Microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione per una caratterizzazione strutturale dell'amiloide label-free

Maciej Lipok; Patryk Obstarczyk; Joanna Olesiak-Bańska

doi:10.3791/65670

Articolo metodologico

Microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione per una caratterizzazione strutturale dell'amiloide label-free

DOI:

10.3791/65670

⸱

8 settembre 2023

Maciej Lipok¹ , Patryk Obstarczyk¹ , Joanna Olesiak-Bańska¹

¹Institute of Advanced Materials, Wrocław University of Science and Technology

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive come la microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione potrebbe essere applicata per caratterizzare l'organizzazione locale all'interno di sovrastrutture-sferuliti amiloidi label-free. Descrive inoltre come preparare e misurare il campione, assemblare la configurazione richiesta e analizzare i dati per ottenere informazioni sull'organizzazione locale delle fibrille amiloidi.

Abstract

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Rispetto alla sua controparte a un fotone, l'eccitazione a due fotoni è vantaggiosa per gli esperimenti di bioimaging a causa della sua minore fototossicità, della penetrazione più profonda nei tessuti, del funzionamento efficiente in sistemi densamente impacchettati e della ridotta fotoselezione angolare dei fluorofori. Pertanto, l'introduzione dell'analisi di polarizzazione nella microscopia a fluorescenza a due fotoni (2PFM) fornisce una determinazione più precisa dell'organizzazione molecolare in un campione rispetto ai metodi di imaging standard basati su processi ottici lineari. In questo lavoro, ci concentriamo sulla 2PFM sensibile alla polarizzazione (ps-2PFM) e sulla sua applicazione nella determinazione dell'ordinamento molecolare all'interno di biostrutture complesse-sferuliti amiloidi. Le malattie neurodegenerative come l'Alzheimer o il Parkinson sono spesso diagnosticate attraverso il rilevamento di aggregati amiloidi-proteici formatisi a causa di un alterato processo di misfolding proteico. L'esplorazione della loro struttura porta a una migliore comprensione del loro percorso di creazione e, di conseguenza, allo sviluppo di metodi diagnostici più sensibili. Questo articolo presenta il ps-2PFM adattato per la determinazione dell'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sferuliti di insulina bovina e degli aggregati proteici amiloidogenici sferici. Inoltre, dimostriamo che la tecnica proposta può risolvere l'organizzazione tridimensionale delle fibrille all'interno della sferulite.

Introduzione

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Negli ultimi decenni, sebbene vi sia stato uno sviluppo significativo di numerose tecniche di microscopia a fluorescenza per il bioimaging delle proteine e dei loro aggregati¹, solo alcune sono state utilizzate per risolvere il loro ordinamento locale all'interno del campione ^2,3. La^microscopia a fluorescenza 4 è stata utilizzata per studiare l'eterogeneità strutturale intrinseca delle sovrastrutture-sferuliti amiloidi. Inoltre, la determinazione quantitativa dell'ordinamento locale all'interno di biostrutture complesse e densamente impacchettate come le sferulit....

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Protocollo

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1. Preparazione dei vetrini del microscopio con sferuliti completamente cresciute

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e le apparecchiature utilizzati in questo protocollo. Tutte le soluzioni sono state preparate con acqua deionizzata (18,2 MΩ·cm a 25 °C) ottenuta dal sistema di purificazione dell'acqua.

Incubare le sferuliti amiloidi in base al protocollo descritto da Krebs et al¹⁶. con alcune modifiche, come descritto di seguito.
1. Pesare 10 mg di insulina in polvere in una provetta da 1,5 ml.
2. Sciog....

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Risultati

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Il protocollo presentato fornisce una guida passo dopo passo attraverso la preparazione delle sovrastrutture amiloidi per il test con ps-2PFM, la costruzione del sistema microscopico e le misurazioni del campione appropriato. Tuttavia, prima della serie finale di misurazioni, è fondamentale allineare correttamente gli APD con un riferimento isotropo, che dovrebbe portare alla raccolta di un segnale simmetrico di forma e intensità simili su entrambi i rivelatori (Figura 4C). Anche le differen.......

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Discussione

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La microscopia a due fotoni sensibile alla polarizzazione è uno strumento prezioso per studiare l'ordinamento locale delle fibrille all'interno delle sovrastrutture amiloidi, richiedendo solo piccole modifiche alla configurazione multifotone standard. Poiché opera su fenomeni ottici non lineari, è possibile ottenere una ridotta fotoselezione angolare e una maggiore risoluzione assiale rispetto ai metodi di microscopia a fluorescenza eccitata con un fotone. Inoltre, porta a una minore dispersione della luce, a una minore .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto Sonata Bis 9 (2019/34/E/ST5/00276) finanziato dal National Science Centre in Polonia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Preparazione del campione
Vetrini coprioggetti, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant per istologia	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polipropilene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Utilizzato per l'incubazione della sferulite
HLP 5UV Sistema di purificazione dell'acqua	Hydrolab		Fonte di acqua dionizzata utilizzata nella preparazione del campione
Acido cloridrico (≥ 37%, APHA ≤ 10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulina in polvere dal pancreas bovino (≥ 25 unità/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Metanolo (grado HPLC)	Sigma-Aldrich	270474
con un concavo, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Microscopio ottico polarizzato	Olympus BX60	Olympus
Nastro sigillante per filettatura PTFE, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 gm²	Chemland	VIT131097
Microscopio ps-2PFM configurazione
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø Filtro passa-lungo da 25,0 mm	Thorlabs
FESH0700 - Ø Filtro passa-corto da 25,0 mm	Thorlabs
fotoni	ID Quantique
Filtro di emissione passa-corto multifotone 720 nm	Semrock
, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Immersione in olio 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Beamsplitter polarizzante	Thorlabs
S130C - Sensore di potenza a fotodiodo sottile, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Versione 18.0.1f2
Libreria			Versione 3.3.2
Libreria			Versione 1.19.2
Libreria			Versione 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Versione 4.1.5

Vetrini per microscopio utilizzato nella Figura 2 IDQ100 fotodiodi a valanga con conteggio di Piastra a semionda acromatica montata su Matplotlib NumPy SciPy

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S. Progress in Molecular Biology and Translational Science. Giraldo, J., Ciruela, F. 169, Academic Press. 1-41 (2020).
Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I pr....

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Analisi di polarizzazione Caratterizzazione dell amiloide Aggregati proteici Fibrille amiloidi Imaging da autofluorescenza Microscopia ottica non lineare Organizzazione molecolare Tecniche di bioimaging Malattie neurodegenerative

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