Microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione per una caratterizzazione strutturale dell'amiloide label-free

Sommario

Questo articolo descrive come la microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione potrebbe essere applicata per caratterizzare l'organizzazione locale all'interno di sovrastrutture-sferuliti amiloidi label-free. Descrive inoltre come preparare e misurare il campione, assemblare la configurazione richiesta e analizzare i dati per ottenere informazioni sull'organizzazione locale delle fibrille amiloidi.

Abstract

Rispetto alla sua controparte a un fotone, l'eccitazione a due fotoni è vantaggiosa per gli esperimenti di bioimaging a causa della sua minore fototossicità, della penetrazione più profonda nei tessuti, del funzionamento efficiente in sistemi densamente impacchettati e della ridotta fotoselezione angolare dei fluorofori. Pertanto, l'introduzione dell'analisi di polarizzazione nella microscopia a fluorescenza a due fotoni (2PFM) fornisce una determinazione più precisa dell'organizzazione molecolare in un campione rispetto ai metodi di imaging standard basati su processi ottici lineari. In questo lavoro, ci concentriamo sulla 2PFM sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) e sulla sua applicazione nella determinazione dell'ordinamento molecolare all'interno di biostrutture complesse-sferuliti amiloidi. Le malattie neurodegenerative come l'Alzheimer o il Parkinson sono spesso diagnosticate attraverso il rilevamento di aggregati amiloidi-proteici formatisi a causa di un alterato processo di misfolding proteico. L'esplorazione della loro struttura porta a una migliore comprensione del loro percorso di creazione e, di conseguenza, allo sviluppo di metodi diagnostici più sensibili. Questo articolo presenta il ps-2PFM adattato per la determinazione dell'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sferuliti di insulina bovina e degli aggregati proteici amiloidogenici sferici. Inoltre, dimostriamo che la tecnica proposta può risolvere l'organizzazione tridimensionale delle fibrille all'interno della sferulite.

Introduzione

Negli ultimi decenni, sebbene vi sia stato uno sviluppo significativo di numerose tecniche di microscopia a fluorescenza per il bioimaging delle proteine e dei loro aggregati¹, solo alcune sono state utilizzate per risolvere il loro ordinamento locale all'interno del campione ^2,3. La^microscopia a fluorescenza 4 è stata utilizzata per studiare l'eterogeneità strutturale intrinseca delle sovrastrutture-sferuliti amiloidi. Inoltre, la determinazione quantitativa dell'ordinamento locale all'interno di biostrutture complesse e densamente impacchettate come le sferuliti potrebbe essere risolta utilizzando metodi sensibili alla polarizzazione³. Tuttavia, le tecniche di fluorescenza standard con penetrazione superficiale nei tessuti sono limitate poiché l'utilizzo di lunghezze d'onda UV-VIS per eccitare i fluorofori in vivo porta a un'elevata diffusione della luce tissutale⁵. Inoltre, tale imaging richiede spesso la progettazione e il legame di sonde fluorescenti specifiche a una biomolecola mirata, aumentando così il costo e la quantità di lavoro necessario per eseguire l'imaging.

Recentemente, per affrontare questi problemi, il nostro team ha adattato la microscopia a fluorescenza eccitata a due fotoni sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) per l'imaging label-free di strutture biologiche ^6,7. Ps-2PFM consente di misurare la dipendenza dell'intensità della fluorescenza a due fotoni dalla direzione della polarizzazione lineare del fascio di eccitazione e di analizzare la polarizzazione della fluorescenza emessa⁸. L'implementazione di questa tecnica richiede l'integrazione del percorso di eccitazione standard del microscopio multi-fotone (Figura 1) con una piastra a semionda per controllare il piano di polarizzazione della luce. Quindi, i grafici polari, che descrivono la dipendenza dell'intensità della fluorescenza eccitata a due fotoni dalla polarizzazione del raggio laser di eccitazione, vengono creati dai segnali raccolti da due fotodiodi a valanga, raccogliendo così le due componenti reciprocamente perpendicolari della polarizzazione della fluorescenza.

L'ultimo passaggio è il processo di analisi dei dati, tenendo conto dell'impatto degli elementi ottici, come gli specchi dicroici o un obiettivo ad alta apertura numerica, sulla polarizzazione. A causa della natura del processo a due fotoni, questo metodo fornisce sia una ridotta fotoselezione angolare che una migliore risoluzione assiale, poiché l'eccitazione a due fotoni dei fluorofori al di fuori del piano focale è probabilisticamente limitata. È stato inoltre dimostrato che metodi simili potrebbero essere implementati con successo per l'imaging in vivo di sonde nel vicino infrarosso (NIR) per l'imaging dei tessuti profondi⁹. Ps-2PFM è stato precedentemente applicato a fluorofori di immagine nelle membrane cellulari¹⁰ e DNA^11,12, nonché a marcatori fluorescenti non standard di sistemi biologici, come le nanoparticelle d'oro¹³. Tuttavia, in tutti questi esempi, le informazioni sull'organizzazione delle biomolecole sono state ottenute indirettamente e hanno richiesto un orientamento reciproco predefinito tra un fluoroforo e una biomolecola.

In uno dei nostri recenti articoli, abbiamo dimostrato che la ps-2PFM potrebbe essere applicata con successo per determinare la polarizzazione locale dell'autofluorescenza delle sovrastrutture amiloidi e la fluorescenza dalla tioflavina T, un colorante specifico per l'amiloide, legato alle fibrille amiloidi nelle sferuliti⁶. Inoltre, in un altro, abbiamo dimostrato che ps-2PFM potrebbe essere utilizzato per rilevare l'orientamento delle fibrille amiloidi all'interno delle sferuliti amiloidi in un regime di dimensioni inferiori al micron, che è stato confermato correlandolo con l'imaging al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)⁷. Il raggiungimento di questo risultato è stato possibile grazie a i) autofluorescenza intrinseca di sferuliti-amiloidi, quando eccitate con uno o due fotoni, mostrano un'autofluorescenza intrinseca con massimi di emissione situati in un intervallo compreso tra 450 e 500 nm e sezioni d'urto di assorbimento a due fotoni paragonabili ai coloranti fluorescenti standard¹⁴, ii) modelli matematici introdotti in precedenza per descrivere come ps-2PEF di coloranti che marcano membrane biologiche e strutture del DNA potrebbero essere applicati a fluorescenza esibita da sferuliti e coloranti ad essi legati ^8,11,15. Pertanto, prima di procedere con l'analisi, consigliamo vivamente di esaminare la teoria richiesta descritta sia nel testo principale che nelle informazioni di supporto del nostro primo articolo riguardante questo argomento⁶. Qui, presentiamo il protocollo su come applicare la tecnica ps-2PFM per una caratterizzazione strutturale amiloide label-free di sferuliti di insulina bovina.

Protocollo

1. Preparazione dei vetrini del microscopio con sferuliti completamente cresciute

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo. Tutte le soluzioni sono state preparate con acqua deionizzata (18,2 MΩ·cm a 25 °C) ottenuta dal sistema di purificazione dell'acqua.

1. Incubare le sferuliti amiloidi in base al protocollo descritto da Krebs et al¹⁶. con alcune modifiche, come descritto di seguito.
   1. Pesare 10 mg di insulina in polvere in una provetta da 1,5 ml.
   2. Sciogliere la polvere con un'aliquota di 1 mL della soluzione deionizzata di H₂O/HCl (pH 1,5).
   3. Sigillare il campione con il nastro adesivo e metterlo in un miscelatore termico per incubare per 24 ore a 70 °C (0 giri/min).
      NOTA: Per eseguire l'imaging delle amiloidi nel loro ambiente nativo (cioè idratato) e prevenire la deformazione del campione dovuta alla disidratazione, è necessario preparare i vetrini del microscopio secondo la seguente descrizione (schema mostrato nella Figura 2).
2. Lavare accuratamente il vetrino del microscopio con acqua.
3. Immergere i vetrini nel metanolo e lasciarli asciugare in condizioni ambientali su un panno privo di polvere.
4. Prelevare un'aliquota di 100 μL della soluzione di sferulite dalla provetta con una pipetta automatica (passaggio 1.1.2) e aggiungerla al pozzetto situato nell'area centrale del vetrino del microscopio.
5. Coprire la soluzione con un vetrino coprioggetti, evitando la formazione di bolle d'aria.
6. Depositare il mountant lungo i bordi del vetrino coprioggetti sul vetrino con una pipetta automatica per sigillare la soluzione nativa delle sferuliti.
   NOTA: È di grande importanza depositare il supporto per vetrini sia sul vetrino coprioggetto che sulle superfici dei vetrini. Fallo sotto la cappa fumante a causa della tossicità del solvente volatile (xilene). Vedere il riquadro nella Figura 2.
7. Lasciare il campione del microscopio in condizioni ambientali affinché il supporto si indurisca.
   NOTA: Il processo di indurimento dipende dalla temperatura e dall'umidità, ma deve essere completato entro 12 ore.
8. Controllare se le sferuliti di insulina si sono formate correttamente utilizzando un microscopio ottico polarizzato (POM) con polarizzatori incrociati. Scansiona il campione alla ricerca di un modello caratteristico di aree luminose, chiamato croce di Malta, come mostrato nella Figura 3.
   NOTA: Le sferuliti amiloidi possono essere definite come sovrastrutture sferiche caratterizzate da una morfologia eterogenea con una struttura core-shell. Nel dettaglio, sono composti da un nucleo amorfo e fibrille amiloidi a crescita radiale¹⁶. A causa del carattere anisotropo delle strutture sferiche, possono interagire distintamente con la luce polarizzata (ad esempio, per rifrazione) e alterare la loro fase, che può essere facilmente osservata sotto POM con polarizzatori incrociati. Questo metodo è stato utilizzato per studiare solo le sferuliti completamente sviluppate, caratterizzate da un modello di croce maltese simile a un modello. Di conseguenza, gli aggregati o le sferuliti strutturalmente distorte sono stati esclusi da ulteriori indagini.

2. Costruzione e allineamento del sistema

NOTA: Una rappresentazione schematica di un microscopio a due fotoni sensibile alla polarizzazione è riportata nella Figura 1.

1. Installare un laser a femtosecondi con la sintonizzabilità della lunghezza d'onda di uscita nell'intervallo 690-1.080 nm, ad esempio, operando su un laser Ti: Zaffiro con ~100 impulsi fs di frequenza di ripetizione di 80 MHz.
2. Aggiungere una piastra a semionda montata su uno stadio di rotazione al percorso di eccitazione della configurazione per controllare la polarizzazione della luce incidente nel piano del campione del microscopio XY.
3. Installare lo specchio dicroico per tagliare il fascio di eccitazione dall'ottica di rilevamento.
   NOTA: Le caratteristiche ottiche di uno specchio dicroico devono consentire di riflettere il fascio di eccitazione (al campione) nell'intervallo di lunghezze d'onda NIR ed essere contemporaneamente trasparente per l'intervallo di lunghezze d'onda corrispondente all'emissione dai campioni.
4. Installare uno stadio di scansione piezoelettrico per le scansioni raster all'interno del piano XY per una Z scelta.
5. Montare l'obiettivo ad immersione ad alto NA, ad esempio un obiettivo a immersione in olio apocromatico 100x/1.4 NA.
   NOTA: Poiché l'intera configurazione funziona in modalità epifluorescenza, i segnali incidenti ed emessi passano dallo stesso obiettivo.
6. Nel percorso di emissione, aggiungere un divisore di fascio polarizzatore che divide l'emissione eccitata a due fotoni in due componenti polarizzate ortogonalmente (I,_X e I,_Y)
7. Installare due fotodiodi a valanga (APD) per il conteggio dei fotoni in una configurazione che consenta loro di raccogliere la luce trasferita e riflessa utilizzando rispettivamente il divisore di fascio (Figura 1).
8. Montare filtri di cut-off corretti dipendenti dalla lunghezza d'onda sul percorso di eccitazione ed emissione del sistema, ad esempio un filtro passa-lungo da 800 nm direttamente nel percorso ottico di eccitazione e un filtro passa-corto da 700 nel percorso di emissione.
   NOTA: Analizzare gli spettri di emissione della sferulite in modo da escludere qualsiasi potenziale contributo della generazione di seconda armonica (SHG) o della luce laser utilizzando i filtri di emissione corretti. Vale anche la pena notare che questo sistema dovrebbe anche consentire misurazioni di SHG sensibile alla polarizzazione, che potrebbe essere utilizzato per risolvere l'ordine delle biomolecole all'interno dei campioni. Tuttavia, l'analisi dei dati del segnale SHG differisce dalla fluorescenza, che, in modo più dettagliato, è stata descritta da Aït-Belkacem et ^al.17.
9. Allineare l'intero sistema (utilizzando la modalità di allineamento incorporata in molti laser) fino a quando non vengono raccolte intensità di segnale simili utilizzando entrambi i fotodiodi.
10. Controllare se il fascio di eccitazione focalizzato dall'obiettivo ad alto NA e ripreso su una fotocamera ha una forma circolare concentrica come mostrato nella Figura 4A.
11. Regolare il tempo di scansione e la potenza corrispondente per ridurre al minimo il danno indotto dal laser incidente sul campione. Un esemplare di bruciatura puntiforme è presentato nella Figura 4B. Misurare la potenza nominale utilizzando un misuratore di potenza digitale portatile collegato a un sensore di potenza a fotodiodo situato all'ingresso del corpo del microscopio.
    NOTA: I campioni biologici possono essere facilmente bruciati grazie all'illuminazione laser. In questo caso, l'intervallo di potenza di 100-900 μW (nel punto focale dell'obiettivo) è risultato essere un eccellente compromesso tra la stabilità del campione e l'emissione intensa.
12. Prima della misurazione del campione, testare la qualità dell'allineamento dell'ottica con un campione di riferimento isotropo (ad esempio, fluoresceina incorporata nel polimero amorfo). Per eseguire il controllo di calibrazione, seguire la procedura descritta nella sezione 3 utilizzando un riferimento isotropo invece di un campione di amiloide.
    NOTA: Supponendo che la configurazione microscopica sia idealmente regolata per il campione con proprietà isotrope, entrambe le componenti di emissione 2P (I_X e I_Y) rilevate con due APD dovrebbero essere caratterizzate dalla stessa intensità (Figura 4C).

3. Misurazione delle sferuliti di insulina bovina

NOTA: Per eseguire tutte le misure ps-2PF descritte, è stato utilizzato un software scritto a mano, che controlla le posizioni dello stadio piezoelettrico e della piastra a semionda e raccoglie il segnale da entrambi i fotodiodi, consentendo di tracciare le scansioni XY (scansioni raster) da aree selezionate su vetrini da microscopio e grafici polari da coordinate specifiche del campione. Sono state inoltre aggiunte ulteriori note al protocollo, che consentiranno agli utenti di eseguire la misurazione senza di esso, poiché sia lo stadio piezoelettrico che lo stadio di rotazione utilizzati per ruotare la piastra a semionda potrebbero essere controllati utilizzando i propri controller o il software corrispondente. Tuttavia, si consiglia vivamente di scrivere un algoritmo che combini l'angolo di rotazione di una piastra a semionda con l'intensità 2PEF raccolta con entrambi i fotodiodi, poiché questa correlazione (grafici polari) è fondamentale per una corretta analisi dei dati che si traduce in informazioni strutturali.

1. Montare il provino con le sferuliti sul tavolino piezoelettrico (immobilizzare il vetrino con del nastro adesivo). Assicurarsi di montarlo in modo che un sottile lato di vetro (vetrino coprioggetti) sia rivolto verso l'obiettivo, poiché gli obiettivi numerici elevati sono caratterizzati da distanze di lavoro relativamente brevi.
   NOTA: Poiché si utilizza l'immersione in olio, è necessario applicare una piccola goccia di olio minerale sull'obiettivo prima di montare e mettere a fuoco il campione.
2. Cambiando le posizioni XY e Z utilizzando le manopole del microscopio, focalizzare l'obiettivo su una delle sferuliti presenti nella soluzione, ma tenere presente che, poiché i diametri delle sferuliti sono tipicamente nell'intervallo delle decine di μm, mettere a fuoco all'interno dell'area centrale dell'intera struttura. Cerca aloni bianchi e neri intorno alla sferulite specifica come segni di messa a fuoco inferiore e superiore, rispettivamente. Regolare l'asse "Z" in modo che si trovi tra questi estremi.
   NOTA: È importante trovare un campione isolato senza difetti strutturali. Spheruliti estremamente piccole possono allontanarsi a causa della sollecitazione del materiale introdotta dall'obiettivo, mentre le strutture più grandi sono probabilmente aggregate o altamente distorte.
3. Centrare la sferulite nel campo visivo del piano microscopico osservato e determinare la dimensione della scansione XY osservando quanti passi del piezostadio nelle direzioni X e Y (visualizzati sul controller del piezostadio o nel suo software) sono necessari per coprire l'area dell'intera struttura.
   NOTA: Si consiglia di impostare il sistema in modo tale che l'inizio della scansione XY si trovi vicino a uno degli angoli della sferulite e coincida con la posizione zero del tavolino (X e Y = 0)
4. Regolare i seguenti parametri di scansione:
   1. Regolare la polarizzazione del fascio di eccitazione e ruotare la piastra a semionda per ottenere la polarizzazione corrispondente agli assi "X" e "Y" del piano del campione del microscopio.
      NOTA: Questo può essere fatto misurando i grafici polari di un mezzo fluorescente isotropo come la fluoresceina. Per tali materiali, l'intensità massima della fluorescenza è parallela alla polarizzazione del fascio di eccitazione; quindi, ruotando la piastra a semionda si regola la polarizzazione con gli assi X e Y sul piano di osservazione, indicati anche come assi X e Y sui grafici polari come in Figura 4C. I grafici polari completi possono essere misurati raccogliendo l'intensità 2PEF misurata su entrambi i fotodiodi per la rotazione di 180° della piastra a semionda (rotazione di 360° della polarizzazione della luce di eccitazione) e correlando l'intensità con l'angolo di polarizzazione della luce di eccitazione. Potrebbe essere fatto manualmente, misurando l'intensità dell'emissione per ogni angolo di placca a semionda separatamente e quindi assemblandolo in un grafico polare in un software di analisi dei dati o automaticamente, utilizzando un software dedicato o auto-scritto.
   2. Regola i parametri del piezostadio: velocità di scansione, passo e portata per coprire l'area dell'intera sferulite.
      NOTA: L'intervallo di scansione deve essere superiore al diametro della sferulite per inquadrare completamente l'intera sovrastruttura all'interno della scansione raster. La bassa velocità di scansione e il passo consentono agli utenti di ottenere immagini di alta qualità; tuttavia, ciò potrebbe causare la bruciatura del campione. Pertanto, è necessario un compromesso dipendente dalla dimensione della sferulite. Questi parametri non possono essere applicati universalmente. Parametri esemplari utilizzati nella Figura 5A: campo di scansione 45 x 45 μm, passo di scansione 1 μm e velocità di scansione 2 μm/s.
5. Aprire l'otturatore, accendere i fotodiodi e raccogliere i componenti di emissione 2P per ogni singolo passo dell'area di scansione selezionata, per il fascio di eccitazione polarizzato corrispondentemente agli assi X e quindi Y. Nella Figura 5A sono presentate scansioni raster esemplari di autofluorescenza eccitata a due fotoni (2PAF) di sferuliti di insulina.
   NOTA: La misurazione delle scansioni raster richiede la correlazione delle coordinate dello stadio piezoelettrico con le componenti di emissione raccolte e raccolte, che potrebbe essere eseguita manualmente, misurando l'intensità in ogni singolo punto dell'area selezionata e quindi assemblandola in una matrice 2D, o automaticamente, tramite un software auto-scritto. Le scansioni raster possono essere presentate come una somma dell'intensità e dell'intensità delle componenti di emissione o in modo distintivo per una specifica componente di emissione. Poiché sono altamente dipendenti dalla struttura, le distorsioni strutturali all'interno delle sferuliti sono facilmente visibili. Tuttavia, a causa del movimento del tavolino del microscopio, alcuni campioni potrebbero allontanarsi dal campo visivo. Pertanto, le immagini devono essere sottoposte a screening per rilevare la presenza di artefatti. È necessario controllare la posizione della sferulite prima e dopo la scansione.
6. Per eseguire l'analisi di polarizzazione completa dal punto specifico del campione, spegnere il fascio di eccitazione.
7. Successivamente, scegliere le coordinate specifiche del piezostadio corrispondenti alla posizione scelta sulla sferulite in cui sono richieste le informazioni sull'orientamento delle molecole con una risoluzione inferiore al μm.
8. Regolare il tavolino piezoelettrico per centrare il campo visivo in corrispondenza di quanto indicato (X, Y).
9. Accendere il fascio di eccitazione ed eseguire l'analisi di polarizzazione completa (360°) e l'emissione attivando la rotazione della piastra a semionda (rotazione di 180°). Presentare le componenti 2PF Ix e Iy sotto forma di grafico polare (come mostrato nella Figura 5B).
   NOTA: questo passaggio può essere ripetuto in punti diversi del campione per raccogliere una quantità sufficiente di dati.

4. Determinazione dell'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sferuliti di insulina bovina

NOTA: Tutti i calcoli numerici connessi all'analisi dei dati sono stati eseguiti utilizzando il linguaggio di programmazione Python e basandosi sulle funzioni disponibili nelle librerie NumPy e SciPy. Per tracciare i dati è necessaria la libreria Matplotlib. Tutti i calcoli si basano su formule presentate nelle informazioni di supporto in uno degli articoli di Obstarczyk et ^al.6.

1. Simulare l'intensità della fluorescenza a due fotoni eccitata per la distribuzione specificata di molecole con una direzione selezionata della polarizzazione della luce incidente (indicata con α)
   NOTA: Le formule presentate si basano sull'assunzione di momenti di dipolo paralleli di assorbimento ed emissione di un fluoroforo. Per una discussione di altri casi (ad esempio, diverse direzioni dei momenti di dipolo di assorbimento e di emissione, trasferimento di energia tra i fluorofori), si veda l'articolo di Le Floc'h et al⁸.
   1. Trova i parametri che tengono conto della variazione del campo elettrico mediante la miscelazione della polarizzazione e gli effetti di depolarizzazione causati dallo specchio dicroico montato in una configurazione:
      1. γ rappresenta il fattore di ampiezza tra la riflettività e la polarizzazione della luce proveniente da uno specchio dicroico.
      2. δ rappresenta lo sfasamento (ellitticità) tra la luce polarizzata e la luce polarizzata.
         NOTA: La corretta definizione di questi due parametri è fondamentale per il successo della caratterizzazione strutturale a causa della loro forte influenza sulla forma dei grafi polari misurati^11,18. Nel caso del sistema presentato, entrambi i parametri sono stati determinati durante le misure di ellissometria di uno specchio dicroico applicato in un sistema.
   2. Calcolare i vettori del campo elettrico incidente che si propagano negli assi X e Y di ogni angolo misurato durante la misurazione ps-TPFM utilizzando le equazioni (1-5).
      (1)
      (2)
      (3)
      (4)
      (5)
      NOTA Se l'intensità viene misurata su tutti i 360° con il passo 1°, calcolare i vettori del campo elettrico per tutti i 360°. Tutti gli angoli devono essere espressi in radianti. ρ è collegato alla frequenza ottica ω del campo elettrico simulato (ρ=ω·t) e utilizzato integrato da 0 a 2π durante i calcoli dei vettori di campo elettrico incidente che si propagano negli assi X e Y per ogni angolo α misurato durante la misura ps-TPFM.
   3. Definire le funzioni per i momenti di dipolo di transizione nelle direzioni dei tre assi di un sistema cartesiano secondo le equazioni (6-8):
      (6)
      (7)
      (8)
      NOTA: φ è l'angolo di orientamento dell'asse lungo della fibrilla amiloide nel fotogramma del campione XY. Gli angoli θ e φ sono gli angoli polari e azimutali utilizzati per definire l'orientamento del momento di dipolo di transizione di un fluoroforo.
   4. Utilizzare le funzioni definite al punto 4.1.3. definire le funzioni per J_x (Φ,θ,φ) e J_Y(Φ,θ,φ), che spiegano il contributo della focalizzazione a luce stretta con obiettivo ad alta apertura numerica alla rivelazione della polarizzazione della fluorescenza in direzione X e Y utilizzando le equazioni (9, 10).
      (9)
      (10)
      NOTA: I fattori K₁, K₂, K₃ sono correlati all'obiettivo del microscopio utilizzato durante la misurazione ps-TPFM. In questi esperimenti, è stato utilizzato un obiettivo apocromatico ad immersione in olio 100x/1.4 NA e i fattori K₁, K₂, K₃ erano rispettivamente 2.945, 0.069 e 1.016.
   5. Definire una funzione per f(Ω), che è una distribuzione angolare molecolare, dipendente dalla semiapertura di un cono fluoroforo Ψ, con spessore variabile ΔΨ; Utilizzare l'equazione (11). La rappresentazione grafica di tutti e tre gli angoli relativi alle fibrille amiloidi è presentata nella Figura 6.
      (11)
      NOTA: Fai attenzione mentre scrivi l'esponente: la potenza di 2 funziona sull'argomento della funzione, non sull'intera funzione!
   6. Definire tutti i fattori f_WWIJKL come mostrato nelle equazioni (12-21).
      (12)
      (13)
      (14)
      (15)
      (16)
      (17)
      (18)
      (19)
      (20)
      (21)
   7. Calcolare le intensità di fluorescenza eccitata a due fotoni e per ogni angolo misurato (analogamente a quanto indicato al punto 4.1.2) utilizzando le equazioni (22, 23).
      = (22)
      = (23)
   8. Verificare se la simulazione funziona correttamente utilizzando i seguenti valori di variabili (inseriti nella legenda della Figura 7) e confrontare i risultati ottenuti con la Figura 7A-C.
      NOTA: Tutti i gradi devono essere scritti in radianti.
2. Adattare le intensità simulate all'intensità dell'autofluorescenza eccitata da due fotoni di sferuliti di insulina bovina raccolte durante le misurazioni di ps-2PFM.
   NOTA: La risoluzione della struttura della sferulite basata su misure ps-2PFM richiede l'utilizzo delle equazioni scritte nel protocollo per simulare l'intensità teorica della fluorescenza eccitata a due fotoni e l'adattamento di tutti i parametri connessi all'ordinamento del fluoroforo molecolare. Richiede iterazioni multiple sui vari valori di Φ, un angolo che descrive la rotazione della fibrilla nel campione del microscopio XY, e ΔΨ, aberrazioni della distribuzione conica del dipolo di emissione Ψ dovute alle rotazioni molecolari nei filamenti per Ψ fisso fino a raggiungere il più alto coefficiente R² possibile tra l'intensità del segnale di fluorescenza eccitata a due fotoni normalizzata raccolta durante la misurazione e le intensità normalizzate simulate secondo Passaggio 4.1 del protocollo.
   1. Determinare il semiangolo Ψ .
      NOTA: Per le sferuliti di insulina bovina, dovrebbe essere uguale a Ψ = 29°⁶.
   2. Flusso di lavoro di adattamento:
      1. Scegliere il valore di Φ da 0° a 180° (in Figura 8A e 8B Φ = 16° e 127°, rispettivamente).
      2. Scegliere il valore di ΔΨ da 0° a 90° (nella Figura 8A,B, ΔΨ = 24° e 1°, rispettivamente).
      3. Calcolare (equazione 22) e (equazione 23) per l'intero intervallo misurato di angoli θ utilizzando i valori scelti di Φ e ΔΨ.
      4. Confrontare le intensità calcolate durante le simulazioni (entrambe normalizzate al valore massimo di
      5. Calcola ) con intensità normalizzate di
      6. Calcolare e (entrambi normalizzati al valore massimo di ) misurati durante la misurazione ps-2PFM.
         NOTA: Negli esperimenti presentati, i coefficienti di correlazione prodotto-momento di Pearson sono stati calcolati utilizzando la funzione "corrcoef" della libreria Python NumPy.
   3. Alla fine, scegliere i valori di Φ e ΔΨ che portano ai coefficienti di correlazione più alti e alla convergenza tra le intensità simulate e il segnale misurato in modo simile a quanto mostrato nella Figura 8.

Risultati

Il protocollo presentato fornisce una guida passo dopo passo attraverso la preparazione delle sovrastrutture amiloidi per il test con ps-2PFM, la costruzione del sistema microscopico e le misurazioni del campione appropriato. Tuttavia, prima della serie finale di misurazioni, è fondamentale allineare correttamente gli APD con un riferimento isotropo, che dovrebbe portare alla raccolta di un segnale simmetrico di forma e intensità simili su entrambi i rivelatori (Figura 4C). Anche le differen...

Discussione

La microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione è uno strumento prezioso per studiare l'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sovrastrutture amiloidi, richiedendo solo piccole modifiche alla configurazione multifotone standard. Poiché opera su fenomeni ottici non lineari, è possibile ottenere una ridotta fotoselezione angolare e una maggiore risoluzione assiale rispetto ai metodi di microscopia a fluorescenza eccitata con un fotone. Inoltre, porta a una minore dispersione della luce, a una minore ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Preparazione del campione
Vetrini coprioggetti, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant per istologia	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polipropilene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer  C	Eppendorf		Utilizzato per l'incubazione della sferulite
HLP 5UV Sistema di purificazione dell'acqua	Hydrolab		Fonte di acqua dionizzata utilizzata nella preparazione del campione
Acido cloridrico (≥ 37%, APHA ≤ 10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulina in polvere dal pancreas bovino (≥ 25 unità/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Metanolo (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	270474
con un concavo, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Microscopio ottico polarizzato	Olympus BX60	Olympus
Nastro sigillante per filettatura PTFE, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscopio ps-2PFM configurazione
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø Filtro passa-lungo da 25,0 mm	Thorlabs
FESH0700 - Ø Filtro passa-corto da 25,0 mm	Thorlabs
fotoni	ID Quantique
Filtro di emissione passa-corto multifotone 720 nm	Semrock
, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Immersione in olio 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Beamsplitter polarizzante	Thorlabs
S130C - Sensore di potenza a fotodiodo sottile, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
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