Questo articolo descrive un protocollo per semplificare il processo e rendere meno costosa la preparazione del siero autologo condizionato (ACS). Non sono necessarie siringhe speciali o perle di vetro rivestite in superficie. Inoltre, l'ACS modificato (mACS) ha vantaggi competitivi rispetto al siero autologo convenzionale nella guarigione della ferita corneale degli occhi murini ex vivo.
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Articolo metodologico
Produzione di siero autologo condizionato modificato e valutazione ex vivo del suo potenziale cicatrizzante nell'epitelio corneale murino
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le terapie topiche derivate dal sangue umano sono state un vantaggio per i medici negli ultimi decenni. Il siero autologo (AS) e il plasma ricco di piastrine (PRP) sono arricchiti in fattori di crescita epiteliotropici essenziali nella guarigione delle ferite corneali. A differenza dell'AS, il PRP si basa su un sistema di centrifugazione differenziale, producendo più fattori di crescita derivati dalle piastrine. Il siero autologo condizionato (ACS) non solo preserva la preparazione di AS e PRP, ma si concentra anche sulle proprietà immunomodulanti, che sono importanti nelle malattie infiammatorie.
La mancanza di protocolli standardizzati e gli elevati costi di preparazione sono limitazioni per l'applicazione clinica di ACS. Questo esperimento video dimostra una procedura operativa standard per la preparazione di colliri a siero autologo condizionato modificato (mACS). In primo luogo, il glicerolo è stato aggiunto nelle siringhe di eparina come stabilizzatore delle cellule del sangue durante l'incubazione ipossica. Per attivare le cellule del sangue, è stata avviata un'incubazione di 4 ore a 37 °C. Quindi, i campioni di sangue sono stati centrifugati a 3.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la filtrazione del surnatante attraverso un filtro da 0,22 μm, i colliri mACS sono stati completamente preparati.
Un tentativo di prova dell'effetto terapeutico del mACS ha dimostrato che può avere vantaggi competitivi rispetto alla SA convenzionale nella guarigione della ferita corneale negli occhi di topo ex vivo . L'AS utilizzato in questo studio è stato preparato in base agli studi pubblicati e alla pratica clinica nel nostro ospedale. Pertanto, l'efficacia del mACS sulle malattie della superficie oculare potrebbe essere valutata nella ricerca futura attraverso studi in vivo sugli animali e studi clinici.
Introduzione
Gli effetti terapeutici del siero autologo (AS) nelle malattie dell'occhio secco sono stati segnalati per la prima volta nel 1980 da Fox et al.1. Si ritiene che sia la proprietà lubrificante che i componenti biochimici epiteliotropici essenziali nell'AS, imitando le lacrime naturali, favoriscano la proliferazione delle cellule epiteliali corneali. Negli ultimi decenni, diversi studi sono stati eseguiti su questa base. I componenti trofici includono il fattore di crescita epidermico (EGF), la vitamina A, il fattore di crescita trasformante β (TGF-β) e altre citochine. È interessante notare che il siero è ricco di TGF- β e vitamina A, che si riti....
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Protocollo
La ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali all'inizio della sezione protocollo. Tutti i protocolli e le procedure sono stati eseguiti secondo la Dichiarazione di Helsinki e sono stati esaminati e approvati dal Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Tutti i volontari sono stati informati della natura di questo studio e hanno firmato un modulo di consenso informato prima della loro inclusione. I materiali di consumo richiesti per l'intera procedura sperimentale sono presentati in Figura 1 e Figura 2, nonché nella Tabella dei materiali.
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Risultati
La Figura 1 e la Figura 2 mostrano i materiali necessari per l'esperimento, mentre la Figura 3 mostra le fasi sequenziali e i prodotti intermedi di successo durante la preparazione del mACS. In primo luogo, 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% sono stati aggiunti in ogni provetta sterile da 10 ml (Figura 3A). Quindi, 60-70 ml di sangue venoso sono stati ottenuti dal paziente e 10 ml di sangue sono st.......
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Discussione
In questo studio, viene descritto un protocollo per la preparazione di mACS e viene ulteriormente dimostrato il beneficio del collirio mACS nella guarigione delle ferite dei modelli animali. La modifica cruciale di questo protocollo mACS è l'aggiunta di circa 0,5 ml di soluzione di glicerolo al 10% in ciascuna provetta, che crea condizioni ipossiche adeguate durante l'incubazione di 4 ore a 37 °C. Questa impostazione fornisce all'AS uno stress adeguato e sollecita le cellule a secernere i fattori di crescita necessari c.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Ya-Lan Chien e Chia-Ying Lee per l'eccellente assistenza tecnica, e OnLine English company per l'edizione linguistica. Questo studio è stato finanziato in parte dal Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra di coltura a 96 pozzetti | Merck KGaA, Germania | CLS3997 | |
| Barraquer lid speculum | katena | K1-5355 | 15 mm |
| Portaaghi | Barraquer Katena | K6-3310 | senza blocco |
| Barron Vacuum Punch 8,0 mm | katena | K20-2108 | per il taglio di carta da filtro |
| BD 10,0 mL provette vacutainer contenenti eparina 158 unità USP | Becton, Dickinson and Company, US | 367880 | Almeno 6 provette, necessarie per raccogliere il sangue per esperimenti successivi e per evitare l'agglutinazione del sangue |
| BD 21 G set per infusione ad ali di farfalla | Becton, Dickinson and Company, US | 367281 | Per una distribuzione uniforme della soluzione di glicerolo |
| C57BL/6 nei topi | National Laboratory Animal Center RMRC11005 | per modello murino | |
| Castroviejo pinza 0,12 mm | katena | K5-2500 | |
| Centrifuga | Eppendorf, Germania | 5811000428 | 3.500 x g per 10 min |
| Cheng Yi 10,0 ml flacone contagocce sterilizzato | Cheng Yi Chemical, Taiwan | CP405141 | Deve essere sterile e come contenitore per la conservazione del prodotto finale Rimozione dell'anello |
| di ruggine corneale con bava da 0,5 mm | Algerbrush IITM; Lago Vista, TX | CHI-675 | per lo sbrigliamento dell'epitelio corneale |
| Mezzo essenziale minimo modificato di Dulbecco | Merck KGaA, Germania | D6429 | |
| Carta da filtro | Toyo Roshi Kaisha, Ltd. | 1.11 | |
| Strisce oftalmiche di fluoresceina sodica U.S.P | OPTITECH | OPTFL100 colorazione per difetto epiteliale corneale | |
| Incubatrice | Firstek, Taiwan | S300S | 37 C per 4 h |
| Guanti sterili Kanam | Kanam Latex Industries, India | EN455 | Per funzionamento asettico |
| Merck 0.22 & micro; m filter | Merck KGaA, Germania | PR05359 | Almeno 2 filtri per la filtrazione mACS |
| Nang Kuang 250 mL Soluzione di glicerolo al 10% | Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan | 19496 | Per offrire un adeguato effetto di stabilizzazione della membrana e pressione osmotica extracellulare per le cellule del sangue |
| Soluzione salina normale | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 100-120-1101 | |
| Punzone per biopsia cutanea 2mm | STIEFEL | 22650 | |
| Stereomicroscopio | Carl Zeiss Meditec, Dublino, CA | Microscopio SV11 | per chirurgia |
| Terumo Ago da 18 G | Terumo, Taiwan | SMACF0120-18BX | Siringa da 3,0 ml con ago da 18 G per estrarre il surnatante dopo la centrifugazione |
| Siringa Terumo da 20,0 ml | Terumo, Taiwan | MDSS20ES | Potrebbe essere utilizzato per raccogliere il siero dopo la centrifugazione iniziale e utilizzarlo per la centrifugazione secondaria. |
| Siringa Terumo da 3,0 ml con ago da 23 G | Terumo, Taiwan | MDSS03S2325 | siringa da 3,0 ml viene utilizzata per estrarre il surnatante dopo la centrifugazione. Quindi collegare il filtro e l'ago per preparazioni iniettabili da 23 G nei flaconi del collirio. |
| Forbici per tenotomia Westcott Medium | katena | K4-3004 |
Riferimenti
- Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca. Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).
- Noble, B. A., et al.
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Ristampe e permessi
