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Articolo metodologico

Produzione di cellule T del recettore dell'antigene chimerico su un processore cellulare automatizzato

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DOI:

10.3791/65488

18 agosto 2023

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive in dettaglio il processo di produzione delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico per uso clinico, in particolare utilizzando un processore cellulare automatizzato in grado di eseguire la trasduzione virale e la coltivazione delle cellule T. Forniamo raccomandazioni e descriviamo le insidie che dovrebbero essere considerate durante lo sviluppo del processo e l'implementazione di uno studio clinico in fase iniziale.

Abstract

Le cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR)-T rappresentano un promettente approccio immunoterapico per il trattamento di varie malattie maligne e non maligne. Le cellule CAR-T sono cellule T geneticamente modificate che esprimono una proteina chimerica che riconosce e si lega a un bersaglio della superficie cellulare, con conseguente uccisione della cellula bersaglio. I metodi tradizionali di produzione di celle CAR-T sono laboriosi, costosi e possono comportare il rischio di contaminazione. Il CliniMACS Prodigy, un processore cellulare automatizzato, consente di produrre prodotti per la terapia cellulare su scala clinica in un sistema chiuso, riducendo al minimo il rischio di contaminazione. L'elaborazione avviene in modo semiautomatico sotto il controllo di un computer e quindi riduce al minimo il coinvolgimento umano nel processo, risparmiando tempo e riducendo la variabilità e gli errori.

Questo manoscritto e video descrivono il processo di trasduzione delle cellule T (TCT) per la produzione di cellule CAR-T utilizzando questo processore. Il processo TCT prevede l'arricchimento, l'attivazione, la trasduzione con un vettore virale, l'espansione e la raccolta delle cellule T CD4+/CD8+. Utilizzando la Matrice delle Attività, una funzionalità che consente l'ordinamento e la tempistica di questi passaggi, il processo TCT può essere ampiamente personalizzato. Forniamo una panoramica della produzione di cellule CAR-T in conformità con le attuali buone pratiche di fabbricazione (cGMP) e discutiamo i test di rilascio richiesti e gli esperimenti preclinici che supporteranno una domanda di nuovo farmaco sperimentale (IND). Dimostriamo la fattibilità e discutiamo i vantaggi e gli svantaggi dell'utilizzo di un processo semiautomatico per la produzione clinica di cellule CAR-T. Infine, descriviamo uno studio clinico in corso avviato dallo sperimentatore che prende di mira le neoplasie pediatriche a cellule B [NCT05480449] come esempio di come questo processo di produzione possa essere applicato in un contesto clinico.

Introduzione

Il trasferimento adottivo di cellule T ingegnerizzate per esprimere un recettore chimerico dell'antigene (CAR) ha mostrato una notevole efficacia nel trattamento di pazienti con neoplasie refrattarie a cellule B 1,2,3,4,5. Tuttavia, i metodi di produzione tradizionali per le celle CAR-T sono laboriosi, richiedono molto tempo e tecnici altamente qualificati per eseguire passaggi altamente specializzati. Ad esempio, il processo di produzione tradizionale di un prodotto a base di cellule CAR-T autologhe preved....

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Protocollo

Tutta la ricerca è stata condotta in conformità con le linee guida istituzionali con l'approvazione dell'Institutional Review Board (IRB) dell'ospedale e tutti i soggetti hanno fornito il consenso informato per la pubblicazione dei dati raccolti nel contesto dello studio.
NOTA: La prima sezione del protocollo fornisce una panoramica generale del processo di produzione delle CAR-T. Le sezioni rimanenti forniscono le istruzioni dettagliate. Il protocollo descrive il flusso di lavoro utilizzando la versione 1.4 del software TCT, che è la versione corrente al momento della stesura di questo documento. L'interfaccia utente di altre versioni del software TCT può variare.....

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Risultati

I risultati dei primi tre cicli di produzione di CAR-T della prova NCT05480449 sono presentati di seguito nella Tabella 3. Il materiale di partenza, il vettore, le citochine di coltura e le concentrazioni sieriche AB sono state mantenute coerenti per ogni corsa. I prodotti sono stati raccolti il giorno 7 o 8. La crescita cellulare media giornaliera è stata del 46% (aumento del numero totale di cellule), indicando che il processo TCT è stato efficace nel promuovere l'espansione cellulare. Questi risultati.......

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Discussione

La terapia cellulare CAR-T è emersa come un approccio terapeutico promettente per le cellule B e altre neoplasie maligne. Tuttavia, i metodi tradizionali di produzione di celle CAR-T presentano diverse limitazioni, come i costi elevati, la produzione ad alta intensità di manodopera e le fasi aperte che aumentano il rischio di contaminazione. Recentemente, sono emerse diverse piattaforme semi-automatizzate, tra cui Miltenyi CliniMACS Prodigy (il "processore"), per affrontare queste limitazioni. Il processo di trasduzione .......

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Dichiarazioni

S.K., S.G. e Y.W. hanno ricevuto supporto per la ricerca da Miltenyi Biotec.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere il contributo di diversi individui e organizzazioni a questo lavoro. Il Laboratorio di Terapia Cellulare e Genica e il Laboratorio di Studi Traslazionali e Correlativi della Penn hanno fornito una preziosa assistenza per lo sviluppo del processo e la preparazione per le richieste di IND. Melissa Varghese e Amanda DiNofia hanno contribuito allo sviluppo del processo e alla preparazione per le presentazioni IND che sono alla base di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di accelerazione della Cell and Gene Therapy Collaborative del Children's Hospital di Filadelfia. Gli autori desiderano inoltre ringrazi....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
12 provette in borosilicato da 75 CharlesRiverTL1000
Sacca per reagenti da 20 mLMiltenyi Biotec170-076-631
Provetta conica da 50 mLFisher05-539-10
Set di trasferimento da 150 mLFenwal4R2001
Set di trasferimento da 2.000 mLFenwal4R2041
7AADFisher Scientific
Alcohol PrepTyco/Healthcare
Bag AccessMedline2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-113-643
CD19 Reagente di rilevamento CAR BiotinaMiltenyi Biotec130-129-550
CD19 PEBD555413
CD3 APCBD340440
CD4 VioBright FITC REAfinityMiltenyi Biotec130-113-229
CD45 VioBlue REAfinityMiltenyi Biotec130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-110-681
Perline di riferimento per cellometro 10umNexcelomB10-02-020
Perline di riferimento per cellometro 15umNexcelomB15-02-010
Perline di riferimento per cellometro 5umNexcelomB05-02-050
Vetrini per cellometroNexcelomCHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeadsMiltenyi Biotec276-01Il reagente CD4
CliniMACS CD8 GMP MicroBeadsMiltenyi Biotec275-01Il reagente CD8
CliniMACS PBS / EDTA TamponeMiltenyi Biotec130-021-201Il tampone
DMSOOrigenCP-10
Sacca di congelamento 50 mLMiltenyi Biotec200-074-400
Fiala di congelamento, 1,8 mLNunc12565171N
Fiala di congelamento, 4,5 mLNunc12565161N
Siero AB umanoValley BiomedicalSterile albumina sierica umana filtrata e inattivata a caldo
25%Grifols68516-5216-1
Albumina sierica umana 5%Grifols68516-5214-1
MACS GMP ricombinante umano IL-2Miltenyi Biotec170-076-148Le citochine
MACS GMP T Cell TransActMiltenyi Biotec200-076-202Il reagente
di attivazione MycoSeq Mycoplasma Kit di rilevamentoLife Technologies4460623
aghi, aghi ipodermici 14GMedlineSWD200573
SlideSafe 18GBDB-D305918
, 2-200 &; L, confezionato singolarmenteEppendorf022492209
Punte per pipette, 50-1000 μ L, confezionato singolarmenteEppendorf022492225
Pipette 10 mLFisher13-678-27F
Pipette 25 mLFisher13-675-30
Pipette 5 mLFisher13-678-27E
Plasmalyte-ABaxter2B2544XLa soluzione elettrolitica
Prodigy TS520 Set di tubiMiltenyi Biotec170-076- 600Il set di tubi
Campo sterileMedlineNON21001
Streptavidin PE-Vio770Miltenyi Biotec130-106-793
Siringa 1 mLBD309628
Siringa 10 mLBD302995
Siringa 3 mLBD 309657
Siringa 30 mLBD302832
Siringa 50 mLBD309653
TexMACS GMP MediumMiltenyi Biotec170-076-306Il medium
Adattatore a triplo campionamentoMiltenyi Biotec170-076-609
Vettore viraleCHOP Vettore clinico CorehuCART19
Equipment
Biological Safety CabinetThe Baker Co
Cellometer Auto 2000Nexcelom
CliniMACS ProdigyMiltenyi Biotec200-075-301Il processore
Controlled Rate Freezer Planer/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150KCharles River
Mettler BalanceMettler
Centrifuga refrigerataThermo Fisher
Centrifuga refrigerataFisher Sci
SCD Saldatrice per tubi steriliTerumo
Sebra Sigillante per tubiSebra
VarithermBarkeyIl dispositivo di disgelo a secco
XN-330 Analizzatore ematologicoSysmex
BDB559925, punte per pipette

Riferimenti

  1. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  2. Shah, N. N., et al.

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Ristampe e permessi

Tag

Cellule CAR Ttrasduzione delle cellule Tarricchimento CD4 CD8trasduzione tramite vettore viraleproduzione di terapia cellulareprocessazione in sistema chiusomatrice di attivitproduzione di grado clinicoespansione cellulare