

    Tabella 1: Composizione media Ad-DF+++ basale.
  3. Preparare il mezzo completo per organoidi mammari derivati dal paziente come precedentemente pubblicato da Sachs et al.36.
    ReagenteConcentrazione delle scorteConcentrazione finale
    Ad-DF+++ medio1x1x
    R-spondin in-house100%10%
    Supplemento B-2750x1x
    Nicotinammide1 m5 mM
    NAC500 mM1,25 mM
    Primocina50 mg/ml50 μg/mL
    Zucca100 μg/mL100 ng/mL
    FEG umano5 μg/mL5 ng/mL
    Heregulin umano β1/Neuregulin175 μg/mL37,5 ng/mL
    Y-27632 Dicloridrato (Rho-chinasi)100 mM5 μM
    A83-015 mM500 nM
    FGF-7 umano100 μg/mL5 ng/mL
    FGF-10 umano1 mg/ml20 ng/mL
    P38I30 mM498 nM

    Tabella 2: Composizione completa del terreno per organoidi mammari derivati da pazienti.
  4. Preparare 2 mg/mL di soluzione di collagenasi IV pesando la quantità necessaria di collagenasi IV in polvere e solubilizzandola in mezzo basale Ad-DF+++. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm prima dell'uso.
  5. Preparare una soluzione di albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA) da una soluzione madre al 7,5% utilizzando 1x soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) come diluente. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm prima dell'uso.

2. Stabilire il tumore al seno/organoidi normali dal tessuto resecato (Figura 1)

  1. Trasportare un tumore al seno resecato chirurgicamente / campione di tessuto normale in laboratorio in un tubo conico da 50 mL contenente Ad-DF ++ +. Conservare il tubo sul ghiaccio fino all'inizio dell'isolamento.
  2. Scongelare una bottiglia di matrice di membrana basale sul ghiaccio o per una notte a 4 °C.
  3. Trasferire il tessuto resecato in una capsula di Petri sterile di 10 cm. Esaminare il tessuto macroscopicamente e prendere nota se appare morfologicamente grasso, vascolarizzato o necrotico. Inoltre, registrare le dimensioni e la forma del tessuto. Idealmente, scattare una foto del tessuto con un righello in vista (Figura 2).
  4. Tritare il tessuto in pezzi molto piccoli (~ 1 mm3) con un bisturi sterile n. 10 e trasferirlo in un tubo conico da 50 ml.
  5. Aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi IV da 2 mg/ml e sigillare il tubo con una pellicola trasparente. Posizionare il tubo su un agitatore orbitale a 37 °C a 140 giri/min per 30-90 minuti in posizione angolata (angolo ~30°).
  6. Durante l'incubazione, porre un'aliquota di terreno completo per preriscaldare in un bagnomaria a 37 °C.
  7. Ogni 15 minuti, risospendere il tessuto mescolando su e giù vigorosamente usando una pipetta sierologica sterile da 5 ml. Pre-rivestire la pipetta con una soluzione di BSA allo 0,5% per evitare la perdita di tessuto causata dall'adesione del campione alla pipetta. Monitorare la dissociazione nel tempo osservando il tubo conico al microscopio con un ingrandimento 5x o superiore.
  8. Una volta dissociato il tessuto, centrifugare a 400 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante, aggiungere 10 mL di Ad-DF+++ e centrifugare a 400 x g per 5 minuti.
  9. Scartare il surnatante con attenzione. I pellet di tessuto possono occasionalmente essere sciolti, quindi fai attenzione quando si aspira. Ripetere il passaggio ancora una volta.
  10. Se il pellet di tessuto è parzialmente rosso, aggiungere 2 ml di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Non incubare più a lungo, in quanto ciò ridurrà significativamente la vitalità cellulare.
  11. Aggiungere 10 mL di Ad-DF+++ alla provetta, centrifugare a 400 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 50-300 μL di matrice di membrana basale fredda non diluita e miscelare mediante pipettaggio accurato per evitare la formazione di bolle.
    NOTA: Il volume della matrice della membrana basale aggiunta dipende dalla dimensione del pellet. Se non si è sicuri, placcare una piccola cupola di ~ 10 μL dal pellet risospeso e osservare la confluenza al microscopio. Regolare aggiungendo più matrice di membrana basale, se necessario. Fare riferimento alla Figura 3 (immagine del giorno 1) per una densità di semina di riferimento.
  12. Piastra 300 μL di cupola a matrice di membrana basale contenente organoidi in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale preriscaldata, etichettata, a 6 pozzetti. Fare riferimento alla Tabella 3 per la matrice della membrana basale raccomandata e i volumi medi se si utilizzano piastre diverse.
    Numero di pozzi per piastraMatrice della membrana basale per cupola (μL)Mezzo per pozzetto (μL)
    63003000
    121001000
    2450500
    4825250
    9610 (sospensione al posto della cupola)100

    Tabella 3: Quantità di matrice della membrana basale e terreno di crescita raccomandata per pozzetto in base alle dimensioni della piastra.
  13. Lasciare la piastra indisturbata nella cappa per 5 minuti e quindi posizionare con cura nell'incubatore a 37 °C per 20-30 minuti affinché la cupola della matrice della membrana basale si solidifichi completamente.
  14. Aggiungere 3 ml di mezzo completo preriscaldato a goccia a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e collocare nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. Scatta immagini degli organoidi usando un obiettivo 5x su un microscopio a campo luminoso invertito.
  15. Ricostituire il mezzo ogni 4-8 giorni in base alla crescita degli organoidi. Aspirare con cura il vecchio mezzo senza disturbare la cupola e aggiungere un mezzo fresco e preriscaldato a goccia.
    NOTA: Il protocollo è lo stesso per stabilire organoidi di cancro al seno derivati dal tumore resecato e per organoidi normali derivati da tessuto mammario sano resecato (sia da tessuto mammario adiacente e normale della stessa paziente o tessuto mammario sano ottenuto da un intervento di mammoplastica riduttiva).

3. Passare ed espandere gli organoidi mammari derivati dal paziente in coltura

  1. Scongelare una bottiglia di matrice di membrana basale sul ghiaccio o per una notte a 4 °C.
  2. Sollevare la cupola della matrice della membrana basale nel mezzo nel pozzetto utilizzando un raschietto cellulare o una punta per pipetta da 1 ml.
  3. Pre-rivestire la punta della pipetta con soluzione di BSA allo 0,5% e quindi trasferire la cupola galleggiante degli organoidi con un mezzo a un tubo conico da 15 ml o 50 ml, a seconda del numero di pozzetti raccolti. Per più di due pozzetti contenenti 300 μL di cupole a matrice di membrana basale, utilizzare un tubo conico da 50 ml. Aggiungere 1x DPBS per aumentare il volume ad almeno 5 ml.
  4. Girare i tubi a 400 x g per 5 minuti. La matrice della membrana basale con organoidi forma uno strato nella parte inferiore. Aspirare con attenzione per rimuovere il surnatante.
  5. Aggiungere 5-20 ml di 1x DPBS, a seconda del numero di pozzetti raggruppati in un tubo. Pre-rivestire una pipetta monouso sterile con BSA allo 0,5% e mescolare uniformemente il pellet della matrice della membrana organoide-basale in DPBS mediante pipettaggio su e giù.
  6. Girare i tubi a 400 x g per 5 minuti. Aspirare con cautela e scartare il surnatante.
  7. Aggiungere il reagente di dissociazione cellulare a tre volte il volume della matrice della membrana basale al tubo. Utilizzando una punta per pipetta rivestita di BSA allo 0,5%, risospendere gli organoidi nel reagente di dissociazione cellulare.
  8. Posizionare il tubo su un agitatore orbitale a 37 °C a 140 giri/min per 8-15 minuti in posizione angolata. Monitorare il tubo osservandolo al microscopio ogni 5 minuti per assicurarsi che gli organoidi siano suddivisi in gruppi più piccoli.
  9. Aggiungere il mezzo basale (cioè Ad-DF+++) ad un volume uguale o superiore al reagente di dissociazione cellulare e pipettare per miscelare gli organoidi. Girare a 400 x g per 5 minuti a RT per ottenere un pellet organoide.
  10. Se il pellet contiene organoidi ancora incorporati nella matrice della membrana basale non disciolta, ripetere i passaggi 3,7-3,9 per ulteriori 5-8 minuti di tripsinizzazione.
  11. Una volta ottenuto un pellet organoide bianco senza matrice di membrana basale non disciolta, scartare il surnatante e aggiungere 1 mL di Ad-DF+++ per risospendere il pellet mediante pipettaggio. Quindi aggiungere più Ad-DF+++ fino a 10 ml.
  12. Girare a 400 x g per 5 minuti a RT per la fase di lavaggio. Aspirare e scartare il surnatante.
  13. Aggiungere la quantità richiesta di matrice di membrana basale agli organoidi digeriti in base al rapporto di divisione appropriato (questo varierà ampiamente per ogni linea organoide in base al tasso di crescita). Fare riferimento alla Figura 3 (immagine del giorno 1) per un esempio di densità di semina. Mescolare pipettando delicatamente su e giù per evitare di creare bolle. Mettere immediatamente sul ghiaccio.
  14. Aprire ed etichettare una piastra a 6 pozzetti preriscaldata. Si consiglia di placcare una cupola da 10-20 μL nell'angolo di un pozzo per osservare la confluenza al microscopio. Se gli organoidi sono confluenti, è possibile aggiungere più matrice di membrana basale per aumentare il rapporto di divisione.
  15. Cupole di organoidi da 300 μL risospese nella matrice della membrana basale. Assicurarsi di mantenere il tubo sul ghiaccio mentre si placcano più pozzetti in modo che la matrice della membrana basale rimanga in soluzione.
  16. Lasciare la piastra indisturbata nella cappa per 5 minuti e poi posizionare con cura in un'incubatrice a 37 °C con CO2 al 5% senza disturbare le cupole.
  17. Dopo 20-30 minuti, le cupole si solidificano. Aggiungere 3 ml di mezzo completo preriscaldato a ciascun pozzetto e riposizionare la piastra nell'incubatore. Aggiungere un mezzo completo fresco ogni 5-7 giorni. Eseguire test di routine delle colture per rilevare la contaminazione da micoplasma.
    NOTA: Il protocollo per la coltura dei tumori al seno e degli organoidi normali è lo stesso. Tuttavia, nella nostra esperienza, gli organoidi normali tendono a crescere bene fino al passaggio 6-8 prima di rallentare. Si consiglia di effettuare il maggior numero possibile di scorte di passaggio precoce per la ricerca futura.

4. Congelamento di organoidi mammari derivati da pazienti

  1. Far passare pozzetti confluenti di organoidi per rimuovere qualsiasi matrice di membrana basale, come indicato nei passaggi 3.1-3.12.
  2. Risospendere il pellet di organoidi in mezzo di congelamento cellulare (scongelato durante la notte a 4 ºC) con 1 ml di terreno per 200-300 μL di volume della matrice della membrana basale prima del passaggio. Eseguire un conteggio delle celle prima del congelamento per riferimento. Aliquot un piccolo volume (almeno 100 μL) di cellule da sottoporre a ulteriore tripsinizzazione, se necessario, per ottenere singole cellule, e quindi contarle usando una macchina contatore di cellule.
  3. Trasferire 1 mL di cellule in 2 mL di crioviali etichettati con numero di linea organoide, data e numero di passaggio. Assicurati di etichettare i tubi con un pennarello permanente o utilizzare crioetichette.
  4. Spostare i flaconcini in un contenitore di congelamento cellulare e trasferire il contenitore in un congelatore a -80 °C. Dopo l'incubazione durante la notte, le fiale sono pronte per essere spostate in un congelatore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

5. Scongelamento degli organoidi mammari derivati dal paziente

  1. Scongelare una bottiglia di matrice di membrana basale sul ghiaccio o per una notte a 4 °C. Mezzo Ad-DF+++ pre-caldo a 37 °C. Aliquote 9 mL di mezzo preriscaldato in tubi conici da 15 mL per ciascun flaconcino congelato.
  2. Scongelare rapidamente il flaconcino congelato di organoidi ponendolo in un bagno di perline a 37 °C. Spruzzare etanolo al 70% e trasferire il tubo nell'armadio di biosicurezza.
  3. Risciacquare la punta della pipetta con una soluzione BSA allo 0,5% per evitare la perdita di organoidi. Mescolare delicatamente gli organoidi scongelati pipettando su e giù per mescolare eventuali organoidi sedimentati nel tubo.
  4. Trasferire delicatamente 1 mL di organoidi congelati a 9 mL di Ad-DF+++ preriscaldato in senso goccia. Ruotare le cellule a 400 x g per 5 minuti e poi scartare con attenzione il surnatante.
  5. Lavare il pellet aggiungendo 10 ml di Ad-DF+++ fresco preriscaldato al pellet organoide e mescolare delicatamente con una pipetta pre-rivestita con BSA allo 0,5% per risospendere il pellet. Ruotare le cellule a 400 x g per 5 minuti e scartare con attenzione il surnatante.
  6. Posizionare il pellet organoide sul ghiaccio e rimuovere con cautela eventuali residui di Ad-DF+++ utilizzando una punta per pipetta di volume inferiore. Risospendere il pellet in 300 μL di matrice di membrana basale e piastra in una piastra preriscaldata a 6 pozzetti. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
    NOTA: Si consiglia di placcare una piccola cupola da 10 μL dal pellet risospeso in un angolo del pozzetto per discernere la confluenza al microscopio. Se gli organoidi sembrano confluenti, diluire aggiungendo 300 μL di matrice di membrana basale alla piastra in due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti.
  7. Dopo un'incubazione di 20-30 minuti, aggiungere 3 ml di mezzo completo preriscaldato alla cupola solidificata.

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Risultati

Abbiamo creato una biobanca di organoidi di tumore mammario derivati da pazienti che comprende vari sottotipi11. Inoltre, abbiamo stabilito più linee organoidi mammarie normali derivate da campioni di tessuto di mammoplastica riduttiva o da mammelle normali adiacenti / distali da pazienti BC utilizzando l'approccio descritto nella Figura 1.

Le varie linee organoidi di tumore mammario derivate da pazienti differiscono nella loro morfologia (...

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Discussione

Il nostro laboratorio ha impiegato con successo i protocolli di cui sopra per stabilire organoidi da resezioni tumorali naïve o raschiamenti. Abbiamo anche utilizzato questo protocollo per sviluppare organoidi normali da tessuto mammario ottenuto tramite mammoplastica riduttiva o da tessuto mammario normale adiacente o distale di pazienti oncologici. Circa il 30% -40% dei tumori primari resecati ha portato a colture organoidi tumorali di successo a lungo termine (>passaggio 8). Le linee organoidi tumorali che si...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Spector per le discussioni critiche nel corso di questo lavoro. Ringraziamo Norman Sachs e Hans Clevers (Hubrecht Institute, Paesi Bassi) per averci fornito inizialmente il loro protocollo di coltura organoide. Riconosciamo le risorse condivise di istologia e microscopia del CSHL Cancer Center per i servizi e le competenze tecniche (NCI 2P3OCA45508). Ringraziamo il Dr. Qing Gao per l'assistenza nella preparazione del campione istologico. Siamo grati per il supporto della dottoressa Karen Kostroff (Northwell Health) per aver fornito campioni di tumore ai pazienti. Apprezziamo anche gli sforzi del team di Northwell Health Biobanking per l'acquisizione di campioni e ringraziamo i pazienti e le loro famiglie per aver donato tessuti per la ricerca. Questa ricerca è stata supportata da CSHL / Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) e Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson e D.L.S).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
15 mL di provette conicheVWR525-1068
175 cm2 pallone per coltura tissutaleVWR (Corning)29185-308
37 gradi C perlina bagno
37 ° C Incubatore CO2
Millipore SigmaSCGP00525SCGP00525
500 mL Unità Filtrante a Flusso Rapido, 0,2 & micro; Membrana m aPES, diametro 75 mmNalgene566-0020
piastre di coltura a 6 pozzetti Greiner Cellstar82050-842
75 cm2 fiasco per coltura tissutaleVWR (Corning)29185-304
Piastre opache a 96 pozzettiCorning353296Per test CTG
A83-01Tocris2939
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
B-27 supplementoLife Technologies
BioTek Lettore di micropiastre ibrido Synergy H4Fisher Scientific (Agilent)Per il doppio saggio della luciferasi e il saggio CTG
BSA frazione V (7,5%)Reagente Thermo Fisher15260037
Cell Titer-Glo (CTG)PromegaG9683Centrifuga
Eppendorf5804
Collagenasi da Clostridium histolyticumMillipore SigmaC5138Tipo IV
CrioetichetteAmazonDTCR-1000Crio-Tag termici diretti, Bianco, 1,05 x 0,5"
Cryovials Simport Scientific Inc.T311-1
Contatore di cellule automatizzato Countess 3Thermo FisherAMQAX2000
DMEM, alto glucosio, piruvatoThermo Fisher (Gibco)11995040
Sistema di analisi reporter a doppia luciferasiPromegaE1910
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (1X)Gibco14190-144DPBS Fattore di
crescita epidermico (hEGF)PeprotechAF-100-15
Siero fetale bovino (FBS)Corning35-010-CV
FGF-10 (umano)Peprotech100-26
FGF-7/KGF (umano)Peprotech100-19
GlutaMaxLife Technologies
celle HEK293TATCCCRL-3216 Per il test TOPFlash
cellule HEK293T-HA-Rspondina1-FcR& D Systems3710-001-01Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells
HEPESLife Technologies15630-080
Heregulinβ-1 (umano)Peprotech100-03
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (~10 mg/mL di concentrazione proteica)Corning356231Senza rosso fenolo, senza LDEV; matrice della membrana basale
Mr. Frosty Contenitore per il congelamento delle celluleThermo Fisher5100-0001
Kit per il rilevamento del micoplasmaLonzaLT07-418
N-acetil-l-cisteinaMillipore SigmaA9165
Unità filtranti monouso sterili a flusso rapido Nalgene con membrane PESThermo Fisher166-0045 
NicotinamideMillipore SigmaN0636
Noggin (umano)Peprotech120-10C
P1000, P200, P10 pipette con puntali
p38 Inibitore MAPK (p38i) SB 202190Millipore SigmaS7067
Parafilmfilm film trasparente
Penicillina-StreptomicinaLife Tecnologie15140122
Plasmide1: pRL-SV40PAddgene27163
Plasmide2: M51 Super 8x FOPFlashAddgene12457
Plasmide3: M50 Super 8x TOPFlashAddgene12456
pluriStrainer 200 &; mpluriSelect43-50200-01
PrimocinInvivogenANT-PM-1
Terreno di congelamento per colture cellulari di recuperoThermo Fisher (Gibco)12648-010Terreno di congelamento cellulare
Tampone per lisi di globuli rossiMillipore Sigma11814389001
Terreno condizionato con R-spondinaIn-house o commerciale da Peprotech120-38
Scalpel (No.10)Sklar InstrumentsJun-10
Shaker (Incu-shaker Mini)BenchmarkH1001-M
TGF-β inibitore del recettore A 83-01Tocris2939
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
TrypLE Express Enzyme (1X), fenolo rossoLife Technologies12605028cell reagente di dissociazione
X-tremeGENE 9 Reagente di trasfezione del DNAMillipore Sigma6365779001
Y-27632 Dicloridrato (RhoKi)Abmole BioscienceY-27632
ZeocinThermo FisherR25001
Provette coniche da 50 mL VWR 525-1077 Sistema di filtrazione sottovuoto da 50 mL (0,22 &; micro;1258701035050061

Riferimenti

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