Caratterizzazione della morfologia vascolare della degenerazione maculare neovascolare legata all'età mediante angiografia con verde indocianina

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una condizione prevalente che porta a una grave perdita della vista negli individui anziani¹. Solo negli Stati Uniti, si prevede che il numero di pazienti affetti da AMD raddoppierà, raggiungendo quasi 22 milioni entro il 2050, rispetto agli attuali 11 milioni. A livello globale, si prevede che il numero stimato di casi di AMD raggiungerà l'incredibile cifra di 288 milioni entro il 2040².

La neovascolarizzazione coroideale (CNV), nota anche come AMD "umida" o neovascolare, può avere effetti devastanti sulla vista a causa della formazione di vasi sanguigni anomali sotto la retina centrale. Ciò porta a emorragie, essudazione della retina e significativa perdita della vista. L'introduzione di terapie anti-fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), che hanno come bersaglio il VEGF extracellulare, ha rivoluzionato il trattamento della CNV. Tuttavia, nonostante questi progressi, fino al 50% dei pazienti mostra risposte non ottimali a queste terapie, con attività di malattia in corso come accumulo di liquidi ed emorragie irrisolte o nuove 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Studi clinici hanno indicato che la resistenza anti-VEGF nei pazienti con CNV spesso corrisponde alla presenza di CNV arteriolare, caratterizzata da arteriole ramificate di grosso calibro, anse vascolari e connessioni anastomotiche⁹. Il trattamento anti-VEGF ripetuto può contribuire all'anomalia dei vasi, allo sviluppo della CNV arteriolare e, in ultima analisi, alla resistenza alle terapie anti-VEGF^14,15. Nei casi di CNV arteriolare, è probabile che la perdita persistente di liquido sia dovuta all'essudazione accentuata causata da giunzioni strette non adeguatamente formate nelle anse anastomotiche arterovenose, in particolare in condizioni di elevato flusso sanguigno⁹. Al contrario, gli individui che rispondono bene al trattamento anti-VEGF tendono a mostrare CNV capillare.

Nei nostri studi che utilizzano modelli animali, abbiamo dimostrato che la CNV indotta dal laser nei topi più anziani sviluppa CNV arteriolare e mostra resistenza al trattamento anti-VEGF^16,17. Al contrario, la CNV indotta dal laser nei topi più giovani porta allo sviluppo di CNV capillare e a un'elevata reattività al trattamento anti-VEGF. Pertanto, è fondamentale differenziare tra i tipi vascolari di CNV sia per le indagini meccanicistiche che per quelle terapeutiche.

In ambito clinico, la CNV è comunemente classificata in base ai modelli di perdita di fluorangiografia (FA) (ad esempio, Tipo 1, Tipo 2), che utilizzano il colorante fluoresceina per tracciare l'essudazione e identificare le aree di perdita patologica. Nella ricerca sull'AMD, la CNV viene studiata prevalentemente utilizzando la FA in modelli animali. Tuttavia, la FA non riesce a rivelare la morfologia vascolare della CNV. Inoltre, la FA cattura solo le immagini nello spettro della luce visibile e non può visualizzare la vascolarizzazione coroideale sotto l'epitelio pigmentato retinico (RPE). Al contrario, il verde indocianina (ICG), che mostra una forte affinità per le proteine plasmatiche, facilita la ritenzione intravascolare predominante e consente la visualizzazione della struttura vascolare e del flusso sanguigno⁹. Utilizzando la proprietà di fluorescenza nel vicino infrarosso dell'ICG, diventa possibile visualizzare il pigmento retinico e coroideale utilizzando l'angiografia ICG (ICGA). In questo contesto, viene presentato un protocollo che combina FA e ICGA per studiare la perdita e la morfologia vascolare della neovascolarizzazione coroideale (CNV) indotta dal laser in topi giovani e anziani, dove si osservano CNV capillari e arteriolari.

Gli esperimenti sugli animali condotti in questo studio hanno ricevuto l'approvazione da parte dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso il Baylor College of Medicine. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida delineate nella Dichiarazione dell'Associazione per la Ricerca sulla Visione e l'Oftalmologia (ARVO) per l'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e sulla Visione. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine C57BL/6J giovani (7-9 settimane) e vecchi (12-16 mesi). Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione del sistema di imaging

1. Posizionare un termoforo sulla piattaforma di imaging (vedere Tabella dei materiali) per garantire che la temperatura corporea del mouse venga mantenuta durante l'imaging. Attivare il termoforo e regolare la temperatura a 35 °C.
2. Rimuovere il coperchio antipolvere e accendere l'oftalmoscopio a scansione laser. Posizionare una lente a 55° sulla macchina.
3. Configura il software di imaging (vedi Tabella dei materiali) e inserisci le informazioni essenziali, tra cui genotipo, sesso, età, ecc. All'inizio della sessione di imaging, selezionare il canale IR (Infrarossi) per l'acquisizione delle immagini ICGA.

2. Preparazione degli animali prima dell'ICGA e della FA

1. Pesare il topo per determinare la quantità di anestesia (Ketamina/Xilazina 70-100/2,5-10 mg/kg, vedere la Tabella dei materiali) necessaria.
   NOTA: L'ottimizzazione del dosaggio è fondamentale poiché il profilo metabolico varia tra i diversi ceppi di topo. È essenziale determinare il dosaggio appropriato per evitare che il topo si svegli prima di completare l'imaging o il rischio di un sovradosaggio e la potenziale mortalità dell'animale.
2. Utilizzare una siringa sterile da 1 ml con un ago da 30-32 G per somministrare l'anestesia mediante iniezione intraperitoneale. Pizzica delicatamente una delle zampe del topo per verificare se il topo è adeguatamente anestetizzato. Se l'animale mostra una risposta o un movimento, è consigliabile attendere un po' di tempo prima di procedere alla fase successiva. Ciò consente all'animale di ambientarsi e garantisce condizioni ottimali per le procedure successive.
3. Somministrare gocce di soluzione oftalmica tropicamide all'1% per dilatare entrambi gli occhi del topo. Attendere almeno 30 s prima di utilizzare gocce di cloridrato di proparacaina allo 0,5% (vedi Tabella dei materiali) su entrambi gli occhi per ridurre il movimento oculare e il battito delle palpebre. Proseguire con gocce di gel per gli occhi lubrificanti.
   NOTA: Durante l'intera durata dell'anestesia, è importante affrontare il problema dell'estrema secchezza negli occhi del topo, che può portare all'opacità corneale. Questa opacità rende difficile l'imaging successivo a causa della visibilità ostacolata. Per evitare ciò, è fondamentale applicare continuamente gocce di gel per gli occhi lubrificanti per mantenere idratati gli occhi del topo.
4. Posiziona il mouse su un termoforo per l'acqua.
   NOTA: I topi possiedono un elevato rapporto superficie/volume, con conseguente aumento della perdita di calore nell'ambiente. Se combinato con il calo di temperatura indotto dall'anestesia, questo può rappresentare un rischio significativo per il topo, portando potenzialmente alla morte a causa dell'ipotermia. È fondamentale prendere le precauzioni necessarie per prevenire l'ipotermia e garantire il benessere del topo durante la procedura.
5. Preparare una miscela in volume 1:1 di 2 mg/mL di ICG e 20 mg/mL di colorante fluoresceina (vedere la tabella dei materiali). Somministrare 250 μL della miscela per iniezione intraperitoneale utilizzando una siringa da 1 mL e un ago da 32 G.
   1. Inserire l'ago nel quadrante in basso a sinistra dell'addome del topo, vicino alle zampe posteriori, con un angolo parallelo alla pelle del topo, per evitare di perforare gli organi.
   2. Estrarre con cautela lo stantuffo e verificare che non sia penetrato sangue nel tappo della siringa. Procedere all'iniezione del colorante lentamente e costantemente, mantenendo un ritmo costante.
      NOTA: Il colorante ICG deve essere filtrato con un filtro per siringa da 0.22 μm prima dell'uso.

3. ICGA e FA

1. Posizionare il mouse sul termoforo della piattaforma di imaging per avviare l'imaging.
2. Posiziona il corpo del mouse con un angolo di 45 gradi rispetto alla fotocamera e ruota leggermente la testa verso il basso. Ciò consente al nervo ottico di essere al centro della messa a fuoco della fotocamera.
3. Usando un batuffolo di cotone, strofinare delicatamente l'occhio per rimuovere prima lo strato di collirio o gel lubrificante sull'occhio da riprendere. Assicurarsi di applicare le gocce di gel lubrificante immediatamente dopo aver completato la procedura di imaging.
   NOTA: Si sconsiglia di lasciare l'occhio senza lubrificazione per più di 1 minuto durante l'anestesia.
4. Sposta la fotocamera verso l'occhio del mouse. Selezionare il canale FA dal modulo di acquisizione. La luminescenza emessa dal canale FA può essere utilizzata per posizionarsi al centro della cornea del topo per un posizionamento più rapido.
5. Posizionare la testa del mouse in modo che il nervo ottico sia centrato sullo schermo, evitando la necessità di inclinare l'oftalmoscopio a scansione laser ad angolo. Apportare piccole modifiche alla posizione della testa del mouse per ottenere l'allineamento desiderato.
6. Sul modulo di acquisizione, selezionare il canale ICGA. Assicurarsi che l'intensità del laser sia impostata al 100% e selezionare l'opzione 55° in modo che corrisponda all'obiettivo appropriato. Ciò garantisce impostazioni ottimali per l'oftalmoscopio a scansione laser.
   NOTA: Per evitare la sovrasaturazione, potrebbe essere necessario utilizzare un'intensità laser inferiore, in genere intorno al 25%-50%, quando si esegue l'imaging della fase iniziale. La regolazione dell'intensità del laser in questo intervallo può aiutare a catturare immagini chiare e accurate senza causare sovrasaturazione.
7. Quando l'occhio occupa l'intero schermo sul software di imaging, regolare le impostazioni di sensibilità e messa a fuoco per ottenere l'immagine più nitida della membrana CNV.
   1. Ruotare il pulsante nero rotondo sul modulo di acquisizione per regolare la sensibilità dell'immagine.
   2. Ruotare la manopola sull'oftalmoscopio per regolare la messa a fuoco. La messa a fuoco ottimale per la visualizzazione della vascolarizzazione retinica utilizzando la FA è tipicamente compresa tra 35 e 45 D (diottrie). D'altra parte, la messa a fuoco ideale per visualizzare la coroide utilizzando l'ICGA è generalmente compresa tra 10-15 D.
      NOTA: A causa delle diverse dimensioni della membrana CNV, potrebbe essere necessario regolare la messa a fuoco in 10-30 D per ottenere un imaging ottimale della morfologia vascolare.
8. Una volta regolata la messa a fuoco e la sensibilità per ottenere la migliore immagine possibile, premere il pulsante nero rotondo sul modulo di acquisizione per normalizzare l'immagine. Una volta completata la normalizzazione (tutti i fotogrammi acquisiti), fare clic sul pulsante di acquisizione sul pannello touchscreen per salvare l'immagine. Potrebbe essere necessario spostare la fotocamera per riprendere CNV da diverse angolazioni. Il topo può anche essere orientato in diverse posizioni per fornire la migliore immagine della lesione CNV.
   NOTA: Potrebbe essere necessario regolare nuovamente la messa a fuoco o il posizionamento dell'oftalmoscopio a scansione laser quando si osserva la vascolarizzazione più lontana dal nervo ottico.
9. Tornare al canale FA utilizzando il modulo di acquisizione. Completare gli stessi passaggi elencati nei passaggi 3.6-3.7 per regolare la sensibilità e la messa a fuoco di ciascuna immagine per catturare la perdita della lesione CNV.
   NOTA: Assicurarsi che sia selezionata la sensibilità corretta per evitare la sovrasaturazione della perdita CNV e aumentare artificialmente l'area di perdita.
10. Immagine della "fase iniziale" di ICGA e FA 3-4 minuti dopo l'iniezione.
    NOTA: La "fase iniziale" è il momento in cui la vascolarizzazione coroideale può essere vista chiaramente e distintamente. Durante la fase intermedia, che in genere si verifica tra i 4 e gli 8 minuti, i vasi retinici e coroideali sono molto più sbiaditi e diffusi. Con l'inizio della fase tardiva (>8-10 min), sia i vasi coroideali che quelli retinici diventano indistinguibili. Le lesioni iperfluorescenti della CNV, tuttavia, mostrano il massimo contrasto rispetto allo sfondo diminuito. Questi tempi menzionati sono variabili e dipendono dalla concentrazione e dalla quantità di colorante ICG iniettato. Una maggiore quantità di colorante ICG tende ad aumentare la sequenza temporale di ogni fase e a fornire vasi più distinti. Una fase dovrebbe essere definita in base alle caratteristiche chiave sopra elencate piuttosto che a un tempo assoluto.
11. Una volta acquisite tutte le immagini, applicare un lubrificante o un unguento in gel sull'occhio del topo e monitorare attentamente il mouse sul termoforo per il recupero. Di solito ci vogliono 1,5 ore prima che il mouse si riprenda completamente.
12. Rimetti i topi nelle loro gabbie e nell'area di attesa designata una volta che si sono completamente ripresi dall'anestesia e sono svegli.
13. Prima di spegnere il sistema di imaging e il laser, esportare le immagini come file TIFF o JPEG per l'analisi successiva.

4. RPE/coroide a montaggio piatto e colorazione

1. Fissare gli occhi in paraformaldeide al 4% durante la notte. Lavare gli occhi con PBS tre volte. Rimuovere il cristallino e la cornea.
2. Incubare gli occhi in soluzione bloccante (10% albumina sierica bovina, 0,6% Triton X-100 in PBS) per 1 ora a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio PBS tre volte.
3. Incubare gli occhi con il coniugato isolectina GS-IB4 Alexa-flour 568 e l'anticorpo anti-actina α-muscolatura liscia (vedere la tabella dei materiali) per una notte nella soluzione bloccante.
4. Lavare tre volte con PBS. Incubare i campioni con un anticorpo secondario anti-coniglio di capra Alexa Fluor 488 (vedere Tabella dei materiali) per 2 ore a temperatura ambiente.
5. Eseguire 4 tagli radiali dallo spigolo all'equatore. Rimuovere con cautela la retina¹⁷.
   NOTA: È necessario prestare attenzione per garantire che la membrana neovascolare non si stacchi accidentalmente.
6. Montare la coroide piatta su un vetrino. Visualizzare il CNV utilizzando la microscopia confocale.

Seguendo il protocollo, ICGA e FA sono stati eseguiti su CNV indotta da laser in topi C57BL/6J giovani (7-9 settimane) e vecchi (12-16 mesi). La FA fornisce informazioni sulla localizzazione e la fuoriuscita delle lesioni CNV (Figura 1, pannelli di sinistra), mentre l'ICGA rivela la morfologia vascolare delle lesioni CNV (Figura 1, pannelli di destra). Nei topi giovani, la CNV capillare domina le lesioni della CNV. Al contrario, i topi anziani mostrano CNV arteriolare caratterizzata da vasi di grande calibro, anse vascolari e connessioni anastomotiche. Sia i topi giovani che quelli anziani mostrano una chiara visibilità della vascolarizzazione retinica nella FA (Figura 1, pannelli a sinistra). Nelle immagini ICGA di topi giovani, la vascolarizzazione retinica non è visibile e i vasi coroideali appaiono sbiaditi, indicando la fase intermedia dell'ICGA con l'attenzione alla vascolarizzazione coroideale. Nelle immagini ICGA di topi anziani, si può osservare una vascolarizzazione retinica parziale mentre i vasi coroideali appaiono sbiaditi, suggerendo la fase intermedia con il focus tra la retina e la coroide a causa delle maggiori dimensioni della CNV arteriolare nei topi anziani. La CNV arteriolare nei topi anziani mostra una dimensione maggiore della CNV (Figura 2) e una perdita significativamente maggiore rispetto alla CNV capillare nei topi giovani. L'immunocolorazione con un anticorpo anti-actina della muscolatura liscia marca ampiamente la vascolarizzazione della CNV nei topi anziani, confermando la morfologia arteriolare (Figura 3). Al contrario, si osserva una colorazione minima con actina α-liscia muscolare nella vascolarizzazione del sito della lesione di topi giovani, coerente con la morfologia capillare.

Figura 1: Confronto delle immagini FA e ICGA che raffigurano CNV indotta da laser in topi giovani e anziani. Le immagini FA mostrano la perdita di lesioni CNV, mentre l'ICGA fornisce la visualizzazione della morfologia vascolare. Barre graduate: 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Quantificazione delle dimensioni della lesione CNV in topi giovani e anziani sulla base di immagini ICGA. Sono state misurate le aree CNV, con un totale di 26 e 14 punti laser analizzati rispettivamente in topi giovani e anziani. Le barre di errore rappresentano la media ± SD. L'analisi statistica è stata condotta utilizzando un test t spaiato. P < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative delle lesioni CNV in topi giovani e anziani, co-marcate con l'isolectina Alexa 568 e l'anticorpo anti-actina anti-muscolatura liscia α su RPE/coroidi flat-mount. Il colore rosso rappresenta l'isolectina di Alexa 568, mentre il colore verde rappresenta l'actina α-liscia (SMA). Barre graduate: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.