Supporto composito a matrice microgel-extracellulare per la stampa 3D embedded di costrutti neurali umani

Summary

Questo lavoro descrive un protocollo per la stampa 3D incorporata a forma libera di cellule staminali neurali all'interno di compositi di matrice extracellulare ricottura autorigeneranti. Il protocollo consente la modellazione programmabile di costrutti di tessuto neurale umano interconnessi con alta fedeltà.

Abstract

La stampa 3D incorporata di cellule all'interno di un mezzo di supporto granulare è emersa nell'ultimo decennio come un potente approccio per la biofabbricazione a forma libera di costrutti di tessuti molli. Tuttavia, le formulazioni granulari in gel sono state limitate a un numero limitato di biomateriali che consentono la generazione economica di grandi quantità di microparticelle di idrogel. Pertanto, i supporti di supporto in gel granulare sono generalmente privi delle funzioni adesive e istruttive delle cellule presenti nella matrice extracellulare nativa (ECM).

Per affrontare questo problema, è stata sviluppata una metodologia per la generazione di compositi riutilizzabili autoriparanti a matrice particelle-extracellulare (SHAPE). I compositi SHAPE sono costituiti da una fase granulare (microgel) e da una fase continua (soluzione ECM viscosa) che, insieme, consentono sia la stampa programmabile ad alta fedeltà che un ambiente extracellulare biofunzionale regolabile. Questo lavoro descrive come la metodologia sviluppata può essere utilizzata per la biofabbricazione precisa di costrutti neurali umani.

In primo luogo, le microparticelle di alginato, che fungono da componente granulare nei compositi SHAPE, sono fabbricate e combinate con un componente continuo a base di collagene. Quindi, le cellule staminali neurali umane vengono stampate all'interno del materiale di supporto, seguite dalla ricottura del supporto. I costrutti stampati possono essere mantenuti per settimane per consentire la differenziazione delle cellule stampate in neuroni. Allo stesso tempo, la fase continua del collagene consente la crescita assonale e l'interconnessione delle regioni. Infine, questo lavoro fornisce informazioni su come eseguire l'imaging a fluorescenza delle cellule vive e l'immunocitochimica per caratterizzare i costrutti neurali umani stampati in 3D.

Introduction

La stampa 3D precisa e programmabile di costrutti di idrogel carichi di cellule che imitano i tessuti molli in vitro rappresenta una grande sfida. Ad esempio, i tentativi basati sull'estrusione diretta di idrogel morbidi sono intrinsecamente problematici, poiché le scarse proprietà meccaniche richieste per ricapitolare il microambiente in vivo portano a una mancanza di integrità strutturale, deformazioni delle caratteristiche predefinite o al completo collasso delle strutture fabbricate. Una soluzione convenzionale per questo problema consiste nel stampare un'impalcatura di supporto da un materiale biocompatibile più rigido che consenta al costrutto finale di mantenere la sua forma. Tuttavia, questo approccio limita notevolmente le possibilità di progettazione e richiede un'attenta messa a punto reologica degli inchiostri adiacenti.

Per superare i limiti della tradizionale stampa 3D basata sull'estrusione strato per strato, la stampa 3D incorporata è emersa negli ultimi anni come una potente alternativa alla fabbricazione di materiali morbidi e tessuti 1,2,3,4,5,6. Invece di estrudere l'inchiostro nell'aria ambiente sopra una superficie, l'inchiostro viene depositato direttamente attraverso un ago da siringa all'interno di un bagno di supporto che è solido a riposo ma fluidifica reversibilmente attorno alla punta dell'ago in movimento per consentire la deposizione precisa di materiale morbido carico di cellule. Il materiale depositato viene mantenuto in posizione mentre il supporto si risolidifica nella scia dell'ago. Pertanto, la stampa 3D integrata consente la fabbricazione a forma libera ad alta risoluzione di strutture complesse da biomateriali morbidi con possibilità di progettazione ampliate ^7,8.

I gel granulari sono stati ampiamente esplorati come materiali da bagno di supporto per la stampa 3D incorporata, poiché possono essere formulati per esibire transizioni solido-liquido lisce, localizzate e reversibili a basse sollecitazioni di snervamento 9,10,11. Mentre mostrano eccellenti proprietà reologiche per la stampa ad alta risoluzione, i gel granulari sono stati limitati a una manciata di biomateriali¹². La mancanza di diversità nelle formulazioni di gel granulari, che è particolarmente evidente se si considera l'ampia gamma di biomateriali disponibili per le formulazioni di idrogel sfuso, è causata dalla necessità di generare un gran numero di microgel utilizzando semplici sostanze chimiche. A causa del limitato panorama di biomateriali di supporti in gel granulare, la messa a punto del microambiente extracellulare fornito dal supporto di stampa rappresenta una sfida sul campo.

Recentemente, è stato sviluppato un approccio modulare per la generazione di supporti di stampa 3D incorporati, definiti compositi ricottura autoriparanti a matrice extracellulare (SHAPE)¹³. Questo approccio combina le distinte proprietà reologiche dei gel granulari con la versatilità biofunzionale delle formulazioni di idrogel sfuso. Il supporto composito SHAPE presentato è costituito da microparticelle di alginato impacchettate (fase granulare, frazione di volume ~ 70%) con uno spazio interstiziale aumentato riempito con una soluzione di pregel ECM a base di collagene viscoso (fase continua, frazione di volume ~ 30%). È stato inoltre dimostrato che il supporto SHAPE facilita la deposizione ad alta risoluzione di cellule staminali neurali umane (hNSCs) che, dopo la ricottura del bagno di supporto, possono essere differenziate in neuroni e mantenute per settimane per raggiungere la maturazione funzionale. La stampa 3D integrata all'interno del bagno di supporto SHAPE supera alcune delle principali limitazioni legate alle tecniche convenzionali per la biofabbricazione del tessuto neurale, fornendo al contempo una piattaforma versatile.

Questo lavoro descrive in dettaglio i passaggi per la stampa 3D incorporata di hNSC all'interno del supporto SHAPE e la loro successiva differenziazione in neuroni funzionali (Figura 1). In primo luogo, le microparticelle di alginato vengono generate attraverso la tosatura durante la gelificazione interna. Questo approccio consente la facile generazione di grandi volumi di microparticelle senza la necessità di attrezzature specializzate e reagenti citotossici. Inoltre, l'alginato è una fonte di materiale ampiamente disponibile ed economica per la formazione di substrati idrogel biocompatibili per una vasta gamma di tipi di cellule. Le microparticelle di alginato generate sono combinate con una soluzione di collagene per formare il materiale di supporto composito SHAPE. Quindi, gli hNSC vengono raccolti e caricati in una siringa come bioink cellulare per la stampa 3D. Una bioprinter 3D viene utilizzata per la stampa embedded basata sull'estrusione di hNSC all'interno del composito SHAPE. Le cellule stampate in 3D sono differenziate in neuroni per dare origine a costrutti neurali umani spazialmente definiti e funzionali. Infine, il protocollo descrive come i costrutti tissutali generati possono essere caratterizzati utilizzando l'imaging delle cellule vive e l'immunocitochimica. Inoltre, vengono forniti suggerimenti per l'ottimizzazione e la risoluzione dei problemi. In particolare, entrambi i componenti della fase granulare e continua potrebbero essere scambiati con altre formulazioni di idrogel per adattarsi a diverse porzioni biofunzionali, proprietà meccaniche e meccanismi di reticolazione, come richiesto da altri tipi di cellule e tessuti oltre le applicazioni neurali.

Protocol

1. Preparazione dei tamponi e dei reagenti

1. Preparare il terreno di crescita cellulare aggiungendo i seguenti supplementi a DMEM / F12 con L-alanil-L-glutammina dipeptide: 30 mM di glucosio, 5 μM HEPES, 0,5% p/v di albumina sierica bovina ricca di lipidi, 40 μM di L-alanina, 40 μM di L-asparagina monoidrato, 40 μM di acido L-aspartico, 40 μM di acido L-glutammico, 40 μM di L-prolina, 1% di supplemento di N2, 1% di penicillina-streptomicina e 20 ng / L ciascuno di fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF). Eseguire questi passaggi in un banco LAF (laminar air-flow).
2. Preparare una soluzione di alginato all'1% p/v in acqua ultrapura agitando energicamente per 4 ore a 60 °C. Filtrare sterile la soluzione di alginato caldo disciolto con un filtro da 0,45 μm in un banco LAF. Conservare a 4 °C.
   NOTA: Se la temperatura della soluzione di alginato è inferiore a 60 °C, non sarà possibile farla passare attraverso il filtro.
3. Preparare una soluzione di NaHCO₃ da 37 g/L in acqua ultrapura. Regolare il pH della soluzione a 9,5 utilizzando NaOH e filtrare la sterilizzazione in un banco LAF. Conservare la soluzione a 4 °C.

2. Preparazione del materiale composito SHAPE

1. Generazione di microparticelle di alginato
   1. Preparare una soluzione di 2 mg/mL di CaCO₃ in acqua ultrapura in un becher sterile. Mescolare 1:1 con la soluzione di alginato e mescolare per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un agitatore magnetico.
   2. Aggiungere l'acido acetico in un rapporto 1:500 e lasciare mescolare per una notte a 650 giri / min.
      NOTA: La soluzione di alginato inizierà immediatamente a gelificare. Assicurarsi di utilizzare un magnete di agitazione con la stessa lunghezza del diametro della vetreria utilizzata per garantire un'agitazione ottimale e omogenea del gel formante. Il giorno successivo, la soluzione generata agitando durante la gelificazione apparirà viscosa (Figura 2A).
   3. Frammentare meccanicamente la soluzione gelificata di alginato in microparticelle omogeneizzandola a 15.000 giri/min per 10 minuti con un omogeneizzatore posto in un banco LAF (Figura 2B).
   4. Centrifugare le microparticelle a 18.500 × g per 20 minuti (Figura 2C) a temperatura ambiente.
   5. Scartare con cautela il surnatante all'interno del banco LAF, risospendere le particelle in DMEM contenenti 2 mM NaOH e 1% P/S e incubare per una notte a 4 °C (Figura 2D).
      NOTA: il colore della sospensione dovrebbe tornare al rosso. Se la sospensione rimane gialla, aggiungere NaOH a goccia e mescolare fino a quando non diventa rosso (Figura 2E).
   6. Omogeneizzare le particelle a 15.000 giri/min per 3 minuti e centrifugare a 18.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
   7. Osservare il pellet (Figura 2F) e rimuovere attentamente il surnatante .
      NOTA: Il pellet di microparticelle di alginato strettamente imballate può essere conservato a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo. Se la soluzione di alginato non è stata sterilizzata con filtro, le microparticelle devono essere consumate entro 1 settimana.
2. Formulazione composita SHAPE
   1. Il giorno prima della stampa, risospendere il pellet di microparticelle di alginato in due volte il volume del terreno di crescita contenente il 4% di HEPES (1 M di stock) e il 4% di soluzione di NaHCO₃ in un banco LAF e incubarlo durante la notte a temperatura ambiente.
   2. Centrifugare la sospensione di microgel a 18.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente e gettare il surnatante.
   3. Neutralizzare il collagene da miscelare con le microparticelle di alginato in un banco LAF. Diluire la soluzione madre di collagene per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg / ml e neutralizzarla aggiungendo il 4% di HEPES e il 4% di NaHCO₃. Ad esempio, per 3 mL di composito SHAPE, mescolare 2 mL di microparticelle di alginato con 1 mL di collagene neutralizzato (0,12 mL di HEPES, 0,12 mL di NaHCO₃, 0,16 mL di terreno di crescita e 0,6 mL di collagene).
      NOTA: Tutti i materiali miscelati con collagene devono essere maneggiati su ghiaccio per evitare la polimerizzazione del collagene. Non appena il collagene viene neutralizzato, la polimerizzazione inizierà lentamente.
   4. Generare il composito SHAPE mescolando il pellet di microparticelle di alginato con il collagene diluito e neutralizzato in un rapporto 2: 1. Mescolare accuratamente il gel pipettando lentamente su e giù sul ghiaccio in una panca LAF.
      NOTA: Non vortice, poiché ciò introdurrà bolle nel materiale di supporto.
   5. In un banco LAF, trasferire il materiale composito generato in una lastra di micropozzetti raffreddata o in qualsiasi contenitore di stampa adatto e utilizzarlo entro 30 minuti (Figura 3E, F).

3. Coltura hNSC e preparazione del bioink

1. Coltura delle cellule in un matraccio T75 rivestito di membrana basale rivestito di estratto in terreno di crescita. Passare le celle almeno due volte dopo lo scongelamento prima di utilizzarle per un esperimento di stampa 3D.
2. Prima della stampa, dissociare le cellule enzimaticamente utilizzando una soluzione di tripsina allo 0,025% per 5 minuti a 37 °C, neutralizzare la tripsina con terreno di coltura e centrifugare la sospensione cellulare a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 2-3 ml di terreno di crescita.
3. Eseguire un conteggio delle cellule, centrifugare le cellule a 400 × g e risospendere il pellet in terreno di crescita integrato con gomma xantana allo 0,1% (per evitare che le cellule sedimentino) ad una concentrazione finale di 9 × 10⁶ cellule / ml.
4. Utilizzare un ago metallico smussato da 21 G per caricare 100 μL di microparticelle di alginato strettamente imballate in una siringa (Figura 3A).
   NOTA: La creazione di un tappo con le microparticelle di alginato ha due scopi: aiuta a mantenere la stabilità dell'estrusione durante la stampa e consente l'estrusione completa dell'inchiostro cellulare caricato (nessun volume morto).
5. Utilizzando lo stesso ago, caricare la sospensione cellulare preparata nella siringa (Figura 3B).
   NOTA: prestare particolare attenzione a non introdurre bolle d'aria durante le fasi di caricamento della siringa. Le bolle d'aria causeranno instabilità durante la stampa.
6. Sostituire l'ago di carico con un ago metallico smussato da 27 G, che verrà utilizzato per la stampa (Figura 3C).

4. Stampa 3D incorporata

1. Progettare una struttura da stampare utilizzando il software di riferimento (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Assicurarsi di regolare l'altezza iniziale della struttura stampata entro la profondità del supporto composito SHAPE. I suggerimenti di progettazione possono essere trovati nella Figura 4A (disegni a spirale e a palo).
2. Genera un G-Code facendo clic su Genera.
3. Inserire la siringa di vetro carica di cellule in una testina di estrusione volumetrica su un bioprinter basato sull'estrusione (Figura 3D).
4. Misurare la lunghezza dell'ago della siringa di vetro carica di cellule facendo clic su Misurazione lunghezza ago.
5. Posizionare la piastra o il contenitore del micropozzetto caricato con il composito SHAPE sulla stampante.
   NOTA: Mantenere la piastra cellulare o il contenitore a 4 °C fino alla stampa per evitare la reticolazione prematura del supporto.
6. Misurare l'altezza superficiale di un pozzetto vuoto all'interno della stessa piastra o contenitore del micropozzetto in cui viene caricato il gel SHAPE facendo clic su SHM (misurazione dell'altezza superficiale).
   NOTA: In alternativa, determinare manualmente l'altezza della superficie misurando l'altezza del pozzetto con l'ago.
7. Impostare la velocità di estrusione su 3,6 μL/min e la velocità di avanzamento su 0,3 mm/s.
   NOTA: Assicurarsi di testare l'estrusione prima di stampare. La sedimentazione cellulare può causare l'intasamento dell'ugello e può essere evitata pre-estrudendo un piccolo volume prima della stampa incorporata effettiva o aggiungendo un volume di retrazione alla siringa volumetrica. In alcuni casi, la velocità di avanzamento deve essere mantenuta al di sotto di 0,5 mm/s quando l'ago viene inserito o esce dal gel SHAPE per evitare il trascinamento dell'inchiostro.
8. Caricare il G-Code nell'interfaccia utente della stampante.
   NOTA: un nuovo G-Code deve essere generato ogni volta che vengono apportate modifiche alla struttura progettata.
9. Avviare la procedura di stampa facendo clic su Esegui (Figura 3G).
10. Immediatamente dopo la stampa, posizionare il gel SHAPE a 37 °C in un incubatore per colture cellulari per 30 minuti per la ricottura.
11. Aggiungere delicatamente il terreno di crescita sopra il supporto in gel SHAPE ricotto.
12. Il giorno successivo, sostituire il terreno di coltura con terreno di differenziazione formulato come segue: DMEM/F12 con L-alanil-L-glutammina dipeptide con 30 mM di glucosio, 5 μM HEPES, 0,5% p/v di albumina sierica bovina ricca di lipidi, 40 μM di L-alanina, 40 μM di L-asparagina monoidrato, 40 μM di acido L-aspartico, 40 μM di acido L-glutammico, 40 μM di L-prolina, 1% di supplemento di N2, 1% di penicillina-streptomicina, 100 μM di dibutirril-adenosina monofosfato ciclico (dibutirril-cAMP), e 2 ng/mL di fattore neurotrofico derivato da linee cellulari gliali (GDNF).
    NOTA: assicurarsi di non danneggiare l'idrogel durante i cambi del mezzo. Inclinare la piastra e rimuovere delicatamente il vecchio mezzo. Aggiungere fresco a goccia sulla parete del pozzetto contenente il gel piuttosto che direttamente sopra il gel. Non utilizzare un aspiratore per rimuovere il fluido.
13. Aggiornare il mezzo di differenziazione ogni 2 giorni fino all'endpoint sperimentale.

5. Imaging a fluorescenza a cellule vive

1. Rimuovere il mezzo in eccesso dal gel.
2. Aggiungere un volume uguale di 20 μM di Calceina AM (diluito in mezzo di differenziazione dalla soluzione madre) al volume del gel di supporto.
3. Incubare per 40 min a 37 °C.
4. Rimuovere la soluzione di Calcein AM e aggiungere un volume appropriato di mezzo di differenziazione fresco.
5. Trasferire la piastra al microscopio per l'imaging.

6. Immunocitochimica

1. Rimuovere il mezzo in eccesso dal gel.
2. Utilizzando una piccola spatola, trasferire il gel in un contenitore più grande contenente DPBS.
3. Lavare tre volte per 20 minuti ogni volta con DPBS e trasferire la piastra in una cappa aspirante.
4. Rimuovere il DPBS, aggiungere una soluzione di formaldeide al 4% sufficiente a coprire il gel e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
5. Lavare tre volte con DPBS per 20 minuti ogni volta.
6. Preparare una soluzione bloccante composta da siero d'asino al 5%, detergente allo 0,25% e azoturo di sodio allo 0,02% in DPBS.
   NOTA: Preparare tre volte il volume necessario per coprire il gel; Sarà utilizzato in seguito come base per le soluzioni anticorpali primarie e secondarie.
7. Dopo il lavaggio con DPBS, aggiungere la soluzione bloccante al gel e incubare per 6 ore a temperatura ambiente per evitare un legame non specifico. Culla delicatamente il piatto.
8. Preparare la soluzione anticorpale primaria diluendo l'anticorpo TUBB3 in soluzione bloccante in un rapporto di 1:1.000.
9. Rimuovere la soluzione bloccante dal gel, aggiungere la soluzione anticorpale primaria e incubare per 48 ore a 4 °C. Culla delicatamente il piatto.
10. Lavare tre volte con DPBS per 20 minuti ogni volta.
11. Preparare la soluzione anticorpale secondaria diluendo il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1:1.000) e l'anticorpo secondario (1:200) in soluzione bloccante.
12. Dopo il lavaggio con DPBS, incubare il gel nella soluzione anticorpale secondaria per 24 ore a 4 °C. Culla delicatamente il piatto.
13. Lavare tre volte con DPBS per 20 minuti ogni volta e conservare a 4 °C fino all'imaging.
14. Prima dell'imaging, trasferire il gel colorato con una spatola su un piatto o una piastra a pozzetto con un fondo di imaging sottile.

Results

La preparazione del microgel di alginato tramite assottigliamento a taglio durante la gelificazione interna seguita da frammentazione meccanica produce microgel di alginato di dimensioni polidisperse e di forma simile a scaglie come mostrato nella Figura 2G. La dimensione di queste particelle irregolari varia da meno di 1 μm a circa 40 μm di diametro. Quando sono ben imballate, le microparticelle formano un materiale sfuso trasparente che è solo leggermente più opaco del corrispondente mezzo di coltura cellulare (Figura 2F). La trasparenza del materiale di supporto è un aspetto importante della piattaforma in quanto consente la visualizzazione delle strutture stampate durante il periodo di coltura, nonché la microscopia confocale ad alta risoluzione di costrutti etichettati sia con coloranti di cellule vive che tramite immunocitochimica. Quando immerso in terreno di coltura cellulare tamponato, il gel risultante con pH regolato dovrebbe avere un colore rosso, che indica le condizioni fisiologiche (Figura 2F). È importante neutralizzare il pH delle microparticelle di alginato per due motivi. Le microparticelle acide possono danneggiare direttamente le cellule. Inoltre, un ambiente acido impedirà la corretta ricottura del supporto composito SHAPE, in quanto interferirebbe con la polimerizzazione del collagene.

La stampa dell'inchiostro hNSC utilizzando i parametri sopra descritti produce un filamento di celle che hanno un diametro di ~ 200 μm (Figura 4A). La geometria programmata viene mantenuta sia quando si stampa su un piano che quando si stampano strutture una sopra l'altra. Nel caso della stampa multistrato, le strutture stampate rimangono intatte, con una distanza minima strato a strato di 200 μm¹³. La vitalità delle cellule non dovrebbe essere influenzata in modo significativo durante la preparazione e l'estrusione dell'inchiostro. I fili stampati sono ricchi di cellule vive che hanno una morfologia rotonda (Figura 4B, a sinistra). Gli spazi vuoti nei fili stampati possono apparire il giorno dopo la stampa, anche se il costrutto fabbricato non mostra alcuna deformazione immediatamente dopo la stampa. Questo è molto probabilmente il risultato di una miscelazione disomogenea del supporto. Poiché le cellule non interagiscono con le microparticelle di alginato, migrano lontano dalle aree ricche di alginato verso le aree ricche di collagene e cellule, causando così rotture nei filamenti stampati. Inoltre, il supporto SHAPE dovrebbe essere privo di bolle, poiché le sacche d'aria possono interferire con la fedeltà di stampa.

Una differenziazione riuscita delle hNSC dovrebbe produrre strutture ricche di neuroni 30 giorni dopo la stampa, con cellule che mostrano morfologia neuronale con corpi cellulari piccoli e processi lunghi e sottili (Figura 4B, a destra). Inoltre, se vengono stampati modelli densi, come un foglio rettangolare di celle, non dovrebbero esserci spazi vuoti visibili o aggregati che si formano durante la differenziazione, ma piuttosto uno strato continuo di celle dovrebbe rimanere intatto (Figura 4C). In questo protocollo, viene descritta una procedura per l'immunocitochimica a fluorescenza dei campioni stampati in 3D. La colorazione per TUBB3, un marcatore neuronale citoplasmatico, consente la visualizzazione diretta delle reti neuronali generate. La microscopia a fluorescenza delle stampe differenziate dovrebbe rivelare strutture ricche di TUBB3 e con geometria mantenuta (Figura 4D, a sinistra). Durante il processo di differenziazione, le cellule non migrano fuori dai filamenti stampati, come si può osservare dalla colorazione per i nuclei cellulari con DAPI (Figura 4D, al centro). Di conseguenza, i corpi neuronali sono osservati entro i confini della geometria stampata, con proiezioni assonali che emanano centinaia di micrometri nel supporto SHAPE che circonda il costrutto. L'esplorazione assonale del volume circostante indica che il supporto SHAPE fornisce segnali biofunzionali che consentono il pathfinding assonale. Marcatori neuronali più maturi o marcatori sottotipo-specifici potrebbero essere utilizzati in immunocitochimica per caratterizzare ulteriormente le popolazioni neuronali generate. Inoltre, il costrutto neuronale stampato potrebbe essere caratterizzato utilizzando RT-qPCR o elettrofisiologia¹³. Entrambi gli approcci richiederebbero, tuttavia, la rimozione del collagene utilizzando la collagenasi, poiché lo strato di idrogel ostacola sia l'estrazione dell'RNA che l'accesso fisico alle cellule con una micropipetta.

Figura 1: Illustrazione concettuale dell'approccio di stampa embedded SHAPE. Una soluzione di collagene viene miscelata con microparticelle di alginato per formare il composito SHAPE; il composito SHAPE viene utilizzato come materiale di supporto per la stampa 3D incorporata di hNSC, che sono differenziati in neuroni all'interno del supporto ricotto. Le proprietà biofunzionali del composito SHAPE permettono ai neuroni di estendere le proiezioni e popolare la parte vuota del supporto con le loro proiezioni assonali. Questa cifra è stata modificata da Kajtez et ^al.13. Abbreviazioni: SHAPE = matrice particellula-extracellulare rigenerante autoriparante; hNSCs = cellule staminali neurali umane. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Preparazione di microparticelle di alginato . (A) La soluzione di alginato dopo la gelificazione durante la notte. (B) Le microparticelle di alginato generate dall'omogeneizzazione. C) Il pellet di particelle dopo centrifugazione. (D) Il pellet risospeso in DMEM (E) prima della regolazione del pH e dopo l'aggiustamento del pH. (F) Le microparticelle dopo l'incubazione in mezzo durante la notte e la centrifugazione. (G) Un'immagine in campo chiaro delle microparticelle di alginato fabbricate. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Preparazione per il processo di stampa 3D. (A) Un tappo di liquame (~ 100 μL) viene caricato nella siringa seguito da (B) il caricamento del bioink cellulare (qui integrato con perline colorate per scopi di visualizzazione). (C) La punta conica di plastica (21 G) utilizzata per il caricamento dell'inchiostro è sostituita da una punta ad ago di metallo smussato da 27 G. (D) La siringa viene inserita nella testina di stampa 3D. (E,F) Il composito SHAPE viene pipettato in un pozzetto di una piastra da 48 pozzetti. Il tubo con il composito SHAPE viene mantenuto sul ghiaccio quando non viene maneggiato. (G) La punta dell'ago di stampa viene inserita nel supporto SHAPE e viene avviata la stampa del percorso definito dal progetto del computer (qui è raffigurata la stampa di una spirale). Abbreviazione: SHAPE = matrice extracellulare ricottura autorigenerante. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Costrutti neurali stampati in 3D all'interno del supporto composito SHAPE. (A) Immagini in campo chiaro di hNSC stampate all'interno dell'idrogel di supporto. Vengono visualizzati i disegni dei costrutti a spirale (a sinistra) e della catasta di legna (a destra). (B) Imaging di cellule vive di un costrutto stampato in 3D il giorno dopo la stampa (a sinistra) e dopo la differenziazione neuronale (a destra). (C) Un costrutto quadrato stampato in 3D rimosso da un pozzo di coltura con una spatola mostra integrità strutturale. (D) Immagini confocali a fluorescenza dello stesso costrutto quadrato immunomarcate per un marcatore neuronale (TUBB3) e con nuclei controcolorati (DAPI) che confermano la differenziazione di successo delle hNSC all'interno dei costrutti stampati in 3D. Barre di scala = 500 μm (A, a destra); 100 μm (B,D). I pannelli C e D in questa figura sono stati modificati da Kajtez et ^al.13. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

L'approccio ai materiali compositi SHAPE fornisce un percorso versatile per la formulazione di bagni di supporto ricottura e biofunzionali per la stampa 3D incorporata di inchiostri cellulari. Mentre questo protocollo fornisce un esempio della stampa 3D di costrutti neurali, la cassetta degli attrezzi SHAPE potrebbe essere facilmente adattata alla biofabbricazione con altre fonti cellulari per l'ingegneria precisa di una gamma di tipi di tessuto target. L'approccio di stampa consentirebbe anche il pattern preciso di più tipi di cellule per studiare la loro interazione o per ingegnerizzare tessuti con una disposizione spaziale definita dei compartimenti cellulari (ad esempio, neuroni e cellule gliali). A differenza dei tradizionali gel granulari, il composito SHAPE contiene uno spazio interstiziale espanso (frazione di volume ~ 30% per la formulazione presentata in questo protocollo). Il componente granulare funge da modificatore reologico che fornisce al composito proprietà materiali favorevoli per la stampa embedded ad alta risoluzione. Ciò apre una strada verso una progettazione razionale del microambiente cellulare alterando la formulazione del componente continuo mantenendo la stessa componente granulare. Ad esempio, altre molecole funzionali di ECM potrebbero essere introdotte nel bagno di supporto (ad esempio, acido ialuronico, laminine, fibronectina) o potrebbero essere sfruttati diversi meccanismi di reticolazione (ad esempio, enzimatici, basati sulla luce)¹³. Inoltre, l'alginato nella componente granulare potrebbe essere sostituito con microparticelle provenienti da diversi materiali idrogel (ad esempio, gelatina⁸, polietilenglicole^14,15, agarosio¹⁶) o essere realizzato in diverse dimensioni e forme in linea con le esigenze di diverse applicazioni di ingegneria tissutale o modellazione di malattie. Il rapporto tra la fase granulare e continua può essere regolato in base alle esigenze dei singoli progetti di stampa 3D, ma aumentare la fase continua oltre il 30% potrebbe compromettere la fedeltà e la risoluzione della stampa.

Durante le fasi di produzione del microgel, è fondamentale che l'agitazione della soluzione di alginato dopo l'aggiunta di acido acetico sia efficace per tutto il volume della soluzione gelificante. Se la velocità di agitazione è troppo bassa o l'agitatore magnetico è troppo piccolo, l'agitazione potrebbe non raggiungere gli strati superiori della soluzione, che si trasformerà in un grande volume di idrogel sfuso reticolato, mentre gli strati inferiori saranno tranciati. L'omogeneizzazione di un idrogel di alginato tagliato in modo incoerente comporterà la generazione di microparticelle di alginato che non sono ottimali per le applicazioni di stampa 3D. Inoltre, le microparticelle di alginato devono essere accuratamente miscelate con la soluzione di collagene, poiché una miscela non omogenea si tradurrà in chiazze del materiale di supporto prive di collagene; Queste patch non sarebbero ricotto e, quindi, mancherebbero di funzionalità interattive con le celle. Potrebbero anche esserci patch che mancano di microparticelle di alginato e, quindi, non supporterebbero la stampa. Un supporto di stampa misto disomogeneo non sarebbe quindi in grado di supportare la stampa ad alta fedeltà e sarebbe strutturalmente compromesso, in quanto non verrebbe ricotto per tutto il suo volume. Anche le bolle dovrebbero essere evitate, non perché potrebbero essere dannose per le cellule, ma perché le sacche d'aria potrebbero causare deformazioni durante la stampa e interferire con l'imaging dei costrutti. Due fonti comuni di bolle sono il vortice (microbolle nel supporto freddo che si espandono durante la ricottura del supporto a 37 °C) e il pipettaggio vigoroso.

Il supporto composito SHAPE in questo lavoro non è stato formulato come materiale sacrificale da rimuovere dopo la stampa, ma piuttosto come supporto biofunzionale a lungo termine sia per la differenziazione delle cellule staminali che per la crescita neuronale e la maturazione funzionale. Rispetto ai gel granulari che non sono ricotti post-stampa, la stabilità strutturale e la trasparenza del materiale composito SHAPE ricotto forniscono un ambiente protettivo per le delicate caratteristiche neuronali durante il processo di fissazione e immunomarcatura e, come tale, questo materiale facilita la caratterizzazione morfologica attraverso la visualizzazione degli antigeni. I reporter di fluorescenza potrebbero anche essere utilizzati per tracciare i cambiamenti nella morfologia cellulare nel tempo, nonché per monitorare la proliferazione e la migrazione cellulare all'interno del supporto di stampa ricotto. Inoltre, gli approcci di imaging del calcio potrebbero essere utilizzati per fornire informazioni sull'attività cellulare spontanea (ad esempio, l'attivazione di potenziali d'azione nei neuroni o anche l'attività sincrona della rete neuronale). Tuttavia, la stimolazione chimica dei costrutti cellulari ingegnerizzati (ad esempio, la stimolazione neuronale utilizzando KCl) potrebbe essere difficile a causa dello strato di idrogel che circonda le cellule, che rallenta la diffusione e impedisce la modulazione istantanea del microambiente cellulare. La stimolazione optogenetica rappresenta un'opzione migliore per il controllo dell'attività cellulare, poiché gli idrogel SHAPE non ostruiscono l'accesso ottico alle cellule.

Le sfere sensibili all'ossigeno potrebbero essere incorporate nel bioink o nel materiale di supporto (tramite stampa diretta o dispersione durante la preparazione del composito) per consentire la mappatura spaziale e temporale in tempo reale dei livelli di tensione dell'ossigeno all'interno e intorno ai costrutti stampati con alta sensibilit๳. Questo approccio non invasivo di mappatura dell'ossigeno 3D basato su misurazioni della durata della fosforescenza fornisce un percorso verso l'ingegneria dei costrutti tissutali con una migliore ossigenazione e probabilmente anche un migliore apporto di nutrienti. Una scarsa ossigenazione potrebbe portare alla formazione di regioni necrotiche all'interno dei costrutti stampati, interferire con la differenziazione delle cellule staminali e influenzare il metabolismo neuronale. La mappatura dell'ossigeno fornisce una lettura in base alla quale il design della stampa 3D potrebbe essere modificato per facilitare l'ossigenazione uniforme in tutto il costrutto, la messa a punto dei livelli di ossigeno per adattarsi alle condizioni fisiologiche o la generazione di gradienti di ossigeno.

I canali ingegnerizzati potrebbero anche essere incorporati all'interno del supporto di stampa ricottura stampando un inchiostro sacrificale, come la gelatina, che solidifica all'interno del bagno di supporto freddo ma può essere facilmente evacuato a 37 ° C ^4,13. I canali sarebbero necessari per fornire nutrienti e ossigeno a costrutti tissutali con alta densità cellulare o dimensioni che superano le capacità di un approccio di manipolazione della tensione dell'ossigeno basato sulla progettazione. Inoltre, i canali vascolari potrebbero essere sfruttati per creare gradienti di piccole molecole che guidano il modello dell'identità cellulare, modulano l'attività cellulare o guidano la chemiotassi.

In sintesi, la stampa 3D incorporata all'interno del composito SHAPE offre una piattaforma di materiali modulari facilmente adattabile e con un potenziale versatile per la modellazione funzionale di tessuti meccanicamente sensibili. Il protocollo qui presentato fornisce una spiegazione dettagliata dei passaggi necessari e dei principi di base necessari per generare il materiale di supporto e stampare l'inchiostro cellulare con alta fedeltà. L'approccio sfrutta materiali a prezzi accessibili e attrezzature accessibili, fornendo al contempo spazio per la personalizzazione dell'approccio alle esigenze e alle applicazioni dei singoli ricercatori.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe 1001 TLL	Hamilton	81320
Bioprinter 3D 3DDiscovery	RegenHU
Acido acetico	Sigma-Aldrich	A6283
AlbuMAX	ThermoFisher	11020021
Anticorpo secondario Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11001	Anti-topo delle capre
Ago smussato, Sterican (21 G)	Braun	9180109
Ago smussato (27 G)	Cellink	NZ5270505001
Software BioCAD	SolidWorks
Calcein AM	ThermoFisher	65-0853-39
Carbonato di calcio	Sigma-Aldrich	C5929
Dibutiril-cAMP sale sodico	Sigma-Aldrich	D0627
Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL)	R& Sistemi D	3440-100-01
DAPI	ThermoFisher	62248
DMEM/F-12, GlutaMAX	ThermoFisher	10565018
Siero dell'asino	Sigma-Aldrich	D9663
DPBS	ThermoFisher	14190094
EGF	R& Sistemi D	236-EG
FGF	R& Sistemi D	3718-FB
Soluzione formaldeide 4%, tamponata, pH 6,9	Sigma-Aldrich	100496
GDNF	R& Sistemi D	212-GD
Geltrex	ThermoFisher	A1569601
Glucosio	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES Buffer (1 M)	ThermoFisher	15630080
L-Alanine	Sigma-Aldrich	5129
L-Asparagina monoidrato	Sigma-Aldrich	A4284
Acido L-aspartico	Sigma-Aldrich	A9256
L-Glutamico acido	Sigma-Aldrich	G1251
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
Agitatore magnetico RET base	IKA	3622000
Supplemento N-2	ThermoFisher	17502048
Penicillina-Streptomicina	ThermoFisher	15140122
Strumento di dispersione S25N-10G	IKA	4447100
Algiato di sodio (80-120 cP)	FUJIFILM Wako	194-13321
Azida di sodio	Sigma-Aldrich	S2002
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S5761
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	S5881
Omogeneizzatore digitale ULTRA-TURAX T18	IKA	3720000
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Soluzione tripsina/EDTA	ThermoFisher	R001100
Anticorpo TUBB3	BioLegend	801213	Mouse
Gomma xantana	Sigma-Aldrich	G1253