Articolo metodologico

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

DOI:

10.3791/65444

⸱

16 giugno 2023

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I siti di contatto mitocondriali sono complessi proteici che interagiscono con le proteine della membrana interna ed esterna mitocondriale. Questi siti sono essenziali per la comunicazione tra le membrane mitocondriali e, quindi, tra il citosol e la matrice mitocondriale. In questo articolo, descriviamo un metodo per identificare i candidati che si qualificano per questa specifica classe di proteine.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I mitocondri sono presenti praticamente in tutte le cellule eucariotiche e svolgono funzioni essenziali che vanno ben oltre la produzione di energia, ad esempio la sintesi di cluster ferro-zolfo, lipidi o proteine, il tamponamento di Ca2+ e l'induzione dell'apoptosi. Allo stesso modo, la disfunzione mitocondriale provoca gravi malattie umane come il cancro, il diabete e la neurodegenerazione. Per svolgere queste funzioni, i mitocondri devono comunicare con il resto della cellula attraverso il loro involucro, che consiste di due membrane. Pertanto, queste due membrane devono interagire costantemente. I siti di contatto proteici tra la membrana mitocondriale interna ed esterna sono essenziali in questo senso. Finora sono stati identificati diversi siti di contatto. Nel metodo qui descritto, i mitocondri di Saccharomyces cerevisiae vengono utilizzati per isolare i siti di contatto e, quindi, identificare i candidati che si qualificano per le proteine del sito di contatto. Abbiamo usato questo metodo per identificare il complesso MICOS (Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System), uno dei principali complessi di formazione del sito di contatto nella membrana interna mitocondriale, che si conserva dal lievito all'uomo. Recentemente, abbiamo ulteriormente migliorato questo metodo per identificare un nuovo sito di contatto costituito da Cqd1 e dal complesso Por1-Om14.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I mitocondri svolgono una varietà di funzioni diverse negli eucarioti, la più nota delle quali è la produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Altre funzioni includono la produzione di cluster ferro-zolfo, la sintesi lipidica e, negli eucarioti superiori, la segnalazione di Ca2+ e l'induzione dell'apoptosi 1,2,3,4. Queste funzioni sono indissolubilmente legate alla loro complessa ultrastruttura.

L'ultrastruttura mitocondriale è stata descritta per la prima volta al microscopio elettronico5. È stato dimostrato che i mitocondri sono organelli piuttosto complessi costituiti da due membrane: la membrana esterna mitocondriale e la membrana interna mitocondriale. Pertanto, da queste membrane si formano due compartimenti acquosi: lo spazio intermembrana e la matrice. La membrana interna mitocondriale può essere ulteriormente suddivisa in diverse sezioni. La membrana perimetrale interna rimane in prossimità della membrana esterna e le cristae formano invaginazioni. Le cosiddette giunzioni crista collegano la membrana perimetrale interna e le cristae (Figura 1). Inoltre, le micrografie elettroniche dei mitocondri osmoticamente ridotti rivelano che esistono siti in cui le membrane mitocondriali sono strettamente collegate 6,7. Questi cosiddetti siti di contatto sono formati da complessi proteici che attraversano le due membrane (Figura 1). Si ritiene che questi siti di interazione siano essenziali per la vitalità cellulare a causa della loro importanza per la regolazione della dinamica mitocondriale e dell'ereditarietà, nonché per il trasferimento di metaboliti e segnali tra il citosol e la matrice8.

Il complesso MICOS nella membrana interna mitocondriale è probabilmente il complesso di formazione del sito di contatto meglio caratterizzato e più versatile. MICOS è stato descritto nel lievito nel 2011 ed è costituito da sei subunità 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 e Mic10. Questi formano un complesso di circa 1,5 MDa che si localizza alle giunzionicrista 9,10,11. La delezione di una delle due subunità principali, Mic10 o Mic60, porta all'assenza di questo complesso 9,11, il che significa che queste due subunità sono essenziali per la stabilità di MICOS. È interessante notare che MICOS forma non solo uno, ma più siti di contatto con varie proteine e complessi della membrana esterna mitocondriale: il complesso TOM 11,12, il complesso TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, il complesso Fzo1-Ugo19, Por1 10, OM45 10 e Miro 17. Ciò indica fortemente che il complesso MICOS è coinvolto in vari processi mitocondriali, come l'importazione di proteine, il metabolismo dei fosfolipidi e la generazione dell'ultrastruttura mitocondriale18. Quest'ultima funzione è probabilmente la funzione principale di MICOS, in quanto l'assenza del complesso MICOS indotta attraverso la delezione di MIC10 o MIC60 porta ad un'ultrastruttura mitocondriale anomala che manca praticamente completamente di cristae regolari. Invece, le vescicole della membrana interna senza connessione alla membrana di confine interna si accumulano19, 20. È importante sottolineare che MICOS è conservato nella forma e nella funzione dal lievito all'uomo21. L'associazione delle mutazioni nelle subunità MICOS con gravi malattie umane sottolinea anche la sua importanza per gli eucarioti superiori22,23. Sebbene MICOS sia altamente versatile, devono esistere ulteriori siti di contatto (sulla base delle nostre osservazioni non pubblicate). Infatti, sono stati identificati diversi altri siti di contatto, ad esempio i meccanismi di fusione mitocondriale Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1, che è coinvolto nella biosintesi del fosfolipide mitocondriale specifico cardiolipina 27. Recentemente, abbiamo migliorato il metodo che ci ha portato all'identificazione di MICOS per identificare Cqd1 come parte di un nuovo sito di contatto formato con il complesso di membrana esterna Por1-Om1428. È interessante notare che questo sito di contatto sembra anche essere coinvolto in molteplici processi come l'omeostasi della membrana mitocondriale, il metabolismo dei fosfolipidi e la distribuzione del coenzima Q28,29.

Qui, abbiamo usato una variazione del frazionamento dei mitocondri 9,30,31,32,33 precedentemente descritto. Il trattamento osmotico dei mitocondri porta alla rottura della membrana esterna mitocondriale e ad un restringimento dello spazio della matrice, lasciando le due membrane solo in stretta vicinanza nei siti di contatto. Ciò consente la generazione di vescicole costituite esclusivamente da membrana esterna mitocondriale o membrana interna mitocondriale o in siti di contatto contenuti di entrambe le membrane attraverso una lieve sonicazione. A causa della membrana interna mitocondriale che possiede un rapporto proteine-lipidi molto più elevato, le vescicole della membrana interna mitocondriale presentano una densità maggiore rispetto alle vescicole della membrana esterna mitocondriale. La differenza di densità può essere utilizzata per separare le vescicole di membrana attraverso la centrifugazione a gradiente di densità galleggiante del saccarosio. Pertanto, le vescicole della membrana esterna mitocondriale si accumulano a basse concentrazioni di saccarosio, mentre le vescicole della membrana interna mitocondriale si arricchiscono ad alte concentrazioni di saccarosio. Le vescicole contenenti i siti di contatto si concentrano a concentrazioni intermedie di saccarosio (Figura 2). Il seguente protocollo descrive in dettaglio questo metodo migliorato, che richiede attrezzature, tempo ed energia meno specializzate rispetto al nostroprecedente 32, e fornisce uno strumento utile per l'identificazione di possibili proteine del sito di contatto.

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Protocollo

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1. Tamponi e soluzioni madre

  1. Preparare una soluzione di acido 1 M di acido 3-morfolinopropano-1-solfonico (MOPS) in acqua deionizzata, pH 7,4. Conservare a 4 °C.
  2. Preparare 500 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in acqua deionizzata, pH 8,0. Conservare a temperatura ambiente.
  3. Preparare il sorbitolo 2,4 M in acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave.
  4. Preparare il saccarosio 2,5 M in acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente dopo la sterilizzazione in autoclave.
  5. Preparare 200 mM di fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) in isopropanolo. Conservare a −20 °C.
    ATTENZIONE: Il PMSF è tossico se ingerito e provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Non respirare la polvere e indossare guanti e occhiali protettivi.
  6. Preparare l'acido tricloroacetico (TCA) al 72% in acqua deionizzata. Conservare a 4 °C.
    ATTENZIONE: Il TCA può causare irritazione respiratoria, gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Non respirare la polvere e indossare guanti e occhiali protettivi.
  7. Preparare il tampone SM: 20 mM MOPS e 0,6 M di sorbitolo, pH 7,4.
  8. Preparare il tampone di rigonfiamento: 20 mM di MOPS, 0,5 mM di EDTA, 1 mM di PMSF e cocktail di inibitori della proteasi, pH 7,4.
  9. Preparare i tamponi gradiente di saccarosio: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M e 1,3 M di saccarosio in 20 mM di MOPS e 0,5 mM di EDTA, pH 7,4.
    NOTA: Tutti i tamponi possono essere conservati a 4 °C; tuttavia, si consiglia di conservare i tamponi contenenti saccarosio a una temperatura di -20 °C per evitare la crescita di funghi. Gli inibitori della proteasi devono essere aggiunti appena prima dell'uso.

2. Generazione di vescicole sottocondriali

  1. Isolare i mitocondri del lievito grezzo fresco secondo i protocolli stabiliti34,35.
    NOTA: Per questo esperimento, i mitocondri sono stati isolati da Saccharomyces cerevisiae. Non è necessaria la generazione di mitocondri puri a gradiente privi di altri organelli.
  2. Risospendere 10 mg di mitocondri appena isolati in tampone SM da 1,6 mL (4 °C) mediante pipettaggio (Figura 2, fase 1).
  3. Trasferire la sospensione mitocondriale in un matraccio di Erlenmeyer preraffreddato da 100 mL.
  4. Aggiungere lentamente 16 mL di tampone di rigonfiamento utilizzando una pipetta di vetro da 20 mL. Applicare una leggera agitazione costante sul ghiaccio durante l'aggiunta. Questo trattamento osmotico provoca l'assorbimento dell'acqua nello spazio della matrice. Il gonfiore della membrana interna mitocondriale interromperà la membrana esterna. Tuttavia, entrambe le membrane rimarranno in contatto nei siti di contatto9 (Figura 2, passaggio 2).
  5. Incubare i campioni con una leggera agitazione costante per 30 minuti su ghiaccio.
  6. Aggiungere lentamente 5 mL di soluzione di saccarosio 2,5 M utilizzando una pipetta di vetro da 5 mL per aumentare la concentrazione di saccarosio nei campioni a circa 0,55 M. Questo trattamento osmotico provoca un efflusso d'acqua dalla matrice36. Il restringimento della membrana interna ha lo scopo di massimizzare la sua distanza dai frammenti residui della membrana esterna. Ciò riduce la probabilità di generare vescicole ibride artificiali delle membrane interne ed esterne attraverso la sonicazione (Figura 2, passaggio 3).
  7. Incubare i campioni sotto leggera agitazione per 15 minuti su ghiaccio.
  8. Sottoporre i mitocondri a sonicazione per generare vescicole di membrana sottocondriali (Figura 2, passaggio 4).
    1. Trasferire la sospensione mitocondriale in una cella a rosetta preraffreddata.
    2. Sonicare la sospensione mitocondriale con un'ampiezza del 10% per 30 s mentre si raffredda la cella a rosetta in un bagno di ghiaccio.
    3. Far riposare la sospensione per 30 secondi in un bagno di ghiaccio.
    4. Ripetere i passaggi 2.8.2 e 2.8.3 altre tre volte.
      NOTA: Le condizioni di sonicazione variano a seconda del sonicatore utilizzato. L'ottimizzazione sarà necessaria per le singole macchine. Una sonicazione troppo dura porterà alla formazione artificiale di vescicole costituite da membrane mitocondriali interne ed esterne.

3. Separazione delle vescicole sottocondriali

  1. Separare le vescicole generate dai mitocondri intatti rimanenti mediante centrifugazione a 20.000 x g per 20 minuti a 4 °C. I mitocondri intatti pelletteranno mentre le vescicole rimarranno nel surnatante.
  2. Concentrare la miscela di vescicole.
    1. Trasferire il surnatante in provette di ultracentrifugazione fresche.
    2. Caricare un cuscino di 0,3 mL di soluzione di saccarosio 2,5 M sul fondo della provetta utilizzando una siringa da 1 mL dotata di cannula da 0,8 mm x 120 mm.
    3. Centrifugare a 118.000 x g per 100 minuti a 4 °C.
      NOTA: In questo caso è stato utilizzato un rotore a benna oscillante con un raggio massimo di 153,1 mm. Le condizioni di centrifugazione dipendono fortemente dal rotore e dovranno essere adattate quando si utilizza un altro rotore.
  3. Le vescicole appariranno come un disco sulla parte superiore del cuscino di saccarosio dopo la centrifugazione. Scartare circa il 90% del surnatante. A questo punto, raccogliere le vescicole concentrate risospendendole nel tampone rimanente, compreso il saccarosio da 2,5 M, mediante pipettaggio su e giù. Trasferire la sospensione in un omogeneizzatore Dounce ghiacciato.
  4. Omogeneizzare la sospensione con almeno 10 colpi utilizzando un vasaio in politetrafluoroetilene.
  5. Preparare il gradiente di saccarosio.
    1. Per un gradiente a gradini di 11 mL con cinque passaggi (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M e 0,8 M di saccarosio in 20 mM di MOPS e 0,5 mM di EDTA, pH 7,4), ogni strato ha 2,2 mL di soluzione di saccarosio.
      NOTA: Si consiglia un rifrattometro per misurare e regolare le concentrazioni di saccarosio; Tuttavia, non è essenziale. Applicare 10 μL di tampone al rifrattometro e rilevare i rispettivi indici di rifrazione. Il calcolo della concentrazione di saccarosio è il seguente:
      Equazione della concentrazione di saccarosio nella molarità; Diagramma per l'analisi della misurazione dell'indice di rifrazione.
      1,3333 rappresenta l'indice di rifrazione dell'acqua. 0,048403 è un indice di conversione specifico del saccarosio ottenuto dalla scala lineare della rifrazione molare alla concentrazione di saccarosio in soluzioni acquose 37.
    2. Aggiungere la massima concentrazione di saccarosio alla provetta di centrifugazione e mettere la provetta a -20 °C. Attendere che lo strato sia completamente congelato prima di applicare quello successivo. Procedere di conseguenza fino all'aggiunta dell'ultimo strato e conservare i gradienti a −20 °C.
      NOTA: Ricordarsi di trasferire i gradienti congelati a 4 °C quando si inizia l'esperimento per consentire lo scongelamento dei gradienti. Ci vorranno circa 3 ore. Per la centrifugazione è stato utilizzato un rotore a secchiello oscillante con una capacità di 13,2 mL. Quando si utilizza un rotore diverso, i volumi del passo di gradiente devono essere adattati di conseguenza.
  6. Misurare la concentrazione di saccarosio dei campioni utilizzando un rifrattometro. Se non c'è accesso a un rifrattometro, si potrebbe in alternativa supporre che la concentrazione di saccarosio sia di 2 M. Questa presunta concentrazione di saccarosio sarà quindi la base per il passo successivo.
  7. Regolare la concentrazione di saccarosio a 0,6 M aggiungendo una quantità appropriata di 20 mM MOPS, 0,5 mM di EDTA, 1 mM di PMSF e cocktail di inibitori della proteasi, pH 7,4. Se la concentrazione di saccarosio è stimata a 2 M invece di essere misurata, si consiglia di verificare se la concentrazione è sufficientemente bassa dopo l'aggiustamento. Applicare una piccola aliquota del campione (ca. 50 μL) sopra 200 μL di saccarosio 0,8 M in una provetta. Il campione deve rimanere sopra il saccarosio 0,8 M.
  8. Caricare i campioni (circa 1 mL) sopra il gradiente di saccarosio (mantenere il 10% per riferimento futuro). Un pipettaggio accurato è importante per evitare il disturbo del gradiente (Figura 2, fase 5).
  9. Separare le vescicole mediante centrifugazione a 200.000 x g e 4 °C per 12 ore. Se possibile, impostare la centrifuga su un'accelerazione e una decelerazione lente per evitare il disturbo del gradiente (Figura 2, passaggio 6).
    NOTA: In questo caso è stato utilizzato un rotore a benna oscillante con un raggio massimo di 153,1 mm. Le condizioni di centrifugazione dipendono fortemente dal rotore e dovranno essere adattate quando si utilizza un altro rotore.
  10. Prelevare il gradiente dall'alto verso il basso in frazioni da 700 μL utilizzando una pipetta da 1 mL. Ciò si tradurrà in 17 frazioni, che consentono una risoluzione sufficiente.

4. Analisi delle vescicole sottocondriali

  1. Concentrare le proteine sottoponendo ciascuna frazione a due precipitazioni di TCA eseguite in sequenza38 per preparare i campioni SDS-PAGE.
    1. Aggiungere 200 μL di TCA al 72% alle singole frazioni e mescolare fino a ottenere una soluzione omogenea. Incubare le frazioni per 30 minuti su ghiaccio e pellettizzare le proteine precipitate mediante centrifugazione a 20.000 x g e 4 °C per 20 minuti. Eliminare il surnatante, aggiungere 500 μL di soluzione di TCA al 28 %, mescolare bene e ripetere la fase di centrifugazione.
    2. Lavare i pellet con 1 mL di acetone (−20°C) e centrifugare per 10 minuti a 20.000 x g e 4 °C. Scartare il surnatante e lasciare asciugare i pellet all'aria. Risospendere i pellet in 60 μL di tampone SDS e incubare i campioni per 5 minuti a 95 °C.
      NOTA: Una grande quantità di saccarosio rimarrà, in particolare nelle frazioni ad alta densità, dopo la prima precipitazione TCA. Questo verrà rimosso attraverso l'ulteriore precipitazione TCA.
  2. Analizzare 20 μL di ciascuna frazione mediante SDS-PAGE39 e immunoblotting40,41,42,43.

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Risultati

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È relativamente facile separare le membrane mitocondriali interne ed esterne. Tuttavia, la generazione e la separazione delle vescicole contenenti il sito di contatto sono molto più difficili. A nostro avviso, due passaggi sono critici ed essenziali: le condizioni di sonicazione e il gradiente utilizzato.

Di solito, si pensa che i gradienti lineari abbiano una risoluzione migliore rispetto ai gradienti a gradini. Tuttavia, la loro produzione riproducibile è noiosa e richiede attrezzature speci...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il frazionamento mitocondriale è un esperimento complicato con diverse fasi molto complesse. Pertanto, abbiamo mirato a migliorare ulteriormente e, in una certa misura, semplificare il nostro metodoconsolidato 32. In questo caso, le sfide erano la necessità di attrezzature complicate e altamente specializzate, che spesso sono costruzioni individuali, e l'enorme consumo di tempo ed energia. A tal fine, abbiamo cercato di rimuovere le pompe e le singole costruzioni utilizzate per la colata e la racc...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E.H. ringrazia la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), progetto numero 413985647, per il sostegno finanziario. Gli autori ringraziano il Dr. Michael Kiebler, dell'Università Ludwig-Maximilians di Monaco di Baviera, per il suo generoso e ampio sostegno. Siamo grati a Walter Neupert per il suo contributo scientifico, le discussioni utili e la continua ispirazione. J.F. ringrazia la Graduate School Life Science Munich (LSM) per il supporto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
13,2 mL, Provetta ultra-trasparente a parete sottile aperta, 14 x 89 mmBeckman Instruments, Germania344059
50 mL, Provetta aperta in policarbonato a parete spessa aperta, 29 x 104 mmBeckman Instruments, Germania363647
Rotore ad angolo fisso A-25.50 - Alluminio, 8 x 50 mL, 25.000 giri/min, 75.600 x gBeckman Instruments, Germania363055
Abbe rifrattometroZeiss, Germaniafuori produzione,
qualsiasi rifrattometro Abbe può essere utilizzato
accu-jet pro Pipet ControllerBrandtech, USABR26320fuori produzione,
qualsiasi pipetta controller sarà sufficiente
Becher 1000 mLDWK Life Science, GermanyC118.1
Branson  Sonificatore digitale W-250 DBranson Ultrasonics, USAFIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm MICROTIP conicoBranson Ultrasonics, USA101-148-062
Branson Ultrasonics 200 e 400 Watt Sonificatori: Cella di raffreddamento a rosettaBranson Ultrasonics, USA15-338-70
Centrifuga Avanti JXN-26Beckman Instruments, GermaniaB37912
Centrifuga Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Germania8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche, Svizzera11697498001
D-SorbitRoth, Germania6213
EDTA (Acido etilendiammina-tetraacetico sale disodico diidrato)Roth, Germania8043
Pallone di Erlenmeyer, 100 mLRoth, GermaniaX747.1
, Kl. B, 25:0, 0.1Hirschmann, Germania1180170
pipetta graduata, Kl. B, 5:0, 0.05Hirschmann, Germania1180153
bagno di ghiaccioneoLab, Germania S12651
Agitatore magnetico RCT basicIKA-Werke GmbH, GermaniaZ645060GB-1EA
MOPS (acido 3-(N-Morpholino)propansolfonico)Gerbu, Germania1081
MyPipetman Select P1000Gilson, USAFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, USAFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, USA
Omnifix 1 mLBraun, Germania4022495251879
Fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF)Serva, Germania32395.03
CANNULA STERICAN 21 Gx4 4/5 0,8x120 mmBraun, Germania4022495052414
barra di agitazione, 15 mmVWR, USA442-0366
SaccarosioMerck, GermaniaS8501
SW 41 Ti Rotore a secchiello oscillanteBeckman Instruments, Germania331362
ProvetteEppendorf, Germania3810X
Macinatori di tessuti, tipo Potter-Elvehjem, recipiente di vetro da 2 mLVWR, USA432-0200
Macinatori di tessuti, tipo Potter-Elvehjem, stantuffo da 2 mL con punta seghettataVWR, USA432-0212
Acido tricloroacetico ( TCA)Sigma Aldrich, Germania33731fuori produzione,
qualsiasi TCA sarà sufficiente (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Germania4855
Pipetta graduata FP10005S

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863(2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399(2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769(2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1(2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

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