Modellazione della sclerosi multipla nei due sessi: encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da MOG_35-55

La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). Mostra la presenza di infiltrazione perivascolare di cellule infiammatorie, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi¹. La sua eziologia rimane sconosciuta e i suoi aspetti clinici, radiografici e patologici suggeriscono una notevole eterogeneità nella malattia².

A causa della sua eziologia e complessità sconosciute, al momento, nessun modello animale ricapitola tutte le caratteristiche cliniche e radiologiche mostrate nella SM^{umana 3,4}. Tuttavia, vari modelli animali sono impiegati per studiare diversi aspetti della MS ^3,4. In questi modelli, l'inizio della malattia è in genere estremamente artificiale e il periodo di insorgenza dei segni clinici è diverso tra gli esseri umani e i topi. Ad esempio, nell'uomo, i processi fisiopatologici alla base della malattia non vengono rilevati per anni prima dell'insorgenza delle manifestazioni cliniche. Al contrario, gli sperimentatori possono rilevare i sintomi nei modelli animali entro settimane o addirittura giorni dopo l'induzione della SM⁴.

Tre modelli animali di base producono le caratteristiche della demielinizzazione che sono caratteristiche della SM: quelli indotti da virus (ad esempio, il virus dell'encefalomielite murina di Theiler), quelli indotti da agenti tossici (ad esempio, cuprizone, lisolecitina) e le diverse varianti dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE)⁵. Ogni modello aiuta a studiare alcuni aspetti specifici della malattia, ma nessuno replica tutte le caratteristiche della SM⁶. Pertanto, è fondamentale scegliere il modello corretto considerando le specifiche esigenze sperimentali e le questioni scientifiche da affrontare.

Grazie alle procedure di immunizzazione contro gli antigeni derivati dalla mielina, l'EAE è indotta dall'innesco di una risposta autoimmune ai componenti del SNC nei topi predisposti. L'interazione tra un'ampia gamma di meccanismi immunopatologici e neuropatologici provoca lo sviluppo dei principali tratti patologici della SM (cioè infiammazione, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi) nei topi immunizzati ^7,8. I topi iniziano a mostrare sintomi clinici intorno alla seconda settimana dopo l'immunizzazione e generalmente mostrano una paralisi ascendente dalla coda all'arto e all'arto anteriore. Il punteggio clinico (cioè la quantificazione dell'accumulo di deficit correlati alla malattia) è generalmente valutato utilizzando una scala a 5 punti⁷.

L'immunizzazione attiva con proteine o peptidi o il trasferimento passivo di cellule T encefalitogene possono essere utilizzate per indurre EAE in topi con diversi background genetici (ad esempio, SJL/J, C57BL/6 e topi non obesi-diabetici (NOD)). La proteina proteolipidica della mielina (PLP), la proteina basica della mielina (MBP) e la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) sono esempi di proteine del sistema nervoso centrale da cui vengono solitamente prodotti gli immunogeni. In particolare, i topi SJL/J immunizzati con l'epitopo immunodominante di PLP (PLP_139−151) sviluppano un decorso di malattia recidivante-remittente (RR), mentre i topi C57BL/6J immunizzati con il peptide immunodominante MOG_35-55 mostrano EAE di natura cronica¹. Nonostante alcune limitazioni, come la scarsità di informazioni sulla progressione della SM, il ruolo delle cellule B nella malattia, i meccanismi inside-out o le difficoltà nello studio della rimielinizzazione, i modelli EAE hanno contribuito enormemente alla comprensione dei processi autoimmuni e neuroinfiammatori, aumentando le conoscenze nel campo della SM e consentendo così lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per questa malattia^{4, 6}. Introduzione

Nel presente lavoro, ci siamo concentrati su una particolare forma di EAE attivo, la forma^indotta dal peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina 35-55 (MOG_35-55) 9,10,11,12. L'EAE indotta da MOG_35-55 modella una forma cronica di SM. Dopo l'immunizzazione, i topi vanno incontro a una fase asintomatica entro la prima settimana dopo l'immunizzazione, quindi la malattia insorge tipicamente durante la seconda settimana dopo l'immunizzazione, mentre tra la terza e la quarta settimana dopo l'immunizzazione, la malattia diventa cronica, senza possibilità di pieno recupero dai deficit accumulati ^7,8,13. È interessante notare che nella maggior parte degli studi presenti^{in letteratura non} si osservano differenze tra maschi e femmine in termini di incidenza, insorgenza della malattia, decorso o progressione, anche se un numero inferiore di studi confronta la malattia nei maschi e nelle femmine.

Al contrario, negli esseri umani, questi parametri sono noti per essere fortemente dimorfici sessualmente². La sclerosi multipla colpisce più le donne che gli uomini; Tuttavia, gli uomini generalmente sviluppano una forma più aggressiva della malattia². Queste evidenze hanno suggerito un ruolo essenziale, oltre che complesso, degli ormoni gonadici¹⁵; Tuttavia, il ruolo e il meccanismo d'azione degli ormoni sessuali nella patologia rimangono poco chiari. Inoltre, i dati provenienti da modelli animali supportano l'idea che sia gli estrogeni che gli androgeni esercitino effetti positivi su diversi tratti della patologia in modo sesso-specifico ^16,17.

Alcuni studi suggeriscono anche effetti neuroprotettivi, promielinizzanti e antinfiammatori del progesterone¹⁸ e, sebbene le prove nei pazienti con SM siano scarse¹⁸, gli steroidi neuroattivi (cioè steroidi sintetizzati de novo dal sistema nervoso, come il pregnenolone, il tetraidroprogesterone e il diidroprogesterone) potrebbero anche influenzare il decorso patologico¹⁹. Collettivamente, questi dati supportano l'idea che gli ormoni sessuali prodotti sia perifericamente che all'interno del sistema nervoso centrale abbiano un ruolo importante e specifico per sesso nell'insorgenza e nella progressione della malattia. Pertanto, nel presente lavoro, sollecitiamo la raccolta di dati separati da animali maschi e femmine.

Dal punto di vista istopatologico, la sostanza bianca del midollo spinale funge da sito principale di lesione del SNC in questo modello, che è caratterizzato da regioni multifocali e confluenti di infiltrazione infiammatoria mononucleare e demielinizzazione⁸. Pertanto, nel descrivere questo protocollo per l'induzione di EAE indotta da MOG_35-55 in topi C57BL/6J, prenderemo in considerazione l'esito della malattia nei due sessi e forniremo alcune informazioni istopatologiche riguardanti il midollo spinale.

La cura e la movimentazione degli animali nel presente lavoro è stata eseguita secondo la Direttiva del Consiglio dell'Unione Europea del 22^settembre 2010 (2010/63/UE); tutte le procedure riportate nel presente studio sono state approvate dal Ministero della Salute (407/2018-PR) e dal Comitato Etico dell'Università di Torino (Progetto n° 360384). Suggeriamo di conformarsi al disegno sperimentale alle linee guida ARRIVE originariamente pubblicate da Kilkenny et al. nel 2010²⁰. Prima di iniziare, assicurarsi che siano disponibili i materiali necessari (vedi Tabella dei materiali). Sterilizzare in autoclave tutta la vetreria e gli utensili utilizzati per la preparazione dell'emulsione MOG_35-55 . Una sintesi delle procedure sperimentali è rappresentata nella Figura 1.

1. Preparazione dell'emulsione MOG_35-55

NOTA: Per preparare l'emulsione sono necessari MOG_35-55, adiuvante di Freud incompleto (IFA), Mycobacterium Tuberculosis ceppo H37Ra (MT) e soluzione fisiologica (vedi Tabella dei materiali).

ATTENZIONE: La MT uccisa dal calore può stimolare la risposta immunitaria innata. Evitare l'inalazione, l'ingestione e il contatto con la pelle e gli occhi utilizzando dispositivi di protezione individuale adeguati e pesando MT in una bilancia di precisione coperta sotto il cofano.

Tabella 1: Composizione delle soluzioni utilizzate per la procedura di immunizzazione.

1. Preparare la soluzione in un becher di vetro, aggiungendo prima la componente liquida e infine il MT.
   NOTA: Il volume totale di emulsione necessario per ciascun topo da immunizzare è di 300 μL, suddiviso come indicato nella Tabella 1. L'emulsione è molto viscosa e densa, quindi durante la procedura di preparazione e iniezione, potrebbe esserci qualche perdita, soprattutto quando si prepara la soluzione per alcuni topi. Suggeriamo di calcolare il volume finale di emulsione necessario sovrastimando il numero di topi da immunizzare di almeno 1,5-2 volte.
2. Immergere il becher nel ghiaccio e utilizzare la siringa di vetro con un ago da 18 G per iniziare ad emulsionare la soluzione.
   NOTA: L'emulsione può essere preparata anche utilizzando altre strategie, ad esempio collegando le due siringhe di vetro air-free con un rubinetto a tre vie e mescolando la soluzione spingendo avanti e indietro gli stantuffi^21,22.
3. Emulsionare la soluzione per almeno 15 min; Generalmente, 30 minuti di emulsione sono sufficienti. Per verificare la qualità dell'emulsione, aggiungere una goccia di emulsione in un contenitore trasparente riempito d'acqua: se la goccia mantiene la sua struttura e rimane intatta, l'emulsione è pronta.
4. Posizionare l'emulsione direttamente all'interno delle siringhe da 1 mL che verranno utilizzate per l'immunizzazione e conservarle a +4 °C fino al momento dell'utilizzo per preservare lo spessore dell'emulsione ed evitare alterazioni o contaminazioni.

2. Selezione e immunizzazione degli animali

1. Selezione degli animali
   1. Selezionare topi adulti C57BL/6J di entrambi i sessi a 8-10 settimane di età con un peso corporeo ottimale di ~20 g. Assicurati di selezionare topi abbinati per età e sesso per diversi gruppi sperimentali perché la suscettibilità alla malattia può variare con l'età e il sesso.
      NOTA: I topi dovrebbero avere un peso corporeo comparabile il giorno dell'immunizzazione perché la presente procedura è ottimizzata per un certo intervallo di peso corporeo (17-25 g).
   2. Alloggiare animali dello stesso sesso in gruppi (n = 4-5/gabbia) per evitare l'isolamento sociale in condizioni standard in gabbie per topi in polipropilene da 45 cm x 25 cm x 15 cm a 22 ± 2 °C, con ciclo luce/buio inferiore alle 12:12 (luci accese alle 08:00). Fornire cibo e acqua ad libitum.
      NOTA: Infine, per limitare ulteriormente la potenziale variabilità del decorso della malattia negli animali immunizzati, suggeriamo anche di formare gruppi sperimentali sufficientemente numerosi. Ci sono anche studi ^8,23 che descrivono la tempistica dell'immunizzazione come una condizione che determina la variazione dell'esito dell'EAE. Pertanto, suggeriamo di eseguire l'immunizzazione approssimativamente alla stessa ora in tutti gli animali, preferibilmente durante le ore di luce del ciclo giorno/buio²³. Per limitare lo stress, è preferibile manipolare gli animali prima del giorno dell'immunizzazione e contrassegnarli per identificarli facilmente per la valutazione quotidiana, ad esempio ritagliando le orecchie o etichettandole.
2. La procedura di immunizzazione
   NOTA: Assicurarsi che la procedura sia eseguita da uno sperimentatore esperto per ridurre al minimo lo stress per gli animali e ottimizzare l'immunizzazione. Prima di iniziare l'immunizzazione, selezionare il metodo di anestesia in conformità con le linee guida del comitato etico e di cura degli animali istituzionali. Il nostro laboratorio utilizza l'anestesia breve con isoflurano.
   1. Anestetizzare il topo: isoflurano al 4% per l'induzione dell'anestesia e isoflurano all'1,5-2% per il mantenimento dell'anestesia. Attendere che l'anestesia sia efficace e utilizzare un pizzico di dita del piede posteriore e anteriore per valutare il livello di anestesia. Per prevenire la secchezza degli occhi mentre il topo è sotto anestesia, utilizzare un unguento per gli occhi approvato dal veterinario.
   2. Iniezione endovenosa PT nella vena caudale laterale: tappare delicatamente la coda del topo con una soluzione di etanolo, che funge da vasodilatatore, per visualizzare le vene. Mettere a fuoco una delle due nervature laterali della coda e, utilizzando una siringa da 0,5 mL dotata di un ago da 30 G, iniettare 500 ng di PT (cioè 100 μL di PT diluiti in soluzione fisiologica alla concentrazione di 5 μg/mL).
   3. Iniezione sottocutanea dell'emulsione MOG_35-55 : utilizzando la siringa da 1 mL con ago da 26 G, eseguire tre iniezioni sottocutanee dell'emulsione precedentemente preparata: due sotto la parte rostrale dei fianchi e una alla base della coda. Il volume di emulsione iniettato in ciascun sito è di 100 μL, per un volume totale di 300 μL di emulsione iniettata in ciascun topo.
      NOTA: Il giorno dell'immunizzazione viene registrato come giorno 0 dopo l'immunizzazione (dpi); 48 ore dopo (cioè a 2 dpi), è necessario eseguire un'altra iniezione endovenosa di PT uguale a quella precedentemente eseguita. È possibile eseguire l'iniezione senza anestesia, utilizzando un sistema di ritenuta per topi. La procedura qui descritta ha lo scopo di indurre e mantenere l'anestesia dei topi durante la procedura di immunizzazione per evitare possibili disagi e movimenti degli animali o rischi sia per i topi che per gli sperimentatori. Pertanto, non ci sono procedure chirurgiche. Tuttavia, per ottimizzare i processi sperimentali, è importante mantenere condizioni di sterilità appropriate durante queste fasi e monitorare le condizioni del topo dopo queste procedure.
   4. Per verificare che il topo si sia ripreso dalle iniezioni, metterlo in una gabbia pulita dopo le procedure e attendere che abbia ripreso conoscenza a sufficienza per mantenere il decubito sternale. Dopo che il topo si è completamente ripreso, rimettilo nella gabbia di casa con altri animali.

3. Follow-up dell'EAE

1. Peso corporeo e assunzione di cibo
   1. Monitorare quotidianamente il peso corporeo (BW) degli animali, utilizzando una bilancia elettronica di precisione, perché la diminuzione del peso corporeo è un indicatore della progressione della malattia.
      NOTA: Questa diminuzione non deve superare una certa percentuale, secondo le linee guida del comitato istituzionale ed etico per la cura degli animali. Di solito, se un animale perde più del 20% del peso corporeo iniziale (cioè il peso registrato a 0 dpi), dovrebbe essere sacrificato come applicazione del punto finale umano. I metodi di eutanasia prevedono l'anestesia profonda irreversibile per inalazione (ad esempio, isoflurano al 5%) seguita da decapitazione.
   2. Monitorare l'assunzione di cibo (FI) - il cibo consumato da un animale in un giorno (g∙^giorno-1∙^animale-1), pesando la quantità di cibo nell'apposito contenitore almeno una volta alla settimana, e dividendo la quantità di cibo consumato per i giorni trascorsi tra due misurazioni sequenziali e il numero di animali presenti nella gabbia.
      NOTA: Questa misurazione consente di stimare l'assunzione media di cibo. A causa della comparsa e dell'accumulo di segni clinici di malattia, che comportano la paralisi degli arti, si consiglia di posizionare del cibo annaffiato sul pavimento della gabbia quando gli animali non sono in grado di stare saldamente in piedi sugli arti posteriori e raggiungere il contenitore del cibo o la bottiglia d'acqua. Per valutare l'assunzione di cibo durante il periodo di follow-up nel modo più preciso possibile, abbiamo anche misurato il peso secco di questo alimento prima di bagnarlo per i topi.
2. Valutazione della ciclicità estrale durante l'EAE
   1. Controllare il ciclo estrale per almeno due cicli, valutando gli strisci citologici vaginali come descritto da McLean et ^al.24. Classificare la fase del ciclo estrale in base alla presenza di tre tipi di cellule primarie - cellule epiteliali nucleate, cellule epiteliali squamose cornificate e leucociti - nei campioni di striscio vaginale, come segue:
      1. Classificare come proestro in base alla presenza quasi esclusiva di gruppi di cellule epiteliali nucleate rotonde e ben formate.
      2. Classificare come estro in base alla presenza predominante di ammassi densamente impacchettati di cellule epiteliali squamose cornificate.
      3. Classificare come metestro in base alla presenza predominante di piccoli leucociti colorati di scuro e alla minore presenza di cellule epiteliali squamose cornificate.
      4. Classificazione come diestro in base alla presenza altamente predominante di piccoli leucociti colorati di scuro e rare cellule epiteliali squamose cornificate insieme alla possibile comparsa di cellule epiteliali nucleate.
         NOTA: Quando si valuta la malattia in entrambi i sessi, è importante verificare la variabilità nelle femmine dovuta al ciclo estrale. Suggeriamo di concentrarsi sulla valutazione del ciclo estrale, soprattutto tra la prima e la seconda settimana dopo l'immunizzazione (cioè durante la fase acuta dell'EAE). È stato precedentemente dimostrato che la procedura di immunizzazione provoca le alterazioni più pronunciate del ciclo estrale all'interno di questa fase²⁵. Inoltre, è importante considerare che l'esecuzione dello striscio quando l'animale raggiunge un punteggio clinico elevato (soprattutto >3) è difficoltosa a causa della paresi posteriore e della mancanza di tono negli arti posteriori.
3. Punteggio clinico
   1. Chiedere a uno sperimentatore in cieco di valutare quotidianamente il punteggio clinico degli animali. Assegnare a ciascun animale un punteggio da 0 a 5 (vedere Tabella 2) per valutare il decorso della malattia²⁶ come descritto da Racke⁷.
      NOTA: Analogamente alla diminuzione del peso corporeo, è necessario anche un endpoint umano per l'aumento dei punteggi clinici, secondo le linee guida del comitato istituzionale ed etico per la cura degli animali. Generalmente, se un animale non è più in grado di nutrirsi autonomamente (questo di solito accade quando un animale raggiunge almeno il punteggio di 4, secondo la scala che utilizziamo), dovrebbe essere sacrificato come applicazione del punto finale umano.
4. Valutazione delle prestazioni del motore mediante test rotarod
   NOTA: La valutazione della progressione dell'EAE viene solitamente eseguita assegnando il punteggio clinico giornalmente, che viene eseguito da uno sperimentatore in cieco completamente addestrato. Tuttavia, potrebbe essere utile affiancarla a una valutazione più quantitativa e oggettiva della progressione della malattia. In un precedente studio²⁶, il test rotarod è stato utilizzato per misurare le prestazioni motorie degli animali immunizzati. Come descritto da van den Berg et ^al.27, per avere una valutazione clinica più quantitativa e precisa del decorso della malattia, la valutazione delle prestazioni motorie mediante il test rotarod può supportare la valutazione del punteggio clinico. Per una descrizione dettagliata, vedi van den Berg et ^al.27.
   1. Lascia che i topi si sottopongano a sessioni di rotarod ogni giorno, a partire da 1 dpi fino al sacrificio (cioè 28 dpi). Ogni sessione consiste in una singola sessione di 300 s durante la quale la velocità dell'asta deve essere aumentata linearmente da 4 a 40 giri/min.
   2. Registra il punteggio dell'animale. Quando il mouse non è in grado di mantenere l'equilibrio e cade dal dispositivo, cade a terra e attiva un sensore e viene registrato il tempo o i tempi. Pertanto, le prestazioni vengono valutate come latenza per cadere (s).

Tabella 2: Sistema di punteggio clinico utilizzato per valutare la progressione dell'EAE.

4. Valutazione dei segni istopatologici indotti da EAE a livello del midollo spinale

NOTA: Di seguito, riportiamo brevemente la procedura per sacrificare gli animali e prelevare il midollo spinale per eseguire l'analisi istopatologica; Per una descrizione dettagliata, vedere questi riferimenti 10,26,28,29.

1. Fissazione e prelievo di tessuti
   NOTA: Per una descrizione dettagliata, vedere questi riferimenti^10,26.
   1. Sacrificare gli animali a 28 dpi durante la fase cronica della malattia.
      1. Anestetizzare i topi mediante anestesia profonda irreversibile (iniezione intraperitoneale di Zolazepam e Tiletamina 80 mg/kg / Xilazina 10 mg/kg).
      2. Perfondere per via transcardiaca i topi con una soluzione salina seguita da una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4%.
         NOTA: Prestare attenzione durante l'utilizzo del PFA: poiché è tossico, evitare l'inalazione, l'ingestione e il contatto con la pelle e gli occhi utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale. Pesare la polvere, preparare la soluzione ed eseguire la perfusione sotto il cofano.
   2. Rimuovere il midollo spinale dalla colonna vertebrale³⁰.
   3. Conservare il midollo spinale in una soluzione di PFA al 4% per 24 ore.
   4. Eseguire diversi lavaggi in tampone fosfato salino (PBS) da 0,01 M.
   5. Incorporare il midollo spinale in blocchi di paraffina³⁰.
2. Procedure istologiche
   NOTA: Per una descrizione dettagliata, vedere Montarolo et ^al.10.
   1. Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni trasversali del midollo spinale spesse 10 μm e raccoglierle su vetrini rivestiti di gelatina. Orientare il piano di sezionamento in modo che corrisponda ai disegni corrispondenti alle sezioni trasversali dell'atlante del midollo spinale del topo³¹.
   2. Eseguire la deparaffinizzazione delle sezioni³².
   3. Colorare la sezione con ematossilina ed eosina³².
   4. Disidratare le sezioni³².
   5. Coprire le sezioni con un mezzo di montaggio e lasciarle asciugare a temperatura ambiente sotto una cappa chimica.
      NOTA: La colorazione ematossilina-eosina consente di rilevare la presenza degli infiltrati infiammatori perivascolari (PvII)²⁶, che viene valutata come segno della malattia²⁸.
3. Analisi quantitativa delle sezioni del midollo spinale
   1. Acquisire le immagini delle sezioni colorate con un microscopio ottico collegato a una fotocamera digitale con obiettivo 20x²⁹.
   2. Analizzare l'immagine acquisita per ottenere il numero di PvII, espresso come numero di infiltrati per mm².
      NOTA: Per l'analisi delle immagini acquisite è utile avvalersi di software di analisi delle immagini. I risultati neuropatologici presentati in questo lavoro sono quantificati in 10 sezioni trasversali complete del midollo spinale per topo (n = 8/gruppo) rappresentative dei livelli dell'intero midollo spinale.

Follow-up dell'EAE dopo l'immunizzazione
Questo è stato valutato come descritto di seguito.

Peso corporeo e assunzione di cibo
L'analisi bidirezionale della varianza (ANOVA) (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra una diminuzione del peso corporeo degli animali EAE di entrambi i sessi, soprattutto entro la seconda settimana dopo l'induzione (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Figura 2A). Tuttavia, il dimorfismo sessuale nella BW viene sempre mantenuto (Figura 2A). In termini di percentuale di BW (F(1,57) = 23,935, p < 0,001; Figura 2B), sia i maschi che le femmine mostrano un'enorme perdita tra i 12 dpi e i 17 dpi (p < 0,001) rispetto al BW iniziale, ma non superano mai una perdita totale del 20% (Figura 2B). Pertanto, sebbene la perdita di BW inizi prima dell'insorgenza della malattia, raggiunge il suo massimo durante la fase acuta dell'EAE (Figura 2A,B). Non ci sono differenze tra i sessi in termini di perdita di BW. Tuttavia, le femmine tendono a perdere più peso prima e a recuperare meno durante la fase cronica (terza-quarta settimana dopo l'induzione) (Figura 2B).

Inoltre, anche l'ANOVA bidirezionale (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra una significativa diminuzione di FI (F(9, 39) = 6.682, p < 0.001; Figura 2C) in entrambi i sessi, in particolare durante la seconda settimana post-immunizzazione, a causa dell'aumento della gravità dell'EAE, che ha reso più difficile per l'animale accedere al cibo posto nel contenitore superiore della gabbia. Come abbiamo suggerito, il cibo è stato successivamente messo sul pavimento della gabbia per ridurre ulteriormente lo stress degli animali. Ciò ha permesso al FI di tornare ai livelli iniziali (Figura 2C) e al BW di riprendersi parzialmente (Figura 2A,B).

Valutazione del ciclo estrale nelle femmine
Il confronto tra il tempo trascorso nelle diverse fasi dell'estro è stato eseguito utilizzando il test t di Student. L'analisi mostra differenze nel tempo trascorso nelle fasi estrali (cioè proestro ed estro) rispetto a quello trascorso nella fase non estrale (cioè metestro e diestro) tra la fase asintomatica (prima dell'insorgenza dell'EAE) e la fase sintomatica (dopo l'insorgenza dell'EAE) (p = 0,042; Figura 2D), principalmente a causa di un aumento del tempo trascorso in diestro durante le fasi sintomatiche (p = 0,017) e di una tendenza a ridurre il tempo trascorso in proestro (p = 0,08).

E' già stato descritto che la procedura di induzione porta ad un'alterazione del ciclo estrale nelle femmine, interessando in particolare il proestro25. Durante questa fase, è noto che l'aumento dei livelli di estrogeni esercita effetti antinfiammatori e neuroprotettivi16 e, quindi, è possibile che sia responsabile del ruolo protettivo di tali ormoni durante la fase presintomatica. Tuttavia, quando il livello di estrogeni diminuisce, come vediamo nella fase post-insorgenza, terminano anche i loro effetti protettivi.

Punteggio clinico e prestazioni del rotarod
L'ANOVA bidirezionale (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra un significativo aumento del tempo nel punteggio clinico (CS) sia dei maschi che delle femmine (F(56-813) = 27.951, p < 0.001; Figura 3A). In particolare, a partire da 10 dpi, entrambi i sessi mostrano un aumento significativo del CS (p < 0,001), che si mantiene fino all'endpoint (28 dpi) (Figura 3A). Le femmine mostrano, anche se non in modo significativo (p = 0,156), un CS più elevato rispetto ai maschi (Figura 3A). In termini di insorgenza della malattia, si verifica generalmente intorno ai 10 dpi, con una tendenza ad esordio più precoce nelle femmine rispetto ai maschi (Figura 3B). Inoltre, le femmine mostrano un CS cumulativo significativamente più elevato rispetto ai maschi (p = 0,017; Figura 3C).

Il corso delle prestazioni di rotarod assomiglia alle valutazioni cliniche (Figura 2D). A partire dall'esordio della malattia, diminuisce, raggiungendo la prestazione minima durante la seconda settimana dopo l'immunizzazione, nella fase acuta dell'EAE. L'ANOVA bidirezionale (sesso e tempo come variabili indipendenti) mostra una significativa diminuzione nel tempo delle prestazioni del rotarod sia nei maschi che nelle femmine (F(46-673) = 5,365, p < 0,001; Figura 3D). In particolare, i maschi mostrano le prestazioni minime a 16 dpi (p = 0,022) mentre le femmine a 17 dpi (p < 0,001). I maschi tendono a ottenere prestazioni migliori rispetto alle femmine, specialmente durante la fase cronica della malattia (21-28 dpi), probabilmente come conseguenza di una CS più bassa (Figura 3A,D).

Valutazione istopatologica del midollo spinale
L'ANOVA unidirezionale (sesso come variabile indipendente) dei PvII nelle sezioni del midollo spinale evidenzia una chiara differenza tra maschi e femmine (Figura 4A). Le femmine mostrano un numero significativamente più alto di PvII rispetto ai maschi (F(1,14)= 63.107, p < 0.001; Figura 4B). Questi dati riflettono probabilmente la CS cumulativa più elevata, le peggiori prestazioni di rotarod e la malattia più aggressiva osservata nelle femmine, specialmente durante la fase cronica dell'EAE.

Questi dati riflettono anche il fatto che i topi femmina mostrano una maggiore suscettibilità allo sviluppo di EAE più aggressivi rispetto ai maschi14, che è una delle principali differenze tra questo modello di malattia e la SM che si verifica negli esseri umani. Le donne mostrano un esordio precoce della malattia, hanno una prevalenza moderatamente inferiore di forme primarie progressive e mostrano una progressione della disabilità complessivamente inferiore rispetto agli uomini 2,33,34.

Figura 1: Rappresentazione temporale schematica delle procedure sperimentali. Creato con BioRender.com. Abbreviazioni: i.v. = endovenoso; s.c. = sottocutaneo; MOG35-55 = peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina 35-55; = dpi = giorno dopo l'immunizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Valutazione degli effetti dell'EAE sul peso corporeo, sull'assunzione di cibo nei topi maschi e femmine e sul ciclo estrale nei topi femmine. Dal giorno dell'immunizzazione (0 dpi) fino al giorno del sacrificio (28 dpi), i grafici mostrano (A) il peso corporeo giornaliero, (B) la percentuale del peso corporeo e (C) la valutazione settimanale dell'assunzione di cibo negli animali di entrambi i sessi (n = 15/gruppo). (D) Tempo trascorso (espresso come percentuale media di tempo) nelle diverse fasi del ciclo estrale, valutato mediante strisci citologici vaginali, durante la fase asintomatica (pre-insorgenza, colonna di sinistra del grafico) o la fase sintomatica (post-insorgenza, colonna di destra del grafico) nei topi femmine. I dati sono presentati come media ± SEM. L'analisi statistica ha rivelato un effetto significativo per p≤ 0,05 (# = maschi vs. femmine; * = confronto tra diversi punti temporali). Abbreviazioni: EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; BW = peso corporeo; FI = assunzione di cibo; DPI = giorno dopo l'immunizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione del punteggio clinico e delle prestazioni di rotarod in topi maschi e femmine affetti da EAE. (A) Valutazione del punteggio clinico giornaliero (da 0 a 28 dpi) negli animali di entrambi i sessi (n = 15/gruppo). (B) Giorno di insorgenza della malattia (dpi medio) nei topi maschi affetti da EAE (colonna sinistra) e femmine (colonna destra). (C) Punteggio clinico cumulativo medio raggiunto dai topi maschi (colonna di sinistra) e femmine (colonna di destra) affetti da EAE. (D) Valutazione delle prestazioni giornaliere di rotarod (misurate come latenza di caduta) da 6 a 28 dpi (lo 0 rappresenta i valori basali ottenuti entro i primi 5 giorni della prova) negli animali di entrambi i sessi. I dati sono presentati come media ± SEM. L'analisi statistica ha rivelato un effetto significativo per p≤ 0,05 (# = maschi vs. femmine; * = confronto tra diversi punti temporali). Abbreviazioni: EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; CS = punteggio clinico; Cum CS = punteggio clinico cumulativo; DPI = giorno dopo l'immunizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi dell'infiammazione nel midollo spinale di topi affetti da EAE di entrambi i sessi. (A) Immagini rappresentative di sezioni trasversali del midollo spinale colorate con ematossilina-eosina evidenziano la presenza di PvII (frecce) in topi maschi (immagine in alto) e femmine (immagine in basso). (B) Misura della presenza di PvII nel midollo spinale di topi affetti da EAE di entrambi i sessi (n = 8/gruppo). I dati sono presentati come media ± SEM. L'analisi statistica ha rivelato un effetto significativo per p ≤ 0,05 (# = maschi vs. femmine). Barra della scala = 200 μm (ingrandimento 10x). Abbreviazioni: EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; * = canale centrale; PvIIs = infiltrati infiammatori perivascolari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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