Preparazione di campioni alimentari mediante omogeneizzazione e digestione acida umida assistita da microonde per la determinazione di più elementi con ICP-MS

L'analisi elementare è un processo analitico per determinare la composizione elementare di vari campioni. Può essere utilizzato per controllare l'assunzione di metalli nel corpo umano (in particolare metalli pesanti¹) poiché le loro alte concentrazioni possono causare problemi di salute indesiderati. I metalli pesanti sono anche uno dei principali contaminanti ambientali, pertanto è necessario controllare la loro presenza nell'ambiente². Inoltre, l'analisi elementare può essere impiegata per determinare l'origine geografica dei prodotti alimentari³ e per controllare la qualità delle risorse alimentari e idriche⁴. Inoltre, viene utilizzato per la determinazione di micro e macronutrienti nei suoli⁵ e per ottenere informazioni sui processi geologici nel corso della storia esaminando la composizione chimica di minerali e sedimenti⁶. Sono stati inoltre condotti studi per determinare la presenza di metalli rari nei rifiuti elettrici ed elettronici per un'ulteriore rigenerazione dei metalli⁷, per valutare il successo dei trattamenti farmacologici⁸ e per verificare la composizione elementare degli impianti metallici⁹.

La spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) e la spettroscopia di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES) sono tecniche comunemente utilizzate per l'analisi elementare di vari campioni¹⁰. Consentono la determinazione simultanea di più elementi con limiti di rilevazione (LOD) e limiti di quantificazione (LOQ) fino a ng/L. In generale, l'ICP-MS ha valori di LOD^{più bassi 11} e un intervallo di concentrazione lineare più ampio rispetto all'ICP-OES¹². Altre tecniche per determinare la composizione elementare sono la spettrometria di emissione ottica al plasma indotta da microonde¹³ e diverse varianti della spettroscopia di assorbimento atomico (AAS), tra cui la spettroscopia di assorbimento atomico a fiamma, la spettroscopia di assorbimento atomico^{elettrotermico 2}, la spettroscopia di assorbimento atomico a vapore freddo e la spettroscopia di assorbimento atomico di generazione di idruri¹⁴. Inoltre, la determinazione elementare con basso LOD e LOQ è possibile con diversi metodi elettroanalitici, in particolare con la voltammetria di stripping anodico^15,16. Naturalmente, ci sono altri metodi per determinare la composizione elementare dei campioni, ma non sono così frequentemente impiegati come i metodi sopra menzionati.

La determinazione elementare diretta di campioni solidi è fattibile utilizzando la spettroscopia di rottura indotta dal laser e la fluorescenza a raggi X¹⁷. Tuttavia, per la determinazione elementare con ICP-MS, ICP-OES e AAS è necessario convertire i campioni solidi in uno stato liquido. A tale scopo, la digestione acida viene eseguita utilizzando acidi e reagenti ausiliari (nella maggior parte dei casi H₂O₂ ). La digestione acida viene effettuata a temperatura e pressione elevate, convertendo la parte organica del campione in prodotti gassosi e convertendo gli elementi metallici in sali solubili in acqua, sciogliendoli così nella soluzione¹⁸.

Esistono due tipi principali di digestione acida, la digestione a vaso aperto e la digestione a vaso chiuso. La digestione a vaso aperto è economicamente vantaggiosa¹⁴ ma presenta limitazioni, come la temperatura massima di digestione, che coincide con la temperatura di ebollizione degli acidi a pressione atmosferica. Il campione può essere riscaldato su piastre riscaldanti, blocchi riscaldanti, bagni d'acqua, bagni di sabbia² e microonde¹⁹. Riscaldando il campione in questo modo, gran parte del calore generato viene disperso nell'ambiente circostante²⁰, il che prolunga il tempo di digestione¹⁴. Altri svantaggi della digestione a vaso aperto includono un maggiore consumo di prodotti chimici, la maggiore possibilità di contaminazione dall'ambiente circostante e la possibile perdita di analiti a causa della formazione di componenti volatili e della loro evaporazione dalla miscela di reazione²¹.

I sistemi a recipiente chiuso sono più convenienti per la digestione di campioni organici e inorganici rispetto ai sistemi a recipiente aperto. I sistemi a recipiente chiuso utilizzano una varietà di fonti di energia per riscaldare i campioni, come il riscaldamento a conduzione e le microonde²². I metodi di digestione che utilizzano le microonde includono la combustione indotta da microonde²³, i sistemi a camera singola^{di reazione 24} e la digestione acida umida assistita da microonde (MAWD) comunemente usata25,26. MAWD consente la digestione a temperature di esercizio più elevate, comprese tra 220 °C e 260 °C e pressioni massime fino a 200 bar, a seconda delle condizioni di lavoro dello strumento²⁷.

L'efficienza e la velocità di MAWD dipendono da diversi fattori, tra cui la composizione chimica dei campioni, la temperatura massima, il gradiente di temperatura, la pressione nel recipiente di reazione, la quantità di acidi aggiunti e la concentrazione di acidi utilizzati²⁸. Nella MAWD, la digestione acida completa può essere raggiunta in pochi minuti grazie alle elevate condizioni di reazione rispetto alle digestioni più durature nei sistemi a vaso aperto. Nella MAWD sono richiesti volumi e concentrazioni inferiori di acidi, in linea con le attuali linee guida sulla chimica verde²⁹. Nella MAWD, è necessaria una quantità minore di campione rispetto alla digestione a vaso aperto per eseguire la digestione acida, di solito sono sufficienti fino a 500 mg di campione 30,31,32. Possono essere digerite quantità di campione maggiori, ma richiedono una maggiore quantità di sostanze chimiche.

Poiché lo strumento per MAWD controlla automaticamente le condizioni di reazione e la persona non entra in contatto diretto con le sostanze chimiche durante il riscaldamento, MAWD è più sicuro da usare rispetto alle digestioni a vaso aperto. Tuttavia, la persona dovrebbe sempre procedere con cautela quando si aggiungono sostanze chimiche ai vasi di reazione per evitare che entrino in contatto con il corpo e causino danni. Anche i recipienti di reazione devono essere aperti lentamente poiché la pressione si accumula al loro interno durante la digestione acida.

Sebbene la digestione acida sia una tecnica utile per preparare i campioni per la determinazione elementare, la persona che la esegue dovrebbe essere consapevole dei suoi possibili limiti. La digestione acida potrebbe non essere adatta a tutti i campioni, in particolare a quelli con matrici complesse e a quelli altamente reattivi o che potrebbero reagire in modo esplosivo. Pertanto, la composizione del campione deve essere sempre valutata per selezionare le sostanze chimiche e le condizioni di reazione appropriate per una digestione completa che dissolva tutti gli elementi desiderati nella soluzione. Altre preoccupazioni che l'utente deve considerare e affrontare sono le impurità e la perdita di analiti in ogni fase della preparazione del campione. La digestione acida deve essere sempre eseguita secondo regole specifiche o utilizzando protocolli.

Il protocollo descritto di seguito fornisce le istruzioni per l'omogeneizzazione dei campioni alimentari in un miscelatore di dimensioni da laboratorio, una procedura per la pulizia dei componenti del miscelatore, la corretta pesatura del campione, l'aggiunta di sostanze chimiche, l'esecuzione della digestione acida mediante MAWD, la pulizia dei recipienti di reazione al termine della digestione, la preparazione dei campioni per la determinazione elementare e l'esecuzione di una determinazione quantitativa multielemento con ICP-MS. Seguendo le istruzioni riportate di seguito, si dovrebbe essere in grado di preparare un campione adatto alla determinazione elementare ed eseguire le misurazioni dei campioni digeriti.

1. Omogeneizzazione del campione

1. Usando un coltello di ceramica pulito, taglia manualmente i campioni di cibo (broccoli, funghi, salsicce e tagliatelle) in pezzi più piccoli per accelerare il processo di essiccazione. Preparare una quantità sufficiente di campioni per un minimo di 6 repliche della digestione acida (assicurarsi che la massa minima dei campioni essiccati sia di 1500 mg).
   NOTA: L'aumento della superficie del campione espone una porzione maggiore del campione all'aria circostante riscaldata, aumentando la velocità di evaporazione dell'acqua.
2. Mettere il campione in un becher di vetro da 250 ml e asciugarlo a 105 °C a un peso costante utilizzando un essiccatore.
3. Rimuovere il bicchiere di vetro con il campione dall'essiccatore e inserirlo nell'essiccatore.
4. Lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente.
   NOTA: I campioni devono essere pesati a una temperatura costante per garantire che il peso rifletta accuratamente la massa. Le variazioni di temperatura possono influenzare il volume e la densità dei campioni misurati.
5. Aprire l'essiccatore e trasferire il becher di vetro con il campione sulla bilancia analitica. Misurare il peso del bicchiere di vetro con il campione.
6. Al termine della pesata, rimettere il campione nell'essiccatore.
   NOTA: Se il campione si è ridotto significativamente durante l'essiccazione, è possibile trasferirlo in un bicchiere di vetro più piccolo utilizzando una spatola di plastica per una pesatura più comoda.
7. Ripetere il processo come descritto nei passaggi 1.3-1.6 fino a ottenere un peso costante del campione.
8. Inserire il campione eterogeneo essiccato nel becher del miscelatore (vedere la tabella dei materiali), assicurandosi che non superi il volume massimo del becher del miscelatore.
9. Inserire il becher del miscelatore nel miscelatore e chiudere lo sportello di protezione (Figura 1).
10. Premere il pulsante di avvio per attivare le lame per la macinazione e la miscelazione del campione.
11. Eseguire la macinazione fino a quando il campione non si trasforma in una polvere fine o in una pasta omogenea. Per ottenere un prodotto di questo tipo, ripetere più volte il processo di macinazione.
12. Quando il campione è omogeneizzato, spegnere il miscelatore, aprire lo sportello di protezione e rimuovere il becher del miscelatore.
13. Rimuovere il campione omogeneizzato dal bicchiere miscelatore e trasferirlo in un bicchiere di vetro pulito da 50 ml utilizzando una spatola di plastica pulita (Figura 2).
    NOTA: Se il campione è troppo duro e potrebbe potenzialmente danneggiare i componenti del miscelatore, come le lame e il becher del miscelatore, può essere omogeneizzato con altri mezzi, come la frantumazione in malta. I miscelatori sono generalmente inadatti per l'omogeneizzazione di materiali duri, campioni congelati o campioni facilmente infiammabili, che potrebbero danneggiare i componenti del miscelatore. L'uso di solventi organici nel miscelatore è sconsigliato.
    ATTENZIONE: Utilizzare l'equipaggiamento di sicurezza e assicurarsi che la porta del miscelatore sia adeguatamente chiusa mentre le lame del miscelatore ruotano ad alta velocità.

2. Pulizia del miscelatore

1. Aggiungere acqua ultrapura (vedi Tabella dei materiali) al segno del bicchiere miscelatore vuoto.
2. Inserire il becher del miscelatore nel miscelatore ed eseguire la procedura di miscelazione standard.
3. Estrarre il becher dal miscelatore e versare l'acqua di scarico. Se necessario, ripetere più volte il processo con acqua ultrapura fino a quando l'acqua rimane pulita anche dopo la miscelazione.
4. Rimuovere le lame e il separatore a membrana contaminati dal miscelatore e pulirli accuratamente con acqua ultrapura.
   NOTA: Utilizzare detergenti neutri per migliorare l'efficienza della pulizia, soprattutto quando si tratta di campioni con un alto contenuto di grassi, poiché il grasso aderisce facilmente alla superficie dell'inventario di laboratorio.
   ATTENZIONE: Indossare dispositivi di protezione adeguati, come guanti, durante la rimozione e la pulizia delle lame per ridurre il rischio di potenziali lesioni dovute ai loro bordi taglienti.
5. Asciugare i componenti puliti nell'essiccatore a 105 °C e reinserirli nel miscelatore.
   NOTA: Assicurarsi che i componenti del miscelatore siano completamente asciutti prima di reinstallarli nel miscelatore, per evitare il trascinamento dell'acqua al campione successivo.

3. Pesatura dei campioni

1. Rimuovere il coperchio dal recipiente di reazione TFM-PTFE da 100 mL di trifluorometossil-politetrafluoroetilene³³.
2. Posizionare il recipiente di reazione aperto sulla bilancia analitica e assicurarsi che la bilancia sia livellata e azzerata prima di ogni misurazione (Figura 3).
   NOTA: La pesatura deve essere eseguita a temperatura ambiente. Evitare le aree in cui forti fluttuazioni di temperatura e flusso d'aria potrebbero influire sul peso misurato. Assicurarsi che l'area di pesatura sia pulita e priva di contaminanti.
3. Trasferire il campione omogeneizzato nel recipiente di reazione utilizzando una spatola di plastica e pesare 250 mg del campione. Non pesare il campione al di sotto del limite di pesata minima della bilancia analitica.
4. Una volta completata la pesata, posizionare il coperchio sul recipiente di reazione per proteggere il campione dalla contaminazione.
   NOTA: Il superamento del limite di peso della procedura di digestione può causare una digestione incompleta. Maneggiare con cura il campione e i recipienti di reazione per evitare qualsiasi contaminazione esterna.

4. Aggiunta di acido

1. Versare rispettivamente circa 40,0 mL di HNO₃ al 68% in peso e 5,0 mL di H₂O₂ al 30% in peso in becher di vetro separati da 50 mL.
   NOTA: Le sostanze chimiche devono essere di elevata purezza con impurità di metalli in tracce inferiori a 1,0 μg/L (ppb), idealmente nell'intervallo ng/L (ppt). Le impurità dei metalli in tracce influiscono sull'accuratezza e sulla ripetibilità della determinazione elementare.
2. Collocare i recipienti di reazione in una cappa aspirante, aprire i coperchi di copertura e aggiungere i volumi indicati di seguito del 68% in peso di HNO₃ e del 30% in peso di H₂O₂ con pipette automatiche da 1 mL o 5 mL, secondo le seguenti specifiche:
   1. Broccoli, funghi, salsicce e tagliatelle; per 250 mg di campione aggiungere 5,0 mL 68% in peso HNO₃ e 1,0 mL 30% in peso H₂O₂. Preparare tre repliche per ogni campione.
   2. Per determinare l'accuratezza del metodo (in termini di recupero, Rec), utilizzare la procedura descritta al punto 4.2.1 e aggiungere 37,5 μL di soluzione standard multielemento ICP da 100 mg/L (vedere Tabella dei materiali) nei recipienti di reazione utilizzando una pipetta automatica da 200 μL. Per ogni campione, preparare tre repliche.
      NOTA: Il volume di 37,5 μL è stato selezionato in quanto corrisponde a un aumento di 15,0 μg/L per le soluzioni addizionate dei campioni rispetto alla concentrazione nelle soluzioni non addizionate dei campioni. Inoltre, l'aumento della concentrazione per la soluzione addizionata dei campioni corrisponde alla concentrazione finale che è ancora nell'intervallo di concentrazione lineare per ogni analita misurato.
   3. Preparare un campione bianco utilizzando lo stesso volume di 68% in peso di HNO₃ e 30% in peso di H₂O₂ utilizzato per la digestione dei campioni alimentari al punto 4.2.1. Per un bianco campione, non aggiungere il campione ai recipienti di reazione.
      ATTENZIONE: L'HNO₃ utilizzato per la digestione è corrosivo e produce fumi. Per questo motivo, l'aggiunta di acido deve essere eseguita in una cappa aspirante. Devono essere utilizzati dispositivi di protezione da laboratorio standard (guanti, occhiali di sicurezza e camice da laboratorio). In caso di contatto con l'acido, l'area interessata deve essere immediatamente sciacquata sotto il getto di acqua fredda e deve essere cercata assistenza medica.
3. Posizionare il coperchio sui recipienti di reazione e lasciare che i campioni reagiscano con l'aggiunta del 68% in peso di HNO₃ e del 30% in peso di H₂O₂ per 2-3 minuti.
4. Avvitare il coperchio filettato sul recipiente e serrare i coperchi del coperchio.
5. Agitare il recipiente di reazione con leggeri movimenti della mano per incorporare completamente i campioni nelle sostanze chimiche.
   NOTA: Non lasciare i campioni sulle pareti o sui coperchi dei recipienti di reazione, poiché esiste la possibilità che non vengano completamente digeriti.

5. Digestione acida umida assistita da microonde

1. Accendere il sistema a microonde (vedere la tabella dei materiali) per la digestione acida premendo il pulsante di avvio (Figura 4).
2. Aprire la porta del forno a microonde e rimuovere la griglia.
3. Distribuire i recipienti di reazione chiusi simmetricamente nel rack per garantire un'irradiazione uniforme dei campioni mediante microonde.
4. Inserite il rack nella camera del microonde e montatelo su un supporto (Figura 5).
5. Chiudere la porta del forno a microonde.
6. Impostare un programma di digestione adatto sul touch screen del forno a microonde utilizzando uno strumento a forma di penna. Scegliere un gradiente di temperatura appropriato, la temperatura finale e il numero di campioni da digerire. Il programma di digestione raccomandato per i diversi campioni di cibo è elencato di seguito:
   1. Broccoli, funghi, salsicce e tagliatelle: aumento di 10 min a 160 °C, aumento di 10 min a 200 °C, 15 min a 200 °C, potenza massima 900 W.
7. Avviare il programma di digestione e monitorare il cambiamento delle condizioni di reazione sullo schermo. Interrompere il processo di digestione se la temperatura non aumenta secondo il programma prescritto.
   NOTA: Durante la digestione, sullo schermo del forno a microonde possono essere visualizzati improvvisi picchi di temperatura. Si verificano quando i campioni reagiscono esotermicamente con le sostanze chimiche. Il sistema a microonde regolerà automaticamente la temperatura regolando la potenza di uscita.
8. Attendere fino al completamento della digestione assistita da microonde e alla diminuzione della temperatura del campione.
9. Aprire la porta del forno a microonde e rimuovere la griglia dalla camera del forno a microonde. Chiudere lo sportello e spegnere lo strumento.
10. Rimuovere i recipienti di reazione dal rack e attendere che si raffreddino a temperatura ambiente.
11. Aprire lentamente manualmente i coperchi del coperchio per rilasciare i gas che si formano durante la digestione acida. Ruotare i recipienti di reazione in direzione della cappa aspirante (Figura 6).
12. Rimuovere completamente il coperchio e sciacquare il coperchio e le pareti del recipiente di reazione con una piccola quantità di acqua ultrapura.
13. Trasferire quantitativamente il contenuto del recipiente di reazione in un matraccio tarato di vetro pulito da 25 mL attraverso un imbuto di vetro risciacquando ripetutamente il coperchio e il recipiente di reazione con acqua ultrapura.
14. Diluire il campione con acqua ultrapura fino al segno del matraccio tarato. Chiudere il matraccio tarato con un tappo e mescolare il contenuto del matraccio tarato.
    NOTA: Deve essere eseguita un'ulteriore diluizione dei campioni digeriti con acqua ultrapura in quanto devono contenere meno del 5% (V/V) di acido residuo³⁴ e meno di 2 g/L di elementi disciolti, detti anche solidi totali disciolti³⁵.
15. Prendere una siringa di plastica da 20 mL e collegarla con un filtro per siringa in poliammide (diametro 25 mm, dimensione dei pori 0,20 μm). Riempire la siringa di plastica con il campione diluito e filtrarne il contenuto in una provetta da centrifuga di plastica da 50 ml applicando pressione. Utilizzare una nuova siringa di plastica e un filtro per siringa per ogni campione per evitare qualsiasi contaminazione incrociata.
    NOTA: I campioni devono essere filtrati per rimuovere eventuali materiali insolubili o particelle solide che potrebbero rimanere non digeriti dopo MAWD. Queste particelle possono interferire con le misure di determinazione elementare intasando i componenti dello strumento. Quando si filtrano i campioni, assicurarsi di scartare le prime due gocce. Utilizzare filtri idrofili (in poliammide) per soluzioni acquose. I filtri idrofobici (PTFE) non sono adatti per la filtrazione di soluzioni acquose in quanto richiedono una pressione applicata più elevata, che potrebbe provocare la rottura della membrana³⁶.
16. Chiudere la provetta da centrifuga in plastica da 50 ml con un tappo a vite e mettere il campione in frigorifero fino alle misurazioni.
    NOTA: I campioni digeriti vengono conservati in frigorifero a temperature più basse per preservarli e prolungarne il tempo di conservazione.

6. Pulizia del recipiente di reazione

1. Dopo che i campioni digeriti sono stati trasferiti in matracci tarati da 50 mL, aggiungere 5,0 mL di HNO₃ al 68% in peso e 5,0 mL di acqua ultrapura con pipette automatiche da 5 mL nei recipienti di reazione.
2. Chiudere i recipienti di reazione con i coperchi di copertura e inserirli nel rack. Trasferire la griglia nella camera del forno a microonde.
3. Applicare il seguente programma microonde: aumento di 15 min a 160 °C, aumento di 10 min a 180 °C, potenza massima 900 W.
4. Monitorare le condizioni di reazione durante il riscaldamento. Al termine del riscaldamento, lasciare raffreddare i recipienti di reazione.
5. Aprire il forno a microonde, rimuovere i recipienti di reazione dalla griglia e aprirli lentamente nella cappa aspirante.
6. Gettare il contenuto dei recipienti di reazione nei contenitori per rifiuti di plastica.
7. Sciacquare i recipienti di reazione con acqua ultrapura per rimuovere il materiale o le sostanze chimiche in eccesso.
8. Asciugare i recipienti di reazione nell'essiccatore a 105 °C prima dell'uso successivo.
   NOTA: La stessa procedura a microonde (tempo, potenza, gradiente di temperatura e volume delle sostanze chimiche) utilizzata per la digestione acida dei campioni può essere utilizzata per la pulizia dei recipienti di reazione. In alternativa, i recipienti di reazione possono essere puliti senza il sistema a microonde immergendoli in HNO₃ concentrato o HCl per diverse ore e risciacquando con acqua ultrapura.

7. Determinazione multi-elemento con ICP-MS

1. Prelevare dal frigorifero le provette da centrifuga in plastica da 50 ml contenenti i campioni digeriti e lasciarle riscaldare a temperatura ambiente.
2. Diluire i campioni di un fattore 10 per diminuire la concentrazione di acido nel campione digerito e per diminuire la concentrazione del componente della matrice del campione. Utilizzando una pipetta automatica, trasferire 2,50 mL del campione in un matraccio tarato di vetro da 25 mL e riempirlo fino al segno con acqua ultrapura.
3. Trasferire i campioni diluiti nelle provette di plastica da 15 mL e posizionarli nelle posizioni appropriate nell'autocampionatore.
4. Preparare lo strumento ICP-MS (vedi Tabella dei Materiali) per le misurazioni:
   1. Accendere la ventilazione e il refrigeratore che alimenta l'ICP-MS con acqua di raffreddamento e raffredda i suoi componenti.
   2. Utilizzare il software compatibile per garantire che la soluzione di risciacquo (1% in peso HNO₃ ) fluisca continuamente dall'autocampionatore all'ICP-MS senza pulsazioni.
   3. Aprire le bombole di gas Ar (purezza al 99,999%) e He (purezza al 99,999%) per alimentare entrambi i gas dell'ICP-MS. Controllare il flusso di gas nel software e, se necessario, regolarlo.
      NOTA: Utilizzare la cella di collisione con il gas He quando sono previste interferenze spettrali dovute alla formazione di ioni poliatomici (ad esempio, ⁴⁰Ar¹⁶O⁺ che interferiscono con ⁵⁶Fe⁺)³⁷.
   4. Avviare il plasma e calibrare lo strumento utilizzando la soluzione di accordatura (vedere la tabella dei materiali).
   5. Una volta calibrato lo strumento (posizione torcia, tensione di guadagno, tensione dell'obiettivo, massa/risoluzione, calibrazione a impulsi/analogica (P/A), calibrazione del database (DB) e convalida), selezionare il metodo di misurazione desiderato ed eseguire le misurazioni.
5. Quando si lavora con campioni sconosciuti, eseguire una determinazione semiquantitativa per ottenere informazioni su quali elementi sono presenti nel campione e sulla loro concentrazione approssimativa.
   NOTA: Si consiglia di diluire ulteriormente i campioni per la determinazione semiquantitativa poiché i rivelatori hanno un limite di concentrazione di elementi che possono rilevare contemporaneamente. Concentrazioni di campione più basse possono prolungare la durata dei componenti dello strumento.
6. Dopo aver ottenuto i dati sulle concentrazioni approssimative degli elementi nei campioni, creare un metodo per la determinazione elementare quantitativa nel software. Selezionare le condizioni operative dell'ICP-MS (Tabella 1) e selezionare gli elementi desiderati (in questo caso Cu, Fe, Mn e Zn). Determinare il numero e le concentrazioni di soluzioni dello standard necessarie per creare una curva di calibrazione (a volte indicata come curva analitica o curva di lavoro) (Tabella 1).
   NOTA: Preparare almeno sei diverse concentrazioni come punti di calibrazione per la curva di calibrazione.
7. Preparare le soluzioni di standard per la curva di calibrazione. Utilizzando pipette automatiche, pipettare il volume richiesto di soluzioni standard multielemento da 100 mg/L in matracci tarati di vetro da 25 mL, per preparare soluzioni standard con le seguenti concentrazioni: 1,0 μg/L, 2,5 μg/L, 5,0 μg/L, 10,0 μg/L, 20,0 μg/L, 30,0 μg/L, 40,0 μg/L e 50,0 μg/L. Riempire i matracci fino al segno con l'1% in peso di HNO₃. Inoltre, preparare un bianco di calibrazione utilizzando la soluzione HNO₃ all'1% in peso.
8. Trasferire le soluzioni preparate dello standard e dei campioni nelle provette di plastica da 15 mL, inserirle nell'autocampionatore e avviare lo strumento seguendo la procedura descritta al punto 7.4.
9. Eseguire la misurazione quantitativa degli elementi selezionati utilizzando la metodologia della curva di calibrazione.
10. Una volta completate le misurazioni, spegnere il plasma, chiudere le forniture di gas Ar e He, spegnere il refrigeratore ICP-MS e spegnere il sistema di ventilazione.

Omogeneizzazione
Tutti i campioni sono stati essiccati a massa costante con l'essiccatore da laboratorio per eliminare l'umidità. Il trasferimento del campione in un essiccatore ha permesso di raffreddarlo a temperatura ambiente senza legare l'umidità dall'ambiente circostante. I campioni di cibo sono stati poi omogeneizzati utilizzando il miscelatore di laboratorio per ottenere una polvere fine. Le particelle omogeneizzate risultanti erano di dimensioni uniformi e distribuite uniformemente, assicurando che i sottocampioni (campioni prelevati da un campione più grande) utilizzati per la digestione acida fossero rappresentativi. I campioni sono stati facilmente rimovibili dal bicchiere del miscelatore con l'aiuto di una spatola di plastica, ad eccezione del campione di carne essiccata, che è stato più difficile da rimuovere a causa del suo contenuto di grassi più elevato. L'elevato contenuto di grassi ha fatto sì che il campione aderisse parzialmente alle pareti di vetro del becher del miscelatore. Il confronto tra campioni freschi, essiccati e omogeneizzati è riportato nella Figura 2.

I componenti dello strumento dovevano essere puliti più volte con acqua ultrapura per eliminare tutte le particelle di cibo rimaste nel miscelatore.

È essenziale assicurarsi che la massa pesata del campione non superi il valore massimo consentito nei recipienti di reazione. La pesatura è stata effettuata utilizzando una bilancia analitica a temperatura costante ed è stata utilizzata una spatola di plastica per evitare la contaminazione con metalli che può derivare dalle spatole metalliche.

Digestione acida
Tutti i campioni utilizzati nel protocollo erano campioni di alimenti contenenti varie quantità di carboidrati, proteine e grassi. HNO3, in combinazione con H2O2, è adatto per la digestione di queste molecole e non sono necessarie altre sostanze chimiche. Le sostanze chimiche sono state trattate in una cappa aspirante poiché HNO3 forma fumi. Dopo aver aggiunto le sostanze chimiche nei recipienti di reazione TFM-PTFE, i coperchi di copertura sono stati montati sulla parte superiore dei recipienti di reazione e sono stati sigillati bene per evitare possibili contaminazioni e perdite di analita. I recipienti di reazione sono stati distribuiti simmetricamente nel rack per garantire un'irradiazione uniforme a microonde all'interno del sistema a microonde.

Durante la digestione acida, la porta del sistema a microonde è stata chiusa e la porta non ha potuto essere aperta fino alla fine del protocollo. L'intero processo di digestione acida può essere monitorato sullo schermo del dispositivo, mostrando la variazione di temperatura nel tempo (Figura 7).

Dopo che la digestione acida è stata completata e le soluzioni dei campioni digeriti si sono raffreddate a temperatura ambiente, i recipienti di reazione sono stati aperti nella cappa aspirante. Sono stati aperti il più lentamente possibile. Se la pressione viene rilasciata troppo rapidamente, anche piccole goccioline della miscela di reazione possono fuoriuscire, con conseguente perdita di analita. Quando i recipienti di reazione sono stati aperti, è stato rilasciato un gas giallo o giallo-arancio (Figura 8). La colorazione dei fumi può essere attribuita al NO2, che forma fumi arancioni a temperature più elevate. L'aumento di pressione nei recipienti di reazione era dovuto all'ossidazione dei campioni di cibo con HNO3, con conseguente formazione di gas come CO2, H2O, NO, ecc. Dopo che i recipienti di reazione sono stati degassati, una soluzione giallo chiaro o incolore del campione digerito è rimasta nel recipiente di reazione, indicando che la digestione acida totale da parte di MAWD era stata raggiunta. Ciò è stato ulteriormente confermato dall'assenza di particelle visibili rimaste nella soluzione.

La fase finale della preparazione del campione prevedeva la diluizione dei campioni digeriti con acqua ultrapura per ridurre l'acidità residua (RA). Valori elevati di RA interferiscono con le misurazioni aumentando il segnale di fondo. La diluizione diminuisce anche la concentrazione di ioni metallici nel campione liquido26. Durante il trasferimento della soluzione dei campioni digeriti in matracci tarati, i componenti del recipiente di reazione sono stati accuratamente risciacquati con acqua ultrapura per trasferire completamente l'analita. Un problema che si verifica è che piccole gocce di acqua ultrapura, che possono contenere l'analita di interesse, aderiscono alle pareti dei recipienti di reazione. Dopo la diluizione con acqua ultrapura fino a 25 mL, tutti i campioni sono diventati incolori. Le soluzioni finali dei campioni digeriti contenevano sali solubili in acqua, poiché gli elementi metallici presenti nel campione reagivano con HNO3 per formare nitrati altamente solubili. Le tecniche di analisi elementare possono determinare gli ioni metallici che formano i sali solubili in acqua. Quando si filtrano le soluzioni diluite, è importante scartare le prime gocce per assicurarsi che eventuali particelle o contaminanti vengano rimossi. Dopo la filtrazione, le soluzioni sono state sigillate ermeticamente per evitare perdite e quindi conservate in frigorifero.

Il limite principale della procedura di digestione acida è la produttività del campione. Il sistema MAWD è in grado di digerire solo un numero limitato di campioni alla volta. Inoltre, ogni fase di digestione e successiva preparazione del campione può richiedere diverse ore per essere completata. Inoltre, anche la pulizia dei recipienti di reazione richiede molto tempo, ma è fondamentale per ridurre al minimo il rischio di contaminazione incrociata tra i campioni.

Determinazione multi-elemento con ICP-MS
Per ogni elemento è stata costruita una curva di calibrazione. Sono stati ottenuti tracciando l'intensità in funzione delle concentrazioni dell'analita (Figura 9). Gli intervalli di concentrazione lineare per tutti gli elementi misurati erano compresi tra 1,0 μg/L e 50,0 μg/L.

Il LOD e il LOQ per ogni elemento sono stati calcolati utilizzando rispettivamente l'equazione 1 e l'equazione 2. In entrambe le equazioni, srappresenta la deviazione standard delle diverse misurazioni del bianco di calibrazione (10 repliche)38,39, mentre b1 rappresenta la pendenza della curva di calibrazione.

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I LOD ottenuti sono stati 0,5 ng/L, 2,8 ng/L, 2,8 ng/L e 3,2 ng/L rispettivamente per Mn, Cu, Fe e Zn. I LOQ ottenuti sono stati 1,6 ng/L, 9,2 ng/L, 9,5 ng/L e 10,8 ng/L rispettivamente per Mn, Cu, Fe e Zn.

Sono state eseguite sei digestioni replicate di ogni campione. Sono state eseguite tre digestioni replicate di ciascun campione senza aggiungere addizioni al campione con soluzioni standard, mentre sono state eseguite tre digestioni replicate con l'aggiunta di una soluzione di una quantità nota di analita standard per testare l'accuratezza (test di recupero della punta40) e la precisione dell'intera metodologia. Per la determinazione dell'accuratezza prima della procedura di digestione, 37,5 μL di soluzione standard multielemento ICP da 100 mg/L sono stati pipettati nei recipienti di reazione contenenti il campione, il che ha comportato un aumento della concentrazione di 15,0 μg/L nei campioni addizionati che sono stati diluiti di un fattore 10. Ciò corrispondeva anche a un aumento di 15,0 μg per grammo di campione per ogni ione metallico misurato. L'accuratezza e la precisione sono state determinate utilizzando rispettivamente Rec e deviazione standard relativa (RSD).

L'accuratezza di un metodo analitico può essere valutata mediante il test di recupero dei picchi. A tale scopo, al campione viene aggiunta una soluzione di una quantità nota di standard di analita, che viene quindi digerito nelle stesse condizioni di reazione dei campioni che non sono addizionati41. Il Rec viene calcolato utilizzando l'equazione 3, dove γi è la concentrazione misurata dei campioni addizionati dopo la digestione, mentre γt rappresenta la concentrazione determinata del campione non addizionato considerando l'aumento della soluzione aggiunta dello standard dell'analita. Le γi e γt sono medie delle tre repliche. Il metodo analitico è considerato accurato quando Rec è compreso tra 80,00% e 120,00%42.

(3)

La precisione di un metodo analitico viene valutata con RSD. Descrive la stretta concordanza tra risultati indipendenti, che sono stati ottenuti attraverso diverse misurazioni replicate. L'RSD viene calcolato utilizzando l'equazione 4, dove sm rappresenta la deviazione standard delle misurazioni replicate per la determinazione della concentrazione, mentre rappresenta il valore medio delle concentrazioni determinate. Il metodo analitico è considerato preciso se il valore RSD è inferiore al 20,00%43.

(4)

Tutti i campioni sono stati diluiti con acqua ultrapura di un fattore 10 prima delle misurazioni ICP-MS (per la prima serie di misurazioni). La diluizione ha diminuito la concentrazione dei componenti della matrice introdotti nell'analizzatore. Inoltre, diluendo il campione, l'AR diminuisce. Un AR elevato potrebbe compromettere l'efficienza di ionizzazione del plasma o causare problemi di interferenza della matrice. Se la concentrazione degli analiti dopo la prima serie di misurazioni è inferiore al LOQ, il fattore di diluizione deve essere inferiore a 10. La quantificazione degli ioni metallici è stata effettuata utilizzando una curva di calibrazione. I valori dei risultati calcolati devono avere la stessa precisione (lo stesso numero di cifre significative) della soluzione della norma utilizzata per la taratura. Il contenuto di ioni metallici nel campione è stato espresso in μg per grammo di peso (μg/g). Ciò è stato ottenuto moltiplicando la concentrazione di massa misurata del campione analizzato per il fattore di diluizione per ottenere la concentrazione nel campione digerito originale. Questa concentrazione di massa è stata quindi moltiplicata per il volume del campione digerito (25 ml) e quindi divisa per la massa pesata iniziale del campione omogeneizzato (la massa ponderata iniziale è la massa del campione che è stata pesata nel recipiente di reazione per la MAWD). Tutti i valori sono riportati come una media di tre repliche.

Il contenuto riportato degli elementi che seguono è riportato come ± sm. Il contenuto di Cu, Mn e Zn nel campione di broccoli era rispettivamente di 5,9 ± 0,5 μg/g, 32,5 ± 2,7 μg/g e 42,8 ± 0,2 μg/g. La concentrazione di massa determinata di Fe nei campioni di broccoli ha superato il limite superiore dell'intervallo di concentrazione lineare della curva di calibrazione (cioè 50,0 μg/L). Pertanto, la soluzione del campione è stata diluita con acqua ultrapura di un fattore 2 ed è stata eseguita la misurazione ICP-MS di questa soluzione. I risultati hanno mostrato che i broccoli contenevano 63,0 ± 1,9 μg/g di Fe.

Per il fungo, il contenuto di Zn, Fe, Cu e Mn era rispettivamente di 35,6 ± 1,4 μg/g, 30,4 ± 1,3 μg/g, 18,5 ± 1,0 μg/g e 5,4 ± 0,3 μg/g. Le salsicce contenevano 42,2 ± 0,9 μg/g di Fe, 25,1 ± 2,6 μg/g di Zn e 1,0 ± 0,1 μg/g di Cu. La determinazione multielemento con ICP-MS della soluzione digerita, che è stata diluita 10 volte, ha mostrato che la concentrazione di Mn era inferiore al limite inferiore dell'intervallo di concentrazione lineare (cioè 1,0 μg/L). Pertanto, la soluzione originale del campione di salsiccia è stata diluita solo di un fattore 5 ed è stata ripetuta la determinazione multielemento con ICP-MS. Il contenuto di Mn nei campioni di salsiccia è stato determinato essere di 0,9 ± 0,3 μg/g. I noodles contenevano 5,4 ± 2,8 μg/g di Zn, 10,3 ± 1,2 μg/g di Fe, 1,6 ± 0,3 μg/g di Cu e 7,5 ± 0,2 μg/g di Mn.

Il Rec per tutti gli analiti misurati in tutti e quattro i campioni è stato compreso tra 80,00% e 120,00%, indicando l'accuratezza del metodo analitico. I calcoli hanno mostrato che il metodo analitico era preciso, in quanto i valori di RSD erano inferiori al 20,00%, a parte l'RSD per lo Zn nei campioni di noodle. I risultati sono riportati nella Tabella 2.

Figura 1: Miscelatore da laboratorio utilizzato per l'omogeneizzazione di campioni alimentari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Confronto tra campioni freschi, essiccati e omogeneizzati. (A-D) Campioni freschi di broccoli, funghi, salsicce e tagliatelle. (E-H) campioni secchi di broccoli, funghi, salsicce e tagliatelle. (I-L) campioni omogeneizzati di broccoli, funghi, salsicce e tagliatelle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Pesatura del campione su una bilancia analitica. Questa operazione viene eseguita dall'alto aprendo il lembo superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sistema a microonde. Il sistema a microonde per la digestione acida con touch screen laterale per la selezione delle condizioni di reazione e il monitoraggio del processo di digestione acida. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Componenti utilizzati per la digestione acida assistita da microonde. (A) Rack con 14 recipienti di reazione per la digestione acida all'interno della camera del forno a microonde. (B) I recipienti di reazione TFM-PTFE sono costituiti da 3 parti. Una volta che i recipienti sono chiusi con i coperchi, né il campione né i gas possono fuoriuscire o entrare nei recipienti di reazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: L'interno dei recipienti di reazione quando vengono aperti nella cappa aspirante. (A) La colorazione giallo-arancio dei fumi è dovuta all'NO2 prodotto durante la digestione acida. (B) La colorazione gialla della soluzione del campione digerito dopo che la maggior parte dei gas è fuoriuscita dal recipiente di reazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Variazione della temperatura nel tempo. Un grafico che mostra la variazione di temperatura in funzione del tempo durante la digestione acida con MAWD. T2 sta per la temperatura della miscela di reazione all'interno dei recipienti di reazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Apertura dei recipienti di reazione sotto la cappa aspirante, dove vengono rilasciati i gas giallo-arancio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Esempio di curva di calibrazione per Mn. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Strumento ICP-MS utilizzato per la determinazione di più elementi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Condizioni operative dello strumento ICP-MS. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Valori Rec e RSD di broccoli, funghi, salsicce e tagliatelle. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.