Campionamento del liquido cerebrospinale e del sangue dalla vena caudale laterale nei ratti durante le registrazioni EEG

Il liquido cerebrospinale (CSF) e il prelievo di sangue sono importanti per identificare e convalidare i biomarcatori dell'epilessia, sia nella ricerca preclinica che in quella clinica ^1,2. Al giorno d'oggi, la diagnosi di epilessia e la maggior parte della ricerca sui biomarcatori dell'epilessia si concentrano sull'EEG e sul neuroimaging ^3,4,5. Questi approcci, tuttavia, presentano diverse limitazioni. Oltre alle misurazioni di routine del cuoio capelluto, in molti casi, l'EEG richiede tecniche invasive come gli elettrodi di profondità⁶. I metodi di imaging cerebrale hanno una scarsa risoluzione temporale e spaziale e sono relativamente costosi e dispendiosi in termini di tempo ^7,8. Per questo motivo, l'identificazione di biomarcatori non invasivi, a basso costo e basati su biofluidi fornirebbe un'alternativa molto interessante. Inoltre, questi biomarcatori di biofluidi potrebbero essere combinati con gli approcci diagnostici disponibili per affinare la loro predittività.

I pazienti con diagnosi di epilessia vengono regolarmente sottoposti all'EEG ^9,10 e al prelievo di sangue 11,12,13,14, e molti anche al prelievo di liquido cerebrospinale per escludere cause potenzialmente letali (ad esempio, infezioni acute, encefalite autoimmune)¹⁵. Questi campioni di sangue e liquor possono essere utilizzati nella ricerca clinica volta a identificare i biomarcatori per l'epilessia. Ad esempio, Hogg e collaboratori hanno scoperto che un aumento di tre frammenti plasmatici di tRNA precede l'insorgenza di convulsioni nell'epilessia umana¹⁴. Allo stesso modo, i livelli di interleuchina-1beta (IL-1β) nel liquido cerebrospinale umano e nel siero, espressi come rapporto tra i livelli di IL-1β nel liquido cerebrospinale rispetto al siero, possono predire lo sviluppo di epilessia post-traumatica dopo una lesione cerebrale traumatica¹⁶. Questi studi evidenziano l'importanza del campionamento dei biofluidi per la ricerca sui biomarcatori dell'epilessia, ma si scontrano con molteplici limitazioni intrinseche agli studi clinici, ad esempio, il fattore cofondatore dei farmaci antiepilettici (AED) nel sangue, la frequente mancanza di informazioni eziologiche, controlli inadeguati, un numero modesto di pazienti e altri^17,18.

La ricerca preclinica offre altre opportunità per studiare le molecole nei biofluidi come potenziali biomarcatori per l'epilessia. Infatti, è possibile prelevare plasma e/o liquido cerebrospinale dagli animali durante l'esecuzione di registrazioni EEG. Inoltre, il campionamento può essere eseguito ripetutamente per più giorni dell'esperimento e un certo numero di controlli abbinati per età, sesso e insulti epilettici possono essere utilizzati per migliorare la robustezza dello studio. Qui, viene descritta in dettaglio una tecnica flessibile per ottenere CSF dalla cisterna magna con prelievo parallelo di plasma dalla vena caudale nei ratti monitorati con EEG. La tecnica presentata presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi. Utilizzando un approccio con ago a farfalla, è possibile raccogliere più volte il liquido cerebrospinale senza compromettere la funzione degli elettrodi EEG o di impianti di testa simili. Ciò rappresenta un perfezionamento delle procedure di prelievo del catetere intratecale, che sono associate a un rischio relativamente elevato di infezione. Inoltre, l'approccio di caduta libera utilizzato per la raccolta del sangue è superiore ad altri approcci di prelievo di sangue della vena caudale a causa del rischio altamente ridotto di emolisi, dovuto al fatto che il sangue non passa attraverso i tubi e non viene applicata alcuna pressione di vuoto. Se eseguito in condizioni rigorose di assenza di germi, il rischio di infezione per gli animali è particolarmente basso. Inoltre, avviando i prelievi di sangue all'estremità della coda degli animali, il prelievo può essere ripetuto più volte. Tali tecniche sono facili da padroneggiare e possono essere applicate in molti studi preclinici sui disturbi del sistema nervoso centrale.

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Ferrara e dal Ministero della Salute (autorizzazione: D.M. 603/2022-PR) in conformità alle linee guida delineate nella Direttiva del Consiglio delle Comunità Europee del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) sulla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali e ad altri fini scientifici. Questo protocollo è specificamente adattato per ulteriori analisi quantitative della reazione a catena della polimerasi (qPCR) di piccoli acidi ribonucleici non codificanti (sncRNA) nel liquido cerebrospinale e nel plasma di ratto ottenuti sotto controllo EEG in animali epilettici. A sua discrezione, si prega di consultare il relativo video JoVE per una migliore comprensione e miglioramenti dell'intervento chirurgico 19,20,21.

1. Preparazione degli animali per l'impianto chirurgico di elettrodi o telemetri

NOTA: La tecnica di chirurgia stereotassica varia a seconda del sistema EEG utilizzato. La sezione del metodo seguente fornisce una descrizione dei passaggi che sono in comune per i due tipi di interventi chirurgici.

1. Utilizzare ratti Sprague-Dawley (SD) (maschi, 7-8 settimane di età, peso 250-290 g) mantenuti in conformità con le leggi locali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Alloggiare gli animali in condizioni standard con libero accesso al cibo e all'acqua potabile.
2. Procedere con la manipolazione dei ratti per alcuni giorni prima dell'intervento chirurgico e delle procedure del protocollo sperimentale.
3. Utilizzare un apparecchio stereotassico per l'impianto di elettrodi o telemetri. Seguire gli standard contemporanei per gli interventi chirurgici asettici. Utilizzare elettrodi e trasmettitori sterili e ben funzionanti.
4. Radere la testa dell'animale con il rasoio elettrico. Indurre l'anestesia nell'animale con la miscela di ketamina (45 mg/kg) e xilazina (7,5 mg/kg) somministrata per via intraperitoneale (i.p.), quindi aggiungere l'anestesia con isoflurano (1,4% in aria; 1,2 ml/min) erogata attraverso una maschera facciale e fissare la testa dell'animale nell'apparato stereotassico.
5. Garantire un'adeguata profondità dell'anestesia testando il riflesso di ritiro del pedale dopo il pizzicamento del cuscinetto del piede sulle zampe posteriori di entrambi gli animali e mantenere l'anestesia con isoflurano fino alla fine dell'intervento chirurgico. Controllare regolarmente la profondità dell'anestetico per tutta la durata della procedura.
6. Applicare una quantità sufficiente di unguento per gli occhi sugli occhi di entrambi gli animali per prevenire danni alla cornea dovuti alla perdita del riflesso delle palpebre causata dall'anestesia.
7. Pulire accuratamente il cuoio capelluto dell'animale con disinfettante liquido ed eseguire un taglio longitudinale lungo 2 cm utilizzando un bisturi sterilizzato. Aprire il cuoio capelluto e applicare clip chirurgiche sui lembi cutanei per mantenerlo aperto.
8. Staccare delicatamente il periostio per esporre il bregma e l'area del cranio attraverso la quale verrà inserito l'elettrodo di registrazione.

2. Impianto chirurgico di elettrodi legati

NOTA: Prima di stabilire la procedura di prelievo del liquido cerebrospinale da puntura di questo protocollo (vedere il punto 9 per i dettagli), sono stati eseguiti ripetuti prelievi del liquido cerebrospinale tramite cannula guida in alcuni ratti non anestetizzati che si muovevano liberamente. Sono stati utilizzati animali cannulati impiantati con elettrodi legati per valutare l'impatto degli impianti a doppia testa sulla registrazione EEG a lungo termine abbinata a più prelievi di liquido cerebrospinale. In questi esperimenti specifici, ai ratti è stata impiantata una cannula guida fittizia posizionata nella cisterna magna, la cui punta è stata inserita stereotassicamente di 7 mm, secondo i protocolli precedentemente pubblicati²². Gli approcci alla chirurgia del doppio impianto erano simili a quelli adottati da alcuni lavoratori in passato per le cannule guida per microdialisi e l'impianto di elettrodi legati^23,24.

1. Utilizzare un braccio del telaio stereotassico, montare il portaelettrodo su di esso e posizionare l'elettrodo in posizione verticale nel supporto. Spostare la punta dell'elettrodo esattamente sopra il bregma. Annota le coordinate anteroposteriori e mediolaterali del bregma e traducile nelle coordinate desiderate.
2. Abbassare l'elettrodo fino a quando la sua punta non tocca quasi il cranio. Segna il punto di perforazione e perfora il cranio nel punto contrassegnato. Fai attenzione a non danneggiare il cervello e le meningi.
3. Praticare quattro o più fori per le viti di ancoraggio e avvitarle nel cranio. Prestare attenzione alle dimensioni dell'elettrodo quando si eseguono i fori per le viti di ancoraggio. La dimensione dell'elettrodo non deve interferire con le viti di ancoraggio posizionate.
4. Abbassare lentamente il braccio stereotassico che porta l'elettrodo sull'asse dorso-ventrale, entrare nel tessuto cerebrale e fermarsi nella posizione desiderata. Fissare il filo di terra dell'elettrodo attorno a una delle viti avvitate nel cranio.
5. Mettere il cemento metacrilico sull'elettrodo e sulle viti che coprono circa la metà dell'altezza del piedistallo dell'elettrodo. Lasciare nuda la metà superiore dell'elettrodo, che si adatta all'estremità del filo di legatura.
6. Sganciare l'elettrodo dal supporto e sollevare il braccio stereotassico. Liberare l'animale dall'apparato stereotassico e dargli cure postoperatorie.
7. Metti l'animale in una gabbia di recupero separata e osservalo ogni 10 minuti fino a quando non si sveglia e deambula. Rimettere l'animale nella sua gabbia standard e in un'altra compagnia di animali non anestetizzati solo dopo essersi completamente ripreso.

3. Impianto chirurgico dei telemetri

NOTA: Utilizzare solo telemetri sterili. Se i telemetri vengono riutilizzati, pulirli e sterilizzarli prima dell'intervento chirurgico secondo le istruzioni del produttore. In questo protocollo è stato utilizzato un telemetro Data Science International (DSI) per la registrazione EEG.

1. Accendere il trasmettitore di telemetria utilizzando un magnete e testare il segnale con una radio a frequenza AM. Verificare la presenza di un segnale forte e chiaro prima dell'intervento. Se necessario, scartare i telemetri funzionanti male.
2. Preparare gli elettrocateteri del telemetro accorciandoli a lunghezze ottimali per i ratti adulti. Staccare il rivestimento in silicone su due conduttori (negativo e positivo), esponendo circa 5 mm del cavo elicoidale in acciaio. Crea un manico ad anello di circa 2 mm di lunghezza e 1 mm di larghezza sulla punta dei cavi.
3. Radere il fianco dell'animale sotto e dietro la spalla sinistra. Disinfettare l'area dell'intervento chirurgico con disinfettante a base di perossidi stabilizzati e attività di ammonio quaternario. Lasciare agire il disinfettante per 15 min.
4. Praticare un'incisione laterale di circa 2 cm appena dietro la spalla dell'animale e creare una tasca sottocutanea di circa 5 cm³ di spazio per il posizionamento del trasmettitore. Posizionare il trasmettitore parallelamente all'asse lungo del corpo, con i cavi diretti in direzione rostrale.
5. Fissare il trasmettitore alla parete interna della tasca sottocutanea con una sutura di cotone 3-0. Usando delle forbici smussate, creare il tunnel sottocutaneo (lungo circa 2,5 cm) attraverso il fianco e il collo dell'animale, collegando così la tasca del trasmettitore con l'incisione della linea mediana praticata sul cuoio capelluto dell'animale al punto 1.6.
6. Prendi entrambi gli elettrocateteri del telemetro con la pinza e tirali verso l'alto attraverso il tunnel, in modo che sporgano dall'uscita dell'incisione del cuoio capelluto. Tenere gli elettrocateteri fuori dall'incisione del cuoio capelluto con le clip per ferite.
7. Utilizzare il telaio stereotassico per individuare le coordinate desiderate per il piombo positivo (rosso) e praticare il foro nel cranio per la punta del piombo positivo (simile al passaggio 2.1.). Fare un altro foro per ancorare la vite verso l'alto al rostro e avvitarla nel cranio.
8. Inserire la punta del piombo positivo sotto la scutellaria e la dura e appoggiarla sulla superficie cerebrale. Collegare la punta ad anello del cavo negativo (bianco) sulla vite. Metti una piccola quantità di cemento metacrilico intorno all'uscita del piombo positivo e al piombo negativo per immobilizzarli sul cranio.
9. Fissare gli elettrocateteri alla parete interna della pelle del cranio con una sutura di cotone 3-0. Assicurarsi che gli elettrocateteri fissi e la sutura di fissaggio non interferiscano con il sito di prelievo del liquido cerebrospinale (cioè una superficie depressa con l'aspetto di un rombo tra la protuberanza occipitale e la colonna vertebrale dell'atlante).
10. Chiudere l'incisione del cuoio capelluto e l'incisione del fianco utilizzando una sutura di cotone 3-0. Applicare disinfettanti sulle ferite. Solo dopo che questi si sono asciugati, applicare una crema antibiotica sulle ferite suturate.

4. Cure post-operatorie

1. Monitorare gli animali per circa 1 ora dopo l'intervento chirurgico fino a quando non sono in posizione verticale e si muovono intorno alla gabbia. Tienili su un tappetino riscaldante per prevenire l'ipotermia. Somministrare agli animali un antibiotico sistemico per prevenire l'infezione e un analgesico sistemico per prevenire il dolore post-chirurgico per 2-3 giorni.
2. Consentire ai ratti di riprendersi per almeno 7 giorni dopo le procedure chirurgiche. Monitorare gli animali almeno una volta al giorno per 3 giorni per segni di dolore o angoscia.

5. Induzione dello stato epilettico nei ratti

NOTA: Per un protocollo dettagliato di induzione dello stato epilettico (SE) necessario per riprodurre l'epilessia del lobo temporale mesiale (mTLE) nei ratti, fare riferimento a Guarino et ^al.25.

1. Dopo una settimana di recupero post-chirurgico, assegnare gli animali in modo casuale ai gruppi: (i) animali di controllo che ricevono il veicolo e (ii) animali epilettici che riceveranno pilocarpina. Utilizzare un numero proporzionalmente più alto di animali per il gruppo epilettico, poiché non tutti i ratti a cui è stata somministrata la pilocarpina sopravviveranno o svilupperanno SE.
2. Il giorno prima dell'induzione SE, somministrare agli animali una dose singola di 127 mg/kg di cloruro di litio disciolto in soluzione salina allo 0,9% (3M) in volume di 1 ml/kg mediante gastrica gavage. Somministrare il litio dell'animale, che aumenta l'efficacia della pilocarpina²⁶, circa 14 ore prima dell'induzione di SE al fine di ridurre la variabilità nel tempo di insorgenza di SE.
3. Circa 14 ore dopo la somministrazione di litio, somministrare ai ratti una singola iniezione di scopolamina di metile (1 mg/kg, per via sottocutanea).
4. Esattamente 30 minuti dopo la somministrazione di scopolamina metilica, somministrare ai ratti una singola iniezione di pilocarpina (50 mg/kg, i.p.) per indurre l'effetto SE. Somministrare scopolamina di metile e veicolo (soluzione di NaCl allo 0,9%) per controllare i ratti.
   1. L'iniezione di pilocarpina induce un comportamento tipico negli animali: convulsioni parziali precoci (movimenti di vibrisse e cenni del capo entro 5 minuti dalla somministrazione di pilocarpina) che evolvono in convulsioni generalizzate ricorrenti (SE) entro 25-30 minuti. Per i ratti che non sviluppano SE entro 30 minuti, somministrare una dose aggiuntiva di pilocarpina (25 mg/kg, i.p.) e, se ancora non sviluppano SE, escluderli dallo studio (SE non-responder).
5. Osservare e valutare il comportamento convulsivo nei ratti ogni 5 minuti a partire da subito dopo l'iniezione di pilocarpina. Usa la scala Racine per ottenere un punteggio^{di 27}.
6. Interrompere l'SE 2 ore dopo l'insorgenza con la somministrazione per via endovenosa di un cocktail di farmaci: diazepam (10 mg/kg), fenobarbital (25 mg/kg) e scopolamina (1 mg/kg).
7. Dai di nuovo ai ratti questo cocktail dopo 4 ore. Infine, dopo altre 4 ore, somministrare ai ratti per via endovenosa l'ultima miscela di farmaci (diazepam 10 mg/kg più scopolamina 1 mg/kg) per interrompere completamente l'attività convulsiva.
8. Iniettare agli animali per via endovenosa una soluzione salina (1 mL di soluzione di NaCl allo 0,9%, pH regolato a 7,0) e nutrirli con una soluzione di saccarosio al 10% per 2-3 giorni dopo l'ES per favorire il recupero dalla perdita di peso corporeo che segue l'ES.
9. Assegnare in modo casuale gli animali sopravvissuti post-SE a diversi gruppi sperimentali in base ai requisiti del protocollo sperimentale specifico. Utilizzare i seguenti criteri di inclusione/esclusione per ulteriori esperimenti nei ratti epilettici: sviluppo di SE convulsivo entro 1 ora dalla somministrazione di pilocarpina, aumento di peso nella prima settimana dopo SE e corretto posizionamento dell'elettrodo nell'area cerebrale di interesse per le registrazioni EEG²⁵.

6. Video-EEG legato nei ratti epilettici e analisi dell'attività convulsiva

NOTA: Questa sezione descrive la procedura sperimentale per registrare i segnali EEG in ratti a stabulazione singola che si muovono liberamente in condizioni standard. La gabbia non deve contenere oggetti in cui l'animale o il cavo di registrazione possono rimanere incastrati A seconda del quesito scientifico da affrontare, si possono analizzare diversi parametri. Nel caso della ricerca sull'epilessia, i tracciati EEG vengono sottoposti a screening per riconoscere le convulsioni elettriche e motorie. I parametri più comuni utilizzati per identificare una crisi epilettica sono l'ampiezza, la frequenza e la durata dell'attività elettrica parossistica.

1. Collocare l'animale in una gabbia pulita nella sala di registrazione per consentire l'assuefazione e ridurre lo stress indotto dal nuovo ambiente. Posizionare la gabbia dell'animale in una gabbia di Faraday per evitare la contaminazione del segnale EGG con il campo elettromagnetico ambientale.
2. Collegare un'estremità del cavo di registrazione al dispositivo di registrazione. Utilizzare un voltmetro per misurare il potenziale elettrico e distinguere tra elettrodi di terra e di riferimento.
3. Collegare l'altra estremità del cavo di registrazione all'elettrodo fissato sulla testa del ratto. A tale scopo, tenere la copertura di cemento sulla testa dell'animale quando si inserisce la spina del cavo nel connettore dell'elettrodo ed evitare di esercitare pressione sulla testa del ratto.
4. Conbilanciare il peso del cavo di registrazione per consentire il libero movimento dell'animale evitando il rischio di attorcigliamento del cavo. A tale scopo, utilizzare un braccio di controbilanciamento o dei commutatori. Anche se il cavo di registrazione è controbilanciato, metti il cibo all'interno della gabbia invece che in un supporto per l'alimentazione, in cui gli animali devono alzarsi per raggiungere il cibo.
5. Prima di iniziare la registrazione, verificare tutte le impostazioni utilizzate per l'acquisizione e l'elaborazione dei dati dall'EEG.
   NOTA: Questo protocollo non fornisce un'introduzione all'apparato necessario per eseguire la registrazione EEG, tuttavia, è necessario applicare un filtraggio e una frequenza di campionamento adeguati per evitare artefatti e disturbi nei segnali EEG.
   1. Per un esperimento di routine, impostare la frequenza di campionamento a 500 Hz e il guadagno di amplificazione a 5000x. Filtrare il segnale utilizzando un filtro da 0,005 Hz oltre a un filtro notch per scartare l'attività elettrica circostante nella banda a 50 Hz (specifica per i paesi europei).
6. Avviare registrazioni video ed EEG e assicurarsi che le tracce corrispondano a un segnale EEG previsto controllando la potenza in bande di frequenza specifiche nel tempo. Registrare un periodo di riferimento prima di iniziare gli interventi sugli animali.
7. Controllare periodicamente gli animali e i tracciati EEG. Non è raro che un cavo di registrazione si stacchi dal connettore dell'elettrodo nella testa del ratto. In tal caso, ricollegare nuovamente l'elettrodo nella testa del ratto a un cavo di registrazione e verificare la presenza di un segnale EEG chiaro.
8. Analizza il segnale EEG manualmente o automaticamente utilizzando un software disponibile in commercio. Se si esegue l'analisi manualmente, eseguire lo screening attraverso la registrazione EEG per identificare le attività simili alle convulsioni. Se si utilizza un software, configurare i parametri chiave di un evento convulsivo, come l'ampiezza, la frequenza e la durata dell'attività elettrica.
   NOTA: La singola crisi epilettica può essere caratterizzata da un'attività elettrica con un'ampiezza 3 volte superiore al basale, frequenza uguale o superiore a 5 Hz e durata di almeno 5 s²².
9. Indipendentemente dal metodo utilizzato, verificare le potenziali convulsioni controllando la registrazione video sincronizzata raccolta contemporaneamente all'EEG.

7. Video-EEG di telemetria nei ratti epilettici e analisi dell'attività convulsiva

NOTA: Questa sezione descrive la procedura sperimentale per registrare i segnali EEG radiotelemetrici in ratti a stabulazione singola che si muovono liberamente in condizioni standard. Il protocollo si basa su un sistema di telemetria disponibile in commercio. Tuttavia, diversi sistemi di telemetria differiscono leggermente nelle loro specifiche funzionali e tecniche. Il sistema deve essere scelto in base alle esigenze del laboratorio e agli obiettivi della ricerca.

1. Posizionare la gabbia domestica dell'animale sopra il ricevitore del segnale. Collegare il ricevitore del segnale al sistema di acquisizione dati e questo a un computer con il software di acquisizione.
2. Accendere l'impianto di telemetria a radiofrequenza posizionando un magnete in prossimità del telemetro inserito nel fianco del ratto. Testare il segnale utilizzando un dispositivo radio. Utilizzare un dispositivo radio universale per testare i telemetri e sentire un chiaro segnale acustico indica che il telemetro è attivato, mentre un suono sfrigolante indica un telemetro disattivato.
   NOTA: La durata della batteria del trasmettitore a radiofrequenza deve essere presa in considerazione prima di definire la durata delle registrazioni.
3. Configurare il software di acquisizione e sincronizzare il segnale di telemetria e il sistema video per acquisire contemporaneamente dati EEG e video. Assegnare un ricevitore di segnale a ciascun trasmettitore impiantato e impostare i valori di calibrazione del trasmettitore. Impostare la frequenza di campionamento a 1000 Hz, il rilevamento del rumore tra -500 mV e +500 mV e l'intervallo di integrazione a 100 ms. Non utilizzare filtri passa-basso e passa-alto.
4. Avviare la telemetria e le registrazioni video. Eseguire la registrazione di base a lungo termine prima di acquisire l'attività epilettica. Analizzare il segnale EEG come descritto nei passaggi 6.8 e 6.9.

8. Procedura di prelievo di sangue dalla vena caudale

NOTA. Il sistema di raccolta del sangue sottovuoto è costituito da un ago a farfalla (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). La tecnica di prelievo del sangue può essere facilmente eseguita da un solo operatore e la procedura richiede circa 5 minuti.

1. Rivestire l'ago a farfalla e il suo tubo con l'1% di K₂EDTA in acqua distillata poco prima dei prelievi, cioè aspirare ed espellere la soluzione di K₂EDTA dal sistema utilizzando la siringa da 1 mL. Tagliare il tubo appena dietro l'ago per raccogliere il sangue goccia a goccia, senza aspirazione (Figura 1A).
2. Mettere il ratto in una camera di induzione e anestetizzarlo con isoflurano (1,4% in aria; 1,2 ml/min). Passare alla montatura stereotassica e mantenere l'anestesia attraverso una maschera facciale. Metti il termoforo sotto l'animale, mantenendo una parte della sua coda a diretto contatto con il tampone.
3. Sposta delicatamente la schiena dell'animale di lato in modo che la vena caudale laterale sia mantenuta in alto.
4. Immergere la coda in acqua tiepida (42 °C) per 2 minuti per dilatare la vena laterale. Pulisci la coda con etanolo al 70% per rendere la vena più visibile. Metti una luce calda sulla coda usando una normale lampadina a incandescenza.
5. Inserire l'ago a farfalla 21G nella vena caudale laterale con una profondità di 5 mm e un angolo di 20°. Raccogliere il sangue in una provetta sottovuoto da 500 μL contenente 5 mg di K₂EDTA come anticoagulante (Figura 1B,C).
6. Rimuovere l'ago e interrompere il flusso sanguigno esercitando pressione sul sito della puntura. Riporta il ratto nella sua gabbia di casa.
7. Capovolgere delicatamente la provetta 10 volte per mescolare l'anticoagulante nel sangue. Praticare dei fori di circa 1,5 cm di profondità nel ghiaccio per accogliere le provette di raccolta. Mettere delicatamente e verticalmente il campione sul ghiaccio.
8. Centrifugare il campione di sangue in una centrifuga refrigerata (4 °C) a 1300 x g per 10 minuti per separare il plasma. Eseguire questa procedura entro 1 ora al massimo.
9. Prelevare circa 200 μL di plasma, evitando lo strato di globuli rossi e bianchi. Inserire il plasma prelevato nella microprovetta sterile da 0,2 ml. Se necessario, conservare a 4 °C per un massimo di 1 ora dopo la centrifugazione.
10. Mettere da parte 5 μL di campione per il controllo di qualità. Conservare il campione a -80 °C fino all'analisi.
    NOTA: Non utilizzare il vuoto anche se raccomandato da alcuni ricercatori²⁸ o mungere la coda durante le procedure descritte al punto 8.5 per ottenere più sangue, poiché diminuisce la qualità del campione per le successive analisi di quantificazione dell'sncRNA (vedere i risultati rappresentativi per i dettagli). Tenere presente che nel ratto, la quantità massima di sangue che può essere prelevata in una sola volta è <10% del suo volume totale di sangue (cioè circa 1,6-1,9 ml in un ratto di 250-300 g) e <15% del volume totale di sangue (circa 2,64 ml) in 1 mese²⁹. In questo protocollo, viene utilizzato un massimo di 500 μL di prelievo di sangue in una singola occasione per un massimo di cinque volte in un singolo animale^30,31.

9. Procedura di raccolta del liquido cerebrospinale

NOTA. La tecnica può essere facilmente eseguita da un solo operatore e la procedura richiede circa 2-4 minuti. I materiali utilizzati per la raccolta del liquido cerebrospinale sono aghi a farfalla sottovuoto monouso a basso costo e tubi di estrazione. In questo protocollo, per creare il vuoto viene utilizzato un set di infusione ad ala di farfalla collegato a una siringa sterile (Figura 2A).

1. Preparare l'ago a farfalla 23G, tagliando la protezione del manicotto di plastica in modo che l'estremità dell'ago nudo sia esposta di 7 mm per evitare che penetri più di 7 mm di profondità nella cisterna magna durante l'estrazione (Figura 2B).
2. Collegare l'ago a farfalla dotato di tubo in polimero a una siringa da 1 ml.
3. Mettere il ratto in una camera di induzione e anestetizzarlo con isoflurano (1,4% nell'aria; 1,2 ml/min). Passare il flusso di isoflurano al telaio stereotassico e mantenere l'anestesia erogata attraverso una maschera facciale. Rimuovi il pelo dalla parte posteriore della testa e del collo del ratto con un rasoio.
4. Fissare la testa del ratto con le barre auricolari. Abbassare la testa dell'animale verso il basso di circa 45° verticalmente, spostandosi verso il basso lungo la barra nasale della cornice stereotassica (Figura 2C). Ispeziona la testa posteriore dell'animale e trova una superficie leggermente depressa con l'aspetto di un rombo, tra la protuberanza occipitale e la colonna vertebrale dell'atlante.
5. Strofinare questa superficie con etanolo al 70% per renderla più visibile e disinfettarla.
6. Inserire l'ago a farfalla verticalmente al centro della superficie depressa a forma di rombo nella cisterna magna per la raccolta del liquido cerebrospinale fino a quando il movimento non viene bloccato tagliando a misura la protezione del manicotto di plastica dell'ago (Figura 2D). Tirare delicatamente indietro il pistone della siringa da 1 mL per far fluire lentamente il liquido cerebrospinale attraverso l'ago.
7. Raccogliere circa 100 μL di liquido cerebrospinale in tubi polimerici (Figura 2D). Evitare di far entrare sangue o qualsiasi altra contaminazione visibile. Pizzicare il tubo di polimero molto vicino all'ago della farfalla e tagliare il tubo a questo punto.
8. Aspirare il campione trasparente (non contaminato) nella siringa. Scartare il campione contaminato, se la contaminazione visibile entra nel tubo di raccolta.
9. Espellere il campione nella microprovetta sterile da 0,2 mL e conservare su ghiaccio per un massimo di 1 ora.
10. Disinfettare il sito di prelievo del liquido cerebrospinale sulla testa dell'animale. Rimuovere il ratto dalla struttura stereotassica e rimetterlo nella sua gabbia.
11. Mettere da parte 2 μL di campione per il controllo di qualità. Conservare il resto del campione a -80 °C per ulteriori analisi.
    NOTA: Nei ratti, se vengono eseguiti ripetutamente prelievi multipli di liquido cerebrospinale, il volume raccomandato da prelevare ad ogni prelievo è di 100 μL³². In questo protocollo, è stato eseguito un massimo di 100 μL di liquido cerebrospinale in una singola occasione con un prelievo massimo di 5 volte in 15 giorni in un singolo animale.

10. Analisi spettrofotometrica della qualità del campione

NOTA: Dopo un'adeguata raccolta dei campioni di liquido cerebrospinale e plasma, i campioni sono pronti per le analisi spettrofotometriche e non richiedono alcuna manipolazione specifica. Misurare l'assorbanza dell'emoglobina mediante spettrofotometria UV a 414 nm per valutare il rischio di emolisi nei campioni. Utilizzare un valore di assorbanza di cut-off di 0,25 nei campioni di ratto. La scelta di questo limite può dipendere dalla successiva analisi qPCR e dai suoi requisiti specifici per la quantificazione degli sncRNA.

1. Accendere lo spettrofotometro UV. Selezionare il metodo per la misurazione dell'assorbanza a una singola lunghezza d'onda di 414 nm per PLASMA o CSF. Fare clic su Next (Avanti).
2. Sciacquare la cuvetta da 1 mm con acqua purificata. Versare 5 μL di etanolo al 70% sul punto di misurazione della cuvetta. Asciugare con un tovagliolo di carta e strofinare con carta velina priva di lanugine. Controlla se è perfettamente trasparente.
3. Versare 1,5 μL di acqua purificata nella cuvetta da 1 mm e chiuderla. Inserire la cuvetta nella camera di misura dello spettrofotometro e misurare l'assorbanza del campione bianco facendo clic sul pulsante Blank . Verificare che il valore di assorbanza a 414 nm sia 0,000.
4. Asciugare la cuvetta con un tovagliolo di carta e pulirla con carta velina priva di lanugine. Controlla se è perfettamente trasparente.
5. Inserire 1,5 μL di campione nella cuvetta da 1 mm e chiuderla. Inserire la cuvetta nella camera di misura dello spettrofotometro. Misurare il campione, facendo clic sul pulsante Campione . Controllare l'assorbanza del campione a 414 nm e annotarla.
6. Procedere alla quantificazione dell'assorbanza dell'emoglobina in tutti i campioni disponibili. Misurare il campione bianco prima di qualsiasi campione di plasma o liquido cerebrospinale, facendo clic alternativamente sui pulsanti Bianco e Campione .
7. Conservare i campioni con A414 nm < 0,25 a -80 °C e scartare i campioni se A414 nm > 0,25.
8. Sciacquare la cuvetta da 1 mm con acqua purificata ed etanolo al 70%, in sequenza. Asciugare la cuvetta.
9. Chiudere la cuvetta vuota nella camera di misura per evitare che si polverizzi. Spegnere lo spettrofotometro.

L'esito di diverse procedure di CSF e prelievo di sangue eseguite in 9 ratti epilettici di controllo e 18 ratti epilettici cronici, tutti impiantati con elettrodi a 1 mese dopo l'ES, è riportato in termini di tasso di successo. Dopo l'impianto, tutti i ratti sono stati monitorati con video-EEG per 1 mese, durante il quale il liquido cerebrospinale più il sangue è stato prelevato 5 volte ogni 3 giorni durante le ultime due settimane dell'esperimento (cioè ai giorni 52, 55, 58, 61 e 64 post-SE; dpSE). I dati provenienti da prelievi multipli in animali diversi sono stati utilizzati per confrontare il tasso di successo della raccolta di liquido cerebrospinale nei ratti dotati di impianto a doppia testa (incannulati per il prelievo di liquido cerebrospinale) con il tasso di successo della raccolta di liquido cerebrospinale (effettuata mediante puntura di cisterna magna) solo in animali impiantati con elettrodi legati o di telemetria (Tabella 1). In diversi animali, è stato valutato l'impatto della raccolta di sangue sotto vuoto o della mungitura della coda sulla qualità dei campioni di plasma (Tabella 2). A tale scopo, è stata utilizzata l'analisi spettrofotometrica UV a 414 nm per la rilevazione dell'emoglobina libera. Per le analisi statistiche è stato utilizzato un software commerciale e sono stati utilizzati test comparativi multipli di Kruskal-Wallis o ANOVA unidirezionale con test comparativi multipli post-hoc di Tukey (p<0,05 considerati statisticamente significativi). I dati sono espressi come media ± SEM.

Tasso di successo del campionamento multiplo del liquido cerebrospinale in ratti incannulati e perforati
Il liquido cerebrospinale è stato campionato 5 volte in 2 settimane in 3 gruppi di ratti: (i) ratti con elettrodo impiantato cannulato e legato (gruppo di animali CT); in questi, il prelievo del liquido cerebrospinale è stato eseguito tramite cannula guida fittizia e tubo in PTFE giunto alla siringa da 1 mL quando non erano anestetizzati e si muovevano liberamente sotto video-EEG; (ii) ratti perforati (fase 9) e impiantati con elettrodi legati (gruppo PT); (iii) ratti perforati ed elettrodi di telemetria impiantati (gruppo PTe). Sono stati utilizzati un totale di 9 animali per gruppo (6 ratti epilettici e 3 ratti di controllo). È stato valutato il numero di collezioni andate a buon fine per oltre 5 volte. Il tasso di successo è stato simile nei ratti perforati: 86,7% ± 5,8% negli animali legati e 88,9% ± 4,8% negli animali con elettrodo di telemetria impiantato. Invece, nei ratti incannulati, il tasso è stato ridotto anche se non significativamente diverso (71,1% ± 8,9%, Tabella 1). Tali risultati indicano che la cannula sulla testa degli animali può interferire con il campionamento ripetuto del liquido cerebrospinale e compromettere gli studi longitudinali. La tecnica di puntura è più adatta per prelievi multipli di liquido cerebrospinale in animali impiantati con elettrodi.

Impatto della mungitura sottovuoto e della coda sul metodo di raccolta del plasma
Il sangue è stato raccolto 5 volte da 9 ratti (6 epilettici e 3 ratti di controllo) ai giorni 52, 55, 58, 61 e 64 post-SE e la qualità del plasma è stata valutata per l'emolisi visivamente e mediante spettrofotometria UV a 414 nm. Per ottenere il primo campione in ciascun ratto, è stato utilizzato il prelievo del vuoto tramite un ago a farfalla da 21G collegato a una siringa da 1 mL. Con il secondo campione, il prelievo a goccia e il sistema dell'ago a farfalla 21G sono stati impiegati durante la mungitura simultanea della coda. Per ottenere il 3°-5° campione, è stata utilizzata la procedura di prelievo a goccia senza mungere la coda (descritta al punto 9).

Quando si impiegava un vuoto, il plasma era di colore rosa sotto l'ispezione visiva e il valore medio di assorbanza dei campioni di 9 ratti era 0,647 ± 0,067 (Tabella 2, Figura 3). Risultati simili sono stati ottenuti se si è impiegata la mungitura della coda durante la procedura: plasma di colore rosa con assorbanza media di 0,620 ± 0,043 (Tabella 2, Figura 3). Al contrario, con il ritiro a goccia abilitato dalla gravità e il sistema di aghi a farfalla 21G, i valori medi di assorbanza plasmatica sono stati significativamente ridotti (0,226 ± 0,017 a 58 dpSE; 0,223 ± -0,09 a 61 dpSE; 0,226 ± 0,018 a 64 dpSE; Tabella 2, Figura 3) rispetto al metodo di mungitura a vuoto o di coda. Inoltre, i campioni di plasma a goccia erano per lo più trasparenti. Valori più elevati di assorbanza (52 e 55 dpSE) sono correlati con il colore rosa dei campioni (dati non mostrati). Questi risultati possono suggerire che l'ultimo metodo è il migliore per ottenere campioni di altissima qualità per le analisi.

Figura 1: Fasi chiave del flusso di lavoro del campionamento del plasma. (A) Materiali necessari per il prelievo di sangue e ratto nel quadro stereotassico, pronti per la raccolta; (B, C) Ingrandimenti della coda con ago a farfalla 21G inserito nella vena caudale laterale e goccia di sangue che cade lungo le pareti della provetta di raccolta con un anticoagulante. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fasi chiave del flusso di lavoro di campionamento del liquido cerebrospinale (CSF). (A) Materiali necessari per il prelievo del liquido cerebrospinale e ratto nel quadro stereotassico, poco prima della raccolta; (B) La preparazione dell'ago a farfalla 23G tagliando la sua protezione del manicotto di plastica in modo che l'estremità dell'ago nudo sia esposta per 7 mm per garantire una corretta penetrazione nella cisterna magna; (C) La testa del ratto è inclinata verso il basso di 45° durante l'estrazione. (D) Ingrandimento sul sito romboidale con un ago a farfalla inserito nella cisterna magna. Si noti il liquido cerebrospinale che sale nel tubo, indicato dalla punta del marcatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione della qualità dei campioni di plasma. Grado di emolisi misurato a 414 nm per l'emoglobina libera mediante spettroscopia UV in campioni di plasma di 9 animali in 5 time-point (52, 55, 58, 61 e 64 giorni dopo lo stato epilettico, dpSE) utilizzando diversi metodi: giorno 52 - la tecnica del vuoto; giorno 55 - la mungitura della coda; Giorni 58-64 sono state impiegate le tecniche di goccia. La diminuzione dell'emoglobina libera nel plasma ottenuta con la tecnica a goccia rispetto ai metodi di mungitura sottovuoto e di coda è stata significativa (*p <0,05 secondo l'ANOVA unidirezionale e il test di confronto multiplo post-hoc di Tukey). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Percentuali di successo dei prelievi del QCS. Confronto delle percentuali di successo del ritiro ripetuto del liquido cerebrospinale in tre gruppi sperimentali di animali espresso come percentuale di ritiri riusciti nell'arco di 5 giorni. Il valore 1 è stato assegnato al prelievo riuscito di > 100 μL di liquido cerebrospinale limpido; il valore zero è stato assegnato a prelievi < 100 μL e/o di liquido cerebrospinale poco chiaro. Abbreviazioni: N/A - l'assenza di prelievo dovuta alla perdita di cannula durante la procedura di campionamento (solo animali CT); TC - cannulato legato; PT - forato legato; PTe - elettrodi di telemetria perforati impiantati. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Valutazione dell'emolisi in campioni di plasma. Risultati delle misurazioni dell'emolisi in 5 time-point utilizzando tre diversi metodi di prelievo del sangue: giorno 52 - la tecnica del vuoto; giorno 55 - la mungitura della coda; giorni 58-64 le tecniche di goccia. Valori >0,3 di assorbanza correlati con il colore rosa dei campioni. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.