Screening dei canali ionici nelle cellule tumorali

Le proteine di trasporto della membrana sono fondamentali per la comunicazione tra le cellule e per il mantenimento dell'omeostasi cellulare. Tra le proteine di trasporto di membrana, i canali ionici servono a guidare la crescita e lo sviluppo delle cellule e a mantenere lo stato delle cellule in ambienti difficili e mutevoli. È stato anche riportato che i canali ionici guidano e supportano lo sviluppo di tumori solidi, sia a livello sistemico che nel sistema nervoso centrale (SNC)^1,2. Ad esempio, i canali KCa3.1 sono responsabili della regolazione del potenziale di membrana e del controllo del volume cellulare, che è importante nella regolazione del ciclo cellulare. È stato riportato che i canali difettosi di KCa3.1 contribuiscono alla proliferazione anormale delle cellule tumorali³. Inoltre, i canali ionici possono contribuire alla diffusione metastatica dei tumori. I canali del potenziale recettore transitorio (TRP), ad esempio, sono coinvolti nell'afflusso di Ca 2+ e Mg²⁺; Questo afflusso attiva diverse chinasi e proteine da shock termico che funzionano per regolare la matrice extracellulare che circonda un tumore, che è, a sua volta, importante per iniziare le metastasi del cancro⁴.

Poiché i canali ionici possono contribuire allo sviluppo di tumori, possono anche essere obiettivi per il trattamento del cancro correlato ai farmaci. Ad esempio, la resistenza alle modalità di trattamento, compresa la chemioterapia e la nuova immunoterapia, è correlata alla disregolazione della funzione dei canali ionici ^5,6,7. Inoltre, i canali ionici stanno emergendo come importanti bersagli farmacologici per impedire la crescita e lo sviluppo dei tumori, con farmaci a piccole molecole riproposti (approvati dalla FDA) in fase di esame, nonché biopolimeri, compresi gli anticorpi monoclonali 1,2,8,9. Mentre ci sono stati molti progressi su questo fronte, la scoperta di farmaci per il cancro del canale ionico rimane sottosviluppata. Ciò è in parte dovuto alle sfide uniche dello studio dei canali ionici nelle cellule tumorali. Ad esempio, ci sono limitazioni tecniche nella creazione di saggi elettrofisiologici per composti ad azione lenta e differenze temporali nell'attivazione del canale e nell'azione del farmaco. Inoltre, la solubilità dei composti può anche impedire il progresso, poiché la maggior parte dei sistemi di elettrofisiologia automatizzati comunemente in uso oggi utilizzano substrati idrofobici, che possono contribuire agli artefatti a seguito dell'adsorbimento dei composti. Inoltre, le grandi terapie molecolari bioorganiche come prodotti naturali, peptidi e anticorpi monoclonali sono tecnicamente difficili da esaminare utilizzando saggi elettrofisiologici convenzionali¹⁰. Infine, le proprietà bioelettriche delle cellule tumorali rimangono poco conosciute¹¹.

Nel frattempo, la colorazione a immunofluorescenza dei canali ionici è spesso impegnativa. Ciò è dovuto, in parte, alla complessità delle loro strutture e del loro contesto nella membrana, che influiscono sulla capacità di generare e impiegare anticorpi per gli studi di microscopia. È particolarmente importante che gli anticorpi utilizzati per colorare i canali ionici siano convalidati per specificità, affinità e riproducibilità. Gli anticorpi commerciali per i canali ionici dovrebbero essere presi in considerazione sulla base della loro strategia di convalida e del record di pubblicazione. Gli esperimenti dovrebbero includere controlli negativi per dimostrare la mancanza di legame non specifico mediante knockdown o knockout della proteina bersaglio. In alternativa, le linee cellulari in cui la proteina bersaglio è assente o in bassa abbondanza sulla base di mRNA o determinazioni proteiche possono servire come controlli negativi. Ad esempio, questo studio mostra la localizzazione della subunità del recettore (GABA) Gabra5 in una linea cellulare di medulloblastoma (D283). Le cellule D283 con un knockdown di siRNA e le cellule Daoy, un'altra linea cellulare di medulloblastoma cerebellare, sono state colorate per Gabra5 e non hanno mostrato alcuna colorazione apprezzabile (dati non mostrati).

Qui vengono presentati metodi per analizzare e saggiare la funzione dei canali ionici, nonché l'effetto dei modulatori dei canali ionici sulle cellule tumorali. Sono previsti protocolli per (1) colorare le cellule per un canale ionico, (2) testare lo stato polarizzato dei mitocondri, (3) stabilire la funzione del canale ionico usando l'elettrofisiologia e (4) convalidare il farmaco in vitro. Questi protocolli enfatizzano gli studi del recettore dell'acido gamma-aminobutirrico di tipo A (GABA_A) 2,12,13,14,15,16^, un canale anionico cloruro e il principale recettore inibitorio dei neurotrasmettitori. Tuttavia, i metodi qui presentati si applicano allo studio di molte altre cellule tumorali e canali ionici.

1. Immunomarcatura dei canali ionici in cellule in coltura

1. Preparazione delle celle e set-up sperimentale
   1. Mantenere le cellule come una coltura in crescita attiva in boccette di coltura da 75 cm² . Far passare le cellule una volta fino a quando non diventano confluenti al 50% -90%, a seconda del tempo di raddoppio della linea cellulare utilizzata.
      NOTA: Per il presente studio sono state utilizzate cellule D283, una linea cellulare di medulloblastoma del gruppo 3.
   2. Raccogliere le cellule dal pallone di coltura in una provetta da centrifuga (15 ml o 50 ml) e aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA allo 0,25% per staccare le cellule aderenti. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Dopo 5 minuti, picchiettare il pallone da tre a cinque volte per aiutare a staccare le celle. Raccogliere le cellule in 10 ml di terreno con FBS al 10% per fermare l'azione della tripsina.
   3. Centrifugare a 480 x g per 5 minuti a RT. Aspirare delicatamente il mezzo. Non disturbare il pellet cellulare.
   4. Risospendere le cellule in 5 ml a 10 ml di terreno, a seconda della densità della coltura.
      NOTA: La densità deve essere coerente con le cellule in crescita attiva e dipende dalla confluenza delle cellule nel pallone. La valutazione visiva deve essere utilizzata per approssimare la densità cellulare ottimale; In particolare, le cellule dovrebbero essere tra il 40% e il 90% confluenti e distribuite uniformemente.
   5. Rimuovere 100 μL di cellule e aggiungere a un tubo da 1,5 mL contenente 100 μL di blu tripano allo 0,4% per contrassegnare le cellule non vitali. Incubare 5-15 minuti a RT, a seconda della linea cellulare.
   6. Contare manualmente le cellule utilizzando un emocitometro (vedere la Tabella dei materiali) in 10 μL di soluzione. Contare le cellule vive e non colorate in ciascuno dei quattro angoli dei 16 quadrati dell'emocitometro. Moltiplicare il numero medio di cellule per il fattore di diluizione e per 10.000 per ottenere le cellule per millilitro (cellule / ml). In alternativa, è possibile utilizzare un contatore automatico di celle.
   7. Diluire le cellule a 1 x 10⁵ cellule/ml nel terreno di coltura specificato per ciascuna linea cellulare. Sementi 1. 8 ml di celle in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenente un coprislip di 22 mm x 22 mm pre-rivestito con 0,1 mg/ml di poli-D-lisina secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: Si potrebbe voler testare l'uso di poli-D-lisina e poli-L-lisina, in quanto vi sono segnalazioni di preferenze specifiche della linea cellulare^17,18. Alcune linee cellulari hanno proteasi che possono abbattere la poli-L-lisina, mentre ci sono rapporti che la poli-D-lisina è tossica per alcune linee cellulari. Al contrario, le cellule neuronali, come PC12, sono state segnalate per essere più sane sulle superfici poli-D-lisina.
   8. Far crescere le cellule in un incubatore con un ambiente umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C durante la notte per consentire alle cellule di attaccarsi al vetrino. Esaminare l'attaccamento delle cellule al microscopio invertito con un obiettivo 20x.
      NOTA: Le cellule devono essere completamente attaccate al vetrino prima del trattamento o dell'immunocolorazione diretta. In questo momento, le cellule possono essere trattate con farmaci (o controllo del veicolo) mediante l'aggiunta di uno stock concentrato (ad esempio, 600 μL di una soluzione madre 4x) o la sostituzione del mezzo con terreno fresco contenente il farmaco alla concentrazione desiderata 1x; Le celle possono quindi essere restituite all'incubatore per un massimo di ulteriori 48 ore. Le cellule trattate con solvente sono incluse per valutare gli effetti del farmaco sul livello e sulla localizzazione della molecola bersaglio. Nel presente studio, le cellule D283 sono state trattate con 600 μL di una soluzione da 3,2 μM di un modulatore allosterico positivo al recettore GABA_A , QH-II-066¹⁴ (vedere la Tabella dei Materiali), per 48 ore. Le cellule di controllo sono state trattate con un volume equivalente di DMSO.
2. Preparazione per l'immunomarcatura: fissazione, permeabilizzazione e blocco
   1. Risciacquare le celle con 2,5 mL di 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2 mMKH₂PO₄, vedere la Tabella dei materiali) e aspirare immediatamente la soluzione.
   2. Fissare le cellule usando 1 mL di PFA al 4% in 1x PBS per 1 ora a RT.
      NOTA: Mentre il 4% di PFA è il fissativo standard per l'immunocolorazione, la glutaraldeide o il gliossale possono anche essere usati per fissare le proteine di membrana per l'immunofluorescenza. I metodi di fissazione a base alcolica, come i trattamenti con metanolo ghiacciato, possono portare a una morfologia meno ben conservata e ad una perdita di proteine di membrana^19,20.
   3. Lavare sei volte con 2,0 ml di 1x PBS (5 minuti per lavaggio) agitando su uno shaker. Incubare per 1 ora a RT in un tampone bloccante composto da 1x PBS con 0,8% Triton X-100 e 10% di siero normale corrispondente alla specie ospite dell'anticorpo primario (in alternativa, il 3% di BSA o l'albumina della frazione sierica bovina V possono essere utilizzati al posto del siero normale).
      Nota : questo passaggio viene utilizzato per bloccare l'associazione non specifica.
3. Immunomarcatura
   NOTA: Dopo aver aggiunto gli anticorpi coniugati ai fluorofori, le misurazioni devono essere prese presto per prevenire il fotosbiancamento. Le incubazioni con anticorpi coniugati devono essere protette dalla luce. L'uso di un mezzo di montaggio che contiene agenti che eliminano i radicali liberi ridurrà il fotosbiancamento. Conservare i vetrini in un contenitore opaco a tenuta di luce (a 4 °C) dopo aver sigillato i vetrini. Durante l'imaging, il fotosbiancamento può essere ridotto al minimo limitando l'intensità dell'illuminazione di eccitazione e i tempi di esposizione.
   1. Preparare una camera umidificata foderando il fondo di una capsula di coltura da 150 mm con carta da filtro. Inumidire la carta da filtro con acqua distillata sterile. Disegnare una griglia 3 x 2 su un pezzo di pellicola da laboratorio tagliata per adattarla alla parte superiore della carta da filtro ed etichettarla per preservare l'orientamento dei vetrini nella piastra a 6 pozzetti. Posizionare il film di laboratorio sopra la carta da filtro, esponendo i bordi superiore e inferiore per umidificare la camera.
   2. Preparare 100 μL per copricostume della diluizione desiderata dell'anticorpo primario in 1x PBS con BSA al 3%. Per rilevare il prodotto proteico del gene GABRA , utilizzare l'anticorpo primario monoclonale ricombinante di coniglio ad una diluizione di 1:200 (anticorpo Gabra5, regione centrale; vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: Per determinare empiricamente la concentrazione di anticorpi primari che produce il segnale ottimale sullo sfondo, utilizzare una serie di diluizioni dell'anticorpo primario mantenendo costante la concentrazione secondaria. Si raccomandano diluizioni di 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 e 1:1.000 per stabilire concentrazioni ottimali di anticorpi primari.
   3. Trasferire il coprislip dalla soluzione di blocco nella piastra a 6 pozzetti nella posizione corretta sulla griglia disegnata sul film di laboratorio. Eliminare la soluzione a blocchi dalla piastra a 6 pozzetti e conservare la piastra per le fasi di lavaggio.
   4. Aggiungere con cautela 100 μL di anticorpo primario diluito al centro di ciascun vetrino. Evitare di posizionare la soluzione sul bordo del vetrino. Incubare per 1 ora a RT.
   5. Aggiungere 2,5 ml di 1x PBS a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Riportare il coprislip nella posizione appropriata nella piastra a 6 pozzetti.
   6. Eseguire sei lavaggi per 5 minuti ciascuno con 2,5 ml di 1x PBS.
      NOTA: Non lasciare asciugare i coperchi durante le fasi di risciacquo, poiché ciò può contribuire a un segnale di fluorescenza di fondo.
   7. Riportare i vetrini nella posizione corretta sulla pellicola di laboratorio. Per ogni vetrino, aggiungere 100 μL di anticorpo secondario diluito in 1x PBS + 1%-5% BSA.
      NOTA: Inizialmente, gli anticorpi secondari coniugati ad Alexa Fluor 488 (vedere la Tabella dei materiali) vengono utilizzati con una diluizione 1:1.000 in 1x PBS + 3% BSA. La concentrazione di anticorpi secondari può essere ottimizzata aumentando la concentrazione per rilevare proteine bersaglio a bassa abbondanza o diminuendo la concentrazione per ridurre lo sfondo, se necessario.
   8. Per i passaggi rimanenti, ridurre al minimo l'esposizione alla luce per evitare il fotosbiancamento dell'anticorpo secondario coniugato. Coprire il piatto di coltura con un foglio di alluminio e incubare per 1 ora a RT.
   9. Trasferire nuovamente i coperchi sulla piastra a 6 pozzetti. Utilizzando uno shaker, eseguire sei lavaggi per 5 minuti ciascuno con 2,5 ml di 1x PBS. Rimuovere il PBS capovolgendo la piastra sopra il lavandino o un contenitore di rifiuti. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare il PBS nel pozzetto per facilitare la rimozione del coprivetrino.
   10. Etichettare un vetrino da microscopio per ogni vetrino. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio contenente glicerolo con DAPI (per colorare i nuclei) (vedere la tabella dei materiali) al centro della diapositiva.
   11. Usando una pinza, rimuovere il coprislip dal pozzetto e posizionarlo delicatamente sulla goccia del supporto di montaggio al centro della diapositiva.
       NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria nel mezzo di montaggio.
   12. Utilizzare piccoli pezzi di carta da filtro per rimuovere il supporto di montaggio in eccesso. Sigillare i bordi della copertina con lo smalto per unghie e lasciare asciugare completamente lo smalto prima dell'imaging. Conservare i vetrini a 4 °C in una scatola di plastica opaca.
4. Imaging e analisi
   1. Acquisire immagini con un microscopio a fluorescenza sotto un obiettivo 40x con olio ad immersione (vedere la Tabella dei materiali).
   2. Visualizza le immagini a fluorescenza con i filtri appropriati.
   3. NOTA: per Alexa Fluor 488, utilizzare un'eccitazione/emissione di 496 nm/519 nm; per DAPI, utilizzare un'eccitazione/emissione di 358 nm/461 nm.
   4. Acquisire e salvare i file di immagine digitale. Un valore di binning di 4 x 4 viene utilizzato per facilitare i tassi di raccolta delle immagini e ridurre lo sfondo.
   5. Prepara le immagini finali. Le immagini possono essere elaborate con ImageJ o software disponibile in commercio. I risultati sono illustrati nella Figura 1.

2. Test dello stato polarizzato dei mitocondri

NOTA: Questo protocollo utilizza il saggio TMRE (tetrametilrhodamina, estere etilico) per marcare il potenziale di membrana nei mitocondri attivi, mantenendo una carica negativa^21,22. La TMRE è un colorante permeabile alle cellule, rosso-arancio, caricato positivamente che si accumula nei mitocondri attivi a causa della loro carica negativa relativa. I mitocondri inattivi o depolarizzati hanno ridotto il potenziale di membrana e non riescono a sequestrare proporzionalmente la TMRE. FCCP (carbonil cianuro 4-[trifluorometossi] fenilidrazone), un disaccoppiatore ionoforo di fosforilazione ossidativa (OXPHOS), depolarizza le membrane mitocondriali, impedendo così l'accumulo e il sequestro di TMRE²³. Ciò è illustrato nella Figura 2.

1. Preparazione delle celle e set-up sperimentale
   1. Mantenere le cellule in boccette di coltura da 75 cm² . Aspirare il terreno di coltura e risciacquare le cellule con 1x PBS senza calcio e magnesio.
   2. Aggiungere 2 ml di tripsina-EDTA allo 0,25% per staccare le cellule aderenti. Incubare per 5 minuti a RT e risospendere le cellule in 10 ml di mezzo.
   3. Raccogliere le cellule dal pallone di coltura in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare a 480 x g per 5 minuti a RT. Aspirare il mezzo.
   4. Risospendere le cellule in 5 ml a 10 ml di terreno, a seconda della confluenza originale della coltura, in modo che la concentrazione cellulare sia di 50-100 cellule per quadrato sull'emocitometro. Regolare il volume, se necessario, per fornire la densità di cella necessaria per un conteggio accurato.
   5. Rimuovere 100 μL di cellule e aggiungere a un tubo da 1,5 mL contenente 100 μL di blu tripano allo 0,4%. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico delle cellule. Diluire le cellule a 3 x 10⁴ cellule/ml in terreno di coltura senza rosso fenolo.
      NOTA: viene utilizzato un mezzo DMEM privo di rosso fenolo perché l'esposizione al rosso fenolo inibisce la permeabilità della membrana e può contribuire all'autofluorescenza di fondo.
   6. Seminare 2,5 ml della sospensione cellulare (75.000 cellule) per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti contenente un coprislip di 22 x 22 mm pre-rivestito con poli-D-lisina secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
   7. Far crescere le cellule in un'incubatrice con CO₂ umidificata al 5% a 37 °C durante la notte per consentire alle cellule di attaccarsi al vetrino.
   8. Esaminare l'attaccamento delle cellule al microscopio invertito con un obiettivo 20x. Le celle devono essere completamente attaccate al coprislip prima di procedere ulteriormente.
2. Preparazione delle soluzioni stock
   1. Per preparare una soluzione madre da 1 mM (1.000x) di TMRE (MW = 514,96 g/mol) (vedere la Tabella dei Materiali), sciogliere 1 mg di TMRE in 1,94 mL di DMSO. Aliquote e conservare a −20 °C al riparo dalla luce. Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento.
   2. Per preparare una soluzione madre da 50 mM (2.500x) di FCCP (MW = 254,17 g/mol) (disaccoppiatore di fosforilazione ossidativa mitocondriale), sciogliere 10 mg di FCCP in 786,9 μL di DMSO. Aliquote e conservare a −20 °C al riparo dalla luce. Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento.
   3. NOTA: Le soluzioni madre preparate fanno parte del kit TMRE Mitochondrial Membrane Potential Assay (vedere la Tabella dei materiali).
3. Determinazione della concentrazione TMRE per le linee cellulari
   1. Preparare una soluzione TMRE funzionante da 500 nM in terreno di coltura cellulare. Proteggere la soluzione di lavoro dalla luce.
   2. Aggiungere TMRE alle cellule coltivate sui vetrini di copertura in un intervallo di concentrazione medio-finale compreso tra 50-200 nM. A tale scopo, aspirare prima il terreno di coltura e sostituirlo con terreno di coltura contenente TMRE.
   3. Incubare per 20 min a 37 °C. Assicurarsi di scaglionare i tempi di trattamento per consentire l'imaging, poiché le cellule vengono visualizzate dal vivo.
   4. Lavare le cellule due volte con 1x PBS e capovolgere il vetrino su un vetrino da microscopio etichettato con la concentrazione finale di TMRE.
   5. Visualizzare immediatamente le cellule vive (picco E_x/E_m = 549 nm/575 nm).
      NOTA: Visualizzare immediatamente i campioni una volta rimossi dalle condizioni di coltura, poiché la salute mitocondriale è compromessa una volta che le cellule vengono rimosse dal mezzo e posizionate su un vetrino da microscopio. In alternativa ai coprifogli, le celle possono essere visualizzate in piatti con fondo di vetro.
   6. Cattura le immagini utilizzando il microscopio e il software disponibili.
      NOTA: Stabilire i parametri di imaging della microscopia sperimentale durante il processo di ottimizzazione della concentrazione TMRE e mantenere le stesse condizioni negli esperimenti successivi per garantire un confronto accurato dei dati. Il protocollo dettagliato impiegava un microscopio confocale e un software compatibile (vedi la tabella dei materiali).
   7. Selezionare la concentrazione ottimale di TMRE, che dipende dalla linea cellulare.
      NOTA: La concentrazione di TMRE che fornisce il segnale migliore per risolvere i cambiamenti nei livelli mitocondriali di TMRE è generalmente la concentrazione di TMRE più bassa, fornendo un segnale di fluorescenza uniforme e facilmente rilevabile.
4. Test dello stato polarizzato di una cella
   1. Preparazione del saggio
      1. Preparare le soluzioni madre di trattamento alle concentrazioni desiderate e preparare i terreni con la concentrazione finale del composto da analizzare. Per FCCP, la soluzione madre deve essere di 20 mM (preparata con DMSO da una soluzione madre da 50 mM).
      2. Lavorando su un singolo vetrino alla volta, aggiungere 1,8 ml di terreno più il composto in esame alle cellule.
      3. Incubare le cellule con il composto in esame a 37 °C e 5% di CO₂ in ambiente umidificato per il periodo di tempo desiderato.
         NOTA: I tempi di trattamento variano a seconda del meccanismo attraverso il quale il composto in esame può alterare il potenziale della membrana mitocondriale. Protonofori potenti come FCCP che depolarizzano rapidamente e direttamente i potenziali di membrana mitocondriale richiedono un'analisi poco dopo il trattamento (in pochi minuti). Al contrario, gli effetti del trattamento con composti che influenzano indirettamente la funzione della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali, come quelli che alterano l'attivazione delle proteine o il turnover proteico o richiedono la sintesi proteica, possono richiedere più tempo per mostrare un effetto.
      4. Durante l'incubazione, accendere il microscopio e impostarlo sui parametri di imaging ottimali predeterminati, inclusi in termini di guadagno, intensità laser, velocità di acquisizione dell'immagine, media e tempo di esposizione.
      5. Dopo il periodo di trattamento farmacologico, aggiungere 200 μL di TMRE 10x (concentrazione ottimale determinata sopra) alle cellule di controllo e trattate con farmaco.
      6. Incubare per 15-30 minuti a 37 °C in CO 2 al 5_{% in ambiente} umidificato. Aspirare delicatamente il mezzo e risciacquare le cellule una volta con 1x PBS.
      7. Ripetere la fase di risciacquo 1x PBS per evitare lo sfondo causato dal terreno di coltura cellulare o dai composti di trattamento e capovolgere il vetrino su un vetrino da microscopio etichettato con le condizioni di trattamento.
      8. Immagine le cellule vivono a E_x/E_m = 549 nm/575 nm. Utilizzando un microscopio confocale, raccogliere diversi campi z-stack con acquisizione di immagini ad alta velocità (512 pixel x 512 pixel, media = 4) prima della perdita dell'integrità cellulare.
      9. Salvare e memorizzare il file di immagine per l'analisi. La procedura viene ripetuta per la successiva condizione sperimentale.
   2. Controlli sperimentali
      1. Utilizzare un controllo senza trattamento (negativo), eseguito come descritto sopra (fasi 3.1.1-3.1.8), privo del composto in esame nel mezzo.
      2. Utilizzare un controllo di potenziale interruzione della membrana mitocondriale (positivo) costituito dal composto protonoforo FCCP. Aggiungere 1,8 mL di FCCP da 20 μM (vedere la Tabella dei materiali) nel mezzo alle celle. Come descritto sopra (fasi 3.1.1-3.1.2; e imaging cellulare, come descritto nelle fasi 3.1.3-3.1.8), incubare per 10 minuti a 37 °C in 5 % di CO₂ in un ambiente umidificato prima della colorazione con TMRE.
         NOTA: per questi esperimenti sono necessari controlli sia positivi che negativi.
   3. Quantificazione
      1. Misura le intensità dei pixel catturate delle singole celle da una singola immagine rappresentativa dalla regione centrale di ogni z-stack. In questo lavoro, è stato selezionato un singolo piano di messa a fuoco per facilitare l'analisi.
      2. Analizza le intensità dei pixel di almeno 30 celle (nella loro interezza) per trattamento. Usa Excel o Prism per calcolare la media delle intensità dei pixel per ogni trattamento e presenta in formato grafico a barre con l'errore standard della media.
         NOTA: ImageJ può essere utilizzato anche per la quantificazione della fluorescenza. In alternativa, la fluorescenza della colorazione TMRE può essere quantificata con piattaforme software commerciali.

3. Stabilire la funzione dei canali ionici usando l'elettrofisiologia

NOTA: La procedura descritta in questa sezione descrive l'uso di un saggio elettrofisiologico automatizzato per lo screening di composti di test in una linea cellulare tumorale (Figura 3).

1. Preparazione delle celle
   1. Raccogliere cellule da una coltura sana che manca di cellule morte e / o crescita eccessiva cellulare. Utilizzare la soluzione di distacco di cellule chimiche TrypLE o un raschiatore manuale per raccogliere cellule aderenti e raggruppate. Dissociare le cellule che crescono in grumi o sfere, che sono particolarmente comuni tra le cellule tumorali del SNC.
      NOTA: La dissociazione delicata delle cellule aiuta a mantenere l'integrità delle proteine di membrana essenziali per la conduttanza ionica.
   2. Centrifugare le cellule a 561 x g per 10 minuti a RT. Scartare il surnatante e sospendere il pellet in DMEM (senza rosso fenolo), HEPES e penicillina / streptomicina con 20% FBS e 4 mM L-glutammina (vedere la tabella dei materiali) mantenuti a 37 ° C.
      NOTA: viene utilizzato un mezzo DMEM privo di rosso fenolo perché l'esposizione al rosso fenolo inibisce la permeabilità della membrana.
   3. Placcare le celle su un coprislip rivestito di poli-L-lisina a bassa densità, in modo che ci sia separazione tra le singole celle.
      NOTA: La poli-L-lisina viene utilizzata qui, e non la poli-D-lisina, poiché la poli-L-lisina ha migliori proprietà di rivestimento.
   4. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO₂ in una camera umidificata per 12 ore a 24 ore (sarà necessario stabilire un tempo ottimale) prima di effettuare una registrazione.
2. Registrazione elettrofisiologica
   1. Rimuovere il supporto dai coperchi. Lavare delicatamente le celle due volte con 1x PBS. Aggiungere ~300 μL di soluzione di TrypLE. Utilizzando la pipetta, pipettare delicatamente su / giù da quattro a cinque volte fino a staccare le celle.
   2. Aggiungere il mezzo senza siero (DMEM) (senza rosso fenolo) e mantenere un conteggio finale delle cellule per volume di almeno 1 milione di cellule / ml. Utilizzando una pipetta da 1 ml, declutterare le cellule per ottenere una sospensione cellulare priva di cluster di cellule.
   3. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1 ml. Incubare le cellule a 4 °C per 10 minuti per stabilizzare la membrana cellulare. Mantenere le cellule in rotazione su uno shaker (ciclo delicato) per evitare la formazione di grumi cellulari.
   4. Preparare la configurazione di Port-a-Patch (vedere la tabella dei materiali). Accendere il computer, l'amplificatore e il sistema di perfusione. Aprire il software Patch-Master e creare un nuovo file.
   5. Portare i tamponi (extracellulari e interni) a RT, quindi caricare i tamponi nei rispettivi tubi di perfusione.
      NOTA: Le registrazioni del recettore GABA_A richiedono sia una "soluzione extracellulare (bagno)" contenente 161 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES e 6 mM D-glucosio (pH regolato a 7,4 utilizzando NaOH) e una "soluzione interna" contenente 120 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, e 10 mM HEPES (pH regolato a 7,2 utilizzando NaOH).
   6. Riempire il fondo di un chip dell'elettrodo (fornito dal produttore) con 5 μL di soluzione interna e posizionare il chip dell'elettrodo sulla parte superiore di Faraday del Port-a-Patch. Aggiungere 10 μL di soluzione esterna al chip e osservare l'impulso rettangolare sull'oscilloscopio utilizzando il software Patch-Master (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: La resistenza può essere nell'intervallo di 2-3 MΩ, ma dipende dalla linea cellulare.
   7. Inizia a registrare una volta che l'impulso rettangolare è visibile, dopo le regolazioni elettroniche iniziali e dopo che il software ha richiesto all'utente di aggiungere celle.
   8. Aggiungere delicatamente 20 μL di sospensione a cella singola sulla parte centrale dell'elettrodo e attendere la patch della cella seguita da una guarnizione Giga-Ohm osservando i valori di resistenza nel software.
   9. L'avanzamento in tempo reale del patching delle celle può essere osservato sulla colonna di sinistra del software. Una volta che la cella è "mantenuta in modalità cella intera", inizia le registrazioni aprendo un protocollo all'interno del software.
   10. Impostare il potenziale di mantenimento a -80 mV. Eseguire un protocollo di registrazione continua senza interruzioni utilizzando il software Patch-Master per registrare la corrente dalla cella.
   11. Ottenere una linea di base stabile e passare a un ligando e alla rispettiva applicazione composta per una durata specificata utilizzando la scheda di perfusione automatica sul pannello di sinistra del software.
   12. Acquisire dati utilizzando il software Patch-Master.
       NOTA: i dati sono filtrati passa-basso a 1 kHz e digitalizzati a 100 kHz.
   13. Esegui l'analisi dei dati calcolando l'ampiezza massima della risposta corrente utilizzando il software Nest-o-Patch (vedi la tabella dei materiali).

4. Potenza in vitro

NOTA: Questa procedura descrive in dettaglio un test MTS per determinare la potenza del farmaco. Il test di proliferazione cellulare One Solution combina tutti i reagenti di analisi necessari in una soluzione preparata che può essere aggiunta in un'unica fase ai pozzetti di coltura cellulare per valutare la vitalità e la proliferazione cellulare dopo il trattamento con composti sperimentali. Il reagente viene ricostituito secondo le raccomandazioni del produttore (vedere la tabella dei materiali), aliquotato e conservato a -20 °C. La sezione descrive l'uso del saggio per determinare l'IC₅₀ dei composti in esame in una particolare linea cellulare (Figura 4). Questo reagente MTS può essere utilizzato anche per lo screening ad alta produttività di un gran numero di composti a concentrazioni note.

1. Preparazione delle celle
   NOTA: Il numero di cellule dipende dalla crescita e dal metabolismo di ogni singola linea cellulare. Determinare sperimentalmente il numero ottimale di cellule prima di utilizzare il test per valutare eventuali trattamenti sperimentali.
   1. Raccogliere cellule aderenti dalla coltura mediante tripsinizzazione e utilizzare Accutase (vedere la tabella dei materiali) per dissociare le cellule che crescono in grumi o sfere.
      NOTA: Il glioblastoma e le linee cellulari di medulloblastoma primario spesso richiedono Accutase in quanto tendono a crescere in grumi o sfere.
   2. Contare le cellule e creare una soluzione cellulare con 10.000 cellule per pozzetto in un volume di 75 μL. Effettuare diluizioni del materiale per i numeri di cella da testare. Preparare almeno 1 mL per diluizione.
   3. Piastra 75 μL di ogni diluizione in serie di cinque pozzetti consecutivi in una piastra da 96 pozzetti. Incubare a 37 °C e 5% di CO₂ durante la notte in un ambiente umidificato (cioè un incubatore).
      NOTA: Le linee cellulari con crescita lenta o metabolismo (che acidificano il loro mezzo di crescita in più di 3 giorni) possono richiedere più di 10.000 cellule come intervallo di numero di cellule superiori, mentre le linee cellulari che crescono rapidamente (generalmente più velocemente di 20 ore di tempo di raddoppio) richiedono meno cellule. Le linee cellulari con un metabolismo elevato possono richiedere meno di 1.000 cellule per pozzetto. L'intervallo di celle può essere regolato per determinare la densità di placcatura ottimale per il test MTS per queste linee cellulari.
2. Controllo del trattamento simulato
   1. Aggiungere 25 μL di terreno per pozzetto per simulare l'aggiunta del composto in esame nel saggio MTS.
      NOTA: Nel test MTS effettivo, 25 μL di uno stock 4x della concentrazione di trattamento scelta per il composto in esame (qui un modulatore del recettore GABA_A , QH-II-066) saranno aggiunti alle cellule per dare la concentrazione finale di trattamento 1x in un volume totale di 100 μL per pozzetto.
   2. Incubare a 37 °C e 5 % di CO₂ in ambiente umidificato per 48 ore. Questo simula l'incubazione standard in presenza di un farmaco.
3. Saggio MTS
   1. Scongelare le aliquote richieste del reattivo MTS. Aggiungere 20 μL di reagente MTS per pozzetto. Incubare a 37 °C e 5 % CO₂ in ambiente umidificato per 1 ora.
   2. Centrifugare la piastra (1.350 x g per 5 minuti) a temperatura ambiente per rimuovere le bolle, che possono interferire con la lettura dell'assorbanza.
      NOTA: Rimuovere eventuali bolle con un ago di calibro fine.
   3. Leggere l'assorbanza a 490 nm. Salvare i dati come file Excel.
   4. Riportare le piastre a 37 °C in CO 2 al 5% e leggere ripetutamente entro il periodo di intervallo lineare di 4 ore del test.
      NOTA: Non è necessario centrifugare nuovamente prima di leggere l'assorbanza. I dati provenienti da letture successive, in particolare la lettura di 2 ore, possono essere importanti per esaminare quanto velocemente una linea cellulare metabolizza il reagente MTS e sono utili per selezionare il numero di cellule nella piastra per il test.
   5. Tracciare la densità ottica di assorbanza (OD) a 490 nm (OD₄₉₀) rispetto al numero di cella placcato utilizzando Excel o Prism.
   6. Selezionare il numero di cella per il test. Il numero ottimale di celle sarà nell'intervallo lineare e al di sotto della saturazione (OD₄₉₀ = 1).
      NOTA: Per le cellule con crescita lenta, il numero più alto di cellule placcate può essere regolato a 20.000 cellule per pozzetto e 500 cellule per pozzetto possono essere lasciate fuori dal test.
4. Determinazione dell'IC₅₀
   1. Giorno 1: Placcare le celle per il test MTS
      1. Registrare il nome della linea cellulare e il numero di passaggio di ciascuna linea nello studio. Per contrastare l'evaporazione durante il test, come minimo, riempire le file perimetrali esterne superiore e inferiore e le colonne perimetrali sinistra e destra finali della piastra a 96 pozzetti con 1x PBS, 100 μL per pozzetto, per contrastare l'evaporazione durante il test.
      2. Placcare il numero ottimale di celle per ciascuna linea cellulare come determinato prima dell'inizio del test. Placcare le cellule in 75 μL per pozzetto di terreno privo di rosso fenolo e privo di antibiotici che non contiene tampone HEPES. L'FBS può essere aumentato al 20% per supportare la crescita delle linee cellulari.
         NOTA: Viene utilizzato un mezzo privo di rosso fenolo perché l'esposizione al rosso fenolo inibisce la permeabilità della membrana.
      3. Placcare il campione almeno quintuplicando per la concentrazione del trattamento. Contare le cellule utilizzando un emocitometro manuale o automatico.
         NOTA: Per utilizzare un emocitometro manuale, (1) preparare una diluizione 1:1 delle cellule risospese in mezzo in tripano blu; (2) incubare 5-15 minuti, a seconda della linea cellulare; (3) caricare 10 μL delle cellule in blu tripano nella camera di conteggio dell'emocitometro; (4) contare le celle vitali nei quattro angoli e nei quadrati centrali e determinare il numero medio di celle per quadrato; (5) Calcolare le cellule vitali per millilitro come segue:
         Cellule vitali per mL = cellule vitali medie × 2 (fattore di diluizione) × 10⁴
      4. Utilizzare un volume sufficiente per preparare la concentrazione desiderata di cellule in terreno privo di rosso fenolo e privo di antibiotici che non contiene tampone HEPES (cioè 75 μL per pozzetto x 60 pozzetti per piastra = 4,5 ml di cellule per piastra).
         NOTA: ogni piastra deve avere un controllo solo medio per la sottrazione dello sfondo. Il controllo del mezzo può sostituire i pozzetti PBS, se necessario.
   2. Giorno 2: Aggiunta del composto di trattamento
      1. Preparare i trattamenti sperimentali a 4 volte la concentrazione finale desiderata per ottenere la concentrazione finale desiderata quando 25 μL di soluzioni di trattamento vengono aggiunti a cellule placcate in 75 μL di mezzo (= 100 μL di volume totale per pozzetto).
      2. Preparare le soluzioni di prova (in questo caso, il modulatore del recettore GABA_A QH-II-066) mediante diluizione seriale delle scorte ad alta concentrazione. Ad esempio, se le concentrazioni finali del farmaco devono essere 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM e 0,3125 μM, preparare diluizioni seriali 1:1 che iniziano con 20 μM per ottenere concentrazioni rispettivamente di 10 μM, 5 μM, 2,5 μM e 1,25 μM.
         NOTA: Ogni piastra richiede due controlli basati su cellule oltre al controllo solo terreno: cellule non trattate (solo mezzo) e cellule trattate con solvente (spesso DMSO) a una concentrazione nota. È buona norma assicurarsi che il veicolo non influenzi la proliferazione cellulare nel range attivo del composto.
      3. Una volta aggiunto il composto in esame, incubare le cellule a 37 °C e al 5% di CO₂ in ambiente umidificato per 48 ore.
   3. Giorno 3: Esecuzione del test di proliferazione cellulare (MTS)
      1. Calcolare il volume di reagente MTS necessario (20 μL per 100 μL di coltura di prova) e scongelare il volume richiesto di reagente MTS aliquotato (vedere la Tabella dei materiali).
      2. Vortex, e assicurarsi che il reagente sia completamente in soluzione prima dell'uso. Pipet il reagente scongelato in un serbatoio sterile di reagente da 25 ml.
      3. Pipet 20 μL di reagente MTS (utilizzando una pipetta multicanale) in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti contenente campioni in 100 μL di terreno di coltura.
      4. Incubare la piastra a 37 °C e 5% di CO₂ in ambiente umidificato per 1 h a 4 h. Le lastre possono essere lette in più punti temporali. Generalmente, le lastre vengono lette a 1 h e a 2 h o 3 h.
      5. Le bolle nel mezzo possono portare a risultati errati. Prima di leggere nel lettore di piastre, ruotare la piastra a 1.350 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Un ago o una punta di pipetta possono essere utilizzati per rimuovere eventuali bolle che rimangono dopo la centrifugazione.
      6. Misurare l'assorbanza a 490 nm utilizzando un lettore di micropiastre o uno spettrofotometro adatto (vedere la tabella dei materiali).
      7. Salvare i dati come file Excel.
         NOTA: Il tempo di incubazione in presenza del composto in esame varierà a seconda della velocità del metabolismo e della crescita della linea cellulare in studio, oltre al composto in esame. Un periodo di incubazione di 48 ore è un buon punto di partenza per la maggior parte delle linee cellulari e dei composti in esame.
5. Analisi dei dati
   1. Trasferire i dati in un file Excel e organizzare i dati per ogni replica aumentando la concentrazione del composto in esame. Calcolare la media del valore di controllo solo medio e sottrarre questo valore dai dati sperimentali.
   2. Determinare la percentuale di proliferazione cellulare nei pozzetti di trattamento rispetto ai pozzetti del veicolo (o ai pozzetti di controllo trattati con solvente) impostando il controllo su una proliferazione del 100% per ciascuna replica.
   3. Trasferisci i dati generati in Excel in un programma di scelta. Gli autori utilizzano generalmente il software Prism (vedi la Tabella dei materiali) per determinare la concentrazione di farmaco che inibisce la proliferazione cellulare del 50% (IC₅₀).
   4. Nel software Prism, creare una tabella di dati con colonna X come numeri di cella e colonna Y come OD medio per cinque valori di replica in sottocolonne affiancate.
   5. Immettere i valori di concentrazione del trattamento nella colonna X quando si analizza un trattamento farmacologico. Etichettare l'asse x con il nome del composto di trattamento e le unità di concentrazione.
   6. Immettere i valori di vitalità della cella di replica calcolati dall'analisi di Excel nelle sottocolonne Y. Etichettare l'asse y come proliferazione cellulare (%).
   7. Utilizzando lo strumento di analisi, selezionate Regressione non lineare (adattamento della curva) in Analisi XY.
   8. Selezionare dose-risposta [inibizione] vs. risposta normalizzata - pendenza variabile.
   9. Eseguire la funzione di analisi. Visualizzare la tabella dei risultati per visualizzare i valori di adattamento migliori calcolati per IC₅₀ e il grafico di adattamento della curva. Se lo si desidera, l'asse x del grafico può essere modificato in una scala logaritmica.

Sopra sono selezionate le procedure che possono essere impiegate per caratterizzare i canali ionici nelle cellule cancerose. Il primo protocollo evidenzia la colorazione di un canale ionico. Come dettagliato, ci sono molte sfide quando si colora un canale ionico o, se è per questo, qualsiasi proteina presente nella membrana extracellulare. Mostrato in Figura 1 è la colorazione per una subunità del recettore pentamerico GABAA. Il secondo protocollo evidenzia i risultati dei test sullo stato polarizzato dei mitocondri nelle cellule cancerose. I mitocondri svolgono ruoli essenziali per la vitalità e la proliferazione cellulare, nonché per la morte cellulare. Nelle cellule di mammifero, i mitocondri attivano l'apoptosi in risposta allo stress cellulare attraverso il rilascio delle proteine della famiglia Bcl-2 che si trovano tra le membrane interne ed esterne mitocondriali. Nel citosol, le proteine della famiglia Bcl-2 attivano le proteasi caspasi, che mediano la morte cellulare programmata. Alterazioni nella funzione dei canali ionici della membrana plasmatica possono provocare un'interruzione dell'omeostasi ionica intracellulare, anche in termini di livelli di ioni all'interno dei mitocondri, che può portare a una perdita di potenziale di membrana, innescando così l'apoptosi14. I livelli di Ca2+, K+, Na+ e H+ sono determinanti importanti negli eventi di segnalazione che possono innescare la morte cellulare iniziata dai mitocondri. Mostrato in Figura 2 è la colorazione con il colorante TMRE permeabile alle cellule e caricato positivamente per etichettare e visualizzare il potenziale di membrana nei mitocondri attivi, che mantengono una carica negativa21,22. La TMRE è un colorante rosso-arancio che si lega ai mitocondri attivi a causa della loro carica negativa relativa. I mitocondri depolarizzati o inattivi hanno ridotto il potenziale di membrana e, quindi, non riescono a sequestrare la TMRE. In questo esperimento, il disaccoppiatore ionoforo FCCP è un controllo importante, in quanto depolarizza le membrane mitocondriali, prevenendo così l'accumulo di TMRE23. Il terzo protocollo evidenzia l'elettrofisiologia patch-clamp a cellula singola. Nella Figura 3 sono mostrate registrazioni rappresentative di una traccia registrata dalla linea cellulare D283 del medulloblastoma derivata dal paziente. Infine, il quarto protocollo evidenzia un saggio per determinare lo stato di proliferazione delle cellule cancerose. Nella Figura 4 sono mostrati i dettagli su come funziona il test MTS e un'illustrazione della piastra e della lettura quando incubato con un agente che compromette la vitalità delle cellule tumorali in studio (in questo caso, DAOY).

Figura 1: Colorazione delle cellule per i canali ionici. (A) Colorazione della proteina Gabra5, una subunità del recettore GABA A, nelle cellule tumorali del medulloblastoma D283. (B) Cellule fisse trattate con la colorazione fluorescente 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), che si lega al DNA. (C) Fusione di cellule tumorali di medulloblastoma colorate sia per Gabra5 che per DAPI. Barre della scala = 10 μm. La figura è adattata da Kallay et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Test dello stato polarizzato dei mitocondri . (A) Le cellule tumorali del medulloblastoma vivo D283 sono trattate con concentrazioni crescenti del farmaco QH-II-066. Le cellule vengono quindi trattate con TMRE (tetrametilrodamina, estere etilico) caricato positivamente e permeabile alle cellule, che si accumula nei mitocondri attivi (caricati negativamente). I mitocondri depolarizzati o inattivi hanno un ridotto potenziale di membrana e, pertanto, non riescono a trattenere il colorante TMRE; Di conseguenza, mostrano un segnale a bassa fluorescenza. Immagine al microscopio a fluorescenza; FCCP (cianuro di carbonile 4-[trifluorometossi] fenilidrazone). Picco: λex, 549 nm; λem, 575 nm. Barre di scala = 10 μm. (B) Quantificazione della colorazione TMRE (immagini mostrate nel pannello A) utilizzando la piattaforma software. I dati sono presentati come l'errore medio e standard della media. La figura è adattata da Kallay et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Stabilire la funzione del canale ionico usando l'elettrofisiologia. (A) Viene mostrato un impianto o un impianto Port-a-Patch, costituito da una gabbia di Faraday (a), una camera di registrazione (b) e un'unità di aspirazione (c, a destra). (B) Vista dall'alto del rig Port-a-Patch che evidenzia la camera di registrazione dotata di ingresso di perfusione (a), uscita (b) ed elettrodo di riferimento (c). (C) Il Port-a-Patch è collegato a un sistema di perfusione a scambio rapido di soluzioni con modalità di funzionamento automatizzate e manuali e serbatoi di soluzione. (D) Traccia di corrente rappresentativa da una registrazione elettrofisiologica patch-clamp a cellule intere utilizzando un rig Port-a-Patch (Nanion) e cellule tumorali di medulloblastoma D283. Il GABA (10 μM) è stato applicato per 5 s con un potenziale di mantenimento di -80 mV. (E) Traccia di corrente rappresentativa da una registrazione elettrofisiologica patch-clamp a cellule intere utilizzando un rig Port-a-Patch (Nanion) e cellule tumorali di medulloblastoma D283 con la co-applicazione di GABA (1 μM) e l'agonista del recettore GABAA (anestetico generale) propofol (50 μM), che potenzia la corrente indotta dal solo GABA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Saggio MTS per valutare la potenza del farmaco. (A) Reazioni chimiche alla base del "saggio MTS" utilizzato per valutare la potenza di un agente, come riflesso da una riduzione della proliferazione cellulare. Riduzione del tetrazolium MTS da parte delle cellule vitali, generando il colorante formazan. (B) Una piastra a 96 pozzetti che mostra i risultati colorimetrici di un test MTS con concentrazioni crescenti di farmaco. In questo esperimento, le cellule tumorali del medulloblastoma DAOY sono trattate con concentrazioni crescenti di un farmaco pre-clinico, KRM-II-08, un modulatore allosterico positivo del recettore GABAA . (C) Una curva dose-risposta generata con il saggio MTS (dalla quantificazione della piastra a 96 pozzetti). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Confronto tra configurazioni elettrofisiologiche manuali e/o semi-automatiche.

D.A.P.K. è co-fondatore, presidente e CEO di Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. è co-fondatore di Amlal Pharmaceuticals Inc. e fa parte del Drug Safety Monitoring Board di Bexion Pharmaceuticals, Inc.