Terapia fotodinamica antimicrobica mediata da curcuminoidi su un modello murino di candidosi orale

La candidosi orale (OC) è la principale infezione fungina del cavo orale; è causata dalla crescita eccessiva di Candida spp. I fattori predisponenti all'OC includono la disfunzione endocrina, l'uso di antibiotici ad ampio spettro, la radioterapia e la chemioterapia, le carenze nutrizionali, la xerostomia (basso flusso salivare), l'uso di protesi, la scarsa igiene e, soprattutto, l'immunosoppressione¹. Tra le specie di Candida , la Candida albicans è la più diffusa e virulenta; Si trova come specie commensale nel corpo umano e come patogeno opportunista. C. albicans ha la capacità di cambiare la sua morfologia da lieviti commensali (blastopori) a filamenti patogeni (ife e pseudoife)². Le forme filamentose, in particolare le ife, possono invadere l'epitelio ospite per endocitosi o penetrazione attiva, causando infezione³. Altri fattori di virulenza di C. albicans includono l'adesione, la formazione di biofilm e la secrezione di enzimi e tossine lipolitiche e idrolitiche, come lipasi, fosfolipasi, proteinasi e candidalisina⁴.

I trattamenti OC prevedono l'uso di agenti antimicotici, in particolare polieni e azoli topici (nistatina e miconazolo)⁵. Tuttavia, mostrano solo un'efficacia a breve termine e le recidive sono frequenti. Inoltre, l'uso eccessivo di antimicotici ha dato origine al problema dello sviluppo e della diffusione della resistenza antifungina⁶. Pertanto, sono necessarie terapie alternative, come la terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT), che combina un fotosensibilizzante (PS) e la luce a una lunghezza d'onda appropriata (la stessa di quella dell'assorbimento del PS) in presenza di ossigeno. I PS sono legati o assorbiti dalle cellule e, quando attivati dalla luce, producono specie reattive dell'ossigeno (ROS) che sono tossiche per le cellule sensibilizzate⁷.

Nell'aPDT, uno dei fotosensibilizzanti (PS) impiegati è la curcumina (CUR), un composto naturale estratto dai rizomi della pianta di curcuma (Curcuma longa L.). La curcumina possiede numerosi attributi terapeutici, tra cui capacità antinfiammatorie, antiossidanti, antitumorali e antimicrobiche ^8,9. Un'indagine precedente ha rilevato che l'aPDT che utilizza CUR ha diminuito efficacemente C. albicans in un modello murino di candidosi orale senza causare alcun danno ai tessuti dell'ospite¹⁰. Il CUR è il principale curcuminoide estratto dalla curcuma, ma in questa pianta si trovano anche altri polifenoli, come la demetossicurcumina e la bis-demetossicurcumina. L'aPDT mediata da curcuminoidi ha dimostrato attività antibatterica contro i biofilm di Staphylococcus aureus cresciuti in cateteri¹¹. Tuttavia, per quanto ne sappiamo, la sua attività antimicotica contro C. albicans rimane poco chiara. Pertanto, in questo studio, abbiamo valutato l'aPDT mediata da un sale curcuminoide contro C. albicans in un modello murino di OC.

Il protocollo di ricerca per l'uso dei topi è stato approvato dal Comitato Etico per l'Uso Animale (casi numeri 05/2008 e 09/2020) presso la Scuola di Odontoiatria, Araraquara, UNESP. C. albicans (ATCC 90028) è stato utilizzato come ceppo di riferimento. Per il presente studio sono stati utilizzati topi svizzeri femmine di sei settimane (n = 45), con un intervallo di massa corporea di 20-30 g. Gli animali sono stati forniti dall'Università Statale di San Paolo, UNESP, Botucatu.

1. Preparazione del PS e selezione della sorgente luminosa per aPDT

1. Preparare il PS secondo le specifiche della sostanza da testare.
   NOTA: In questo studio, una miscela idrosolubile di curcuminoidi (miscela salina solubile in acqua a base di CUR¹²) è stata utilizzata come PS (vedere la tabella dei materiali e la figura 1). Le diluizioni a 20 μM, 40 μM e 80 μM (rispettivamente 15,6, 29,2 e 58,4 mg/L) sono state preparate in acqua ultrapura immediatamente prima dell'uso e mantenute a 5 °C.
2. Selezionare un'apparecchiatura luminosa con una lunghezza d'onda appropriata (la stessa dell'assorbimento PS) in grado di illuminare l'intero bersaglio fotosensibilizzato in modo uniforme e simultaneo senza riscaldare il tessuto.
   NOTA: In questo studio è stato utilizzato un manipolo contenente un diodo a emissione luminosa (LED, vedi Tabella dei materiali), progettato presso l'Instituto de Física de São Carlos (Università di São Paulo, São Carlos, SP, Brasile). La potenza di uscita erogata dalla luce era di 89,2 mW/^cm2 a una lunghezza d'onda blu di circa 455 nm.

2. Preparazione dell'inoculo di C. albicans

1. Conservare il ceppo di riferimento C. albicans (ATCC 90028) in lievito-peptone-glucosio (YEPD, vedere Tabella dei materiali) con glicerolo al 50% a -80 °C fino all'uso.
2. Scongelare il ceppo congelato a temperatura ambiente, distribuire un'aliquota di 100 μL su una capsula di Petri con agar destrosio Sabouraud (SDA) con cloramfenicolo (vedere Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 48 ore.
3. Trasferire cinque colonie in 10 mL di brodo di azoto di lievito con terreno di glucosio al 2% (YNBg) e far crescere aerobicamente a 37 °C per 16 ore.
4. Diluire la coltura di lievito in YNBg fresco (1:10) e incubare aerobicamente a 37 °C fino a quando la densità ottica raggiunge la fase di crescita a metà log.
   NOTA: Standardizzare preventivamente la curva di crescita microbica per ciascun laboratorio. Nella ricerca attuale, le colture sono state lasciate incubare per circa 8 ore, fino a raggiungere la fase di crescita media-logaritmica, come indicato dalla densità ottica a 540 nm (OD₅₄₀), con un valore medio di 0,536 ± 0,062 unità arbitrarie (media ± deviazione standard [SD]).
5. Centrifugare la coltura a 5.000 x g a temperatura ambiente per 5 minuti, scartare il surnatante e lavare il pellet due volte con lo stesso volume di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Utilizzare aliquote da 100 μL per eseguire quattro diluizioni seriali di 10 volte in PBS, distribuire diluizioni su piastre SDA e incubare a 37 °C per 48 ore per la conta delle colonie. Come standard, le sospensioni fungine sono utilizzate a concentrazioni di circa 4,5 × 10⁷ unità formanti colonie per millilitro (CFU/mL)].

3. Induzione di OC nei topi

NOTA: La seguente metodologia è stata precedentemente descritta da Takakura et ^al.13 e riprodotta dal nostro gruppo^10,14, con alcune modifiche.

1. Distribuire in modo casuale i topi in nove gruppi (n = 5), corrispondenti allo stesso numero di trattamenti (File supplementare 1).
   NOTA: La cavità orale dei topi dovrebbe essere negativa per la crescita della Candida . Questo deve essere verificato tamponando la cavità orale e placcando il campione su SDA.
2. Tenere gli animali in box di propilene¹⁰ (max 5 topi per box), con trucioli di legno per il rivestimento del pavimento, in vivaio a temperatura controllata a 23 ± 2 °C con un ciclo luce/buio di 12/12 ore. Non è necessario fornire un arricchimento specifico.
3. Mantenere i topi con dieta per topi estrusi e acqua filtrata ad libitum.
4. Iniettare per via sottocutanea il farmaco immunosoppressore, prednisolone (100 mg/kg di peso corporeo, vedere Tabella dei materiali), per la prima volta il primo giorno a tutti i membri dei gruppi C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ e C-L- (File supplementare 1).
   NOTA: Tenere i topi dello stesso gruppo nella stessa scatola e monitorarli quotidianamente per qualsiasi segno di stress e perdita di peso. Consultare il veterinario per analgesici o cibo/acqua alterati se si notano stress o perdita di peso.
5. A partire dal primo giorno e fino alla fine dell'esperimento, fornire tetraciclina cloridrato in acqua potabile a 0,83 mg/mL¹³.
6. Inoculare le lingue di topo il secondo giorno, compresi i gruppi C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ e C-L- (File supplementare 1), con l'inoculo di C. albicans . Non inoculare i topi del gruppo di controllo negativo (NCtrl).
   1. Sedare gli animali mediante iniezione intramuscolare di 10 mg/kg di cloruro di clorpromazina (vedere Tabella dei materiali) su ciascun muscolo della coscia prima di effettuare l'inoculazione.
   2. Eseguire l'inoculazione intraorale dei topi immergendo un tampone sterile (uno per animale) in una sospensione standardizzata di C. albicans appena preparata (cioè preparata immediatamente prima dell'inoculazione).
   3. Metti i topi sedati in posizione supina. Tira delicatamente fuori la lingua dalla bocca usando una pinza sterile. Strofinare la lingua di ogni topo con un tampone imbevuto per 30 secondi. Monitora i topi fino a quando non si riprendono dalla sedazione.
7. Il quinto giorno, somministrare un'iniezione sottocutanea complementare di prednisolone (100 mg/kg di peso corporeo) per mantenere l'immunosoppressione.
   NOTA: Questo protocollo è adeguato per mantenere l'infezione per 7 giorni dopo l'inoculazione intraorale. La sequenza temporale del protocollo è illustrata nella Figura 2.

4. Terapia fotodinamica antimicrobica e recupero di C. albicans da lesioni orali

1. Il settimo giorno, prima del trattamento, anestetizzare gli animali utilizzando un'iniezione intraperitoneale di ketamina cloridrato (100 mg/kg di peso corporeo) combinata con xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) (vedere Tabella dei materiali).
2. Posizionare ogni animale in posizione supina su un dispositivo a tampone^14,15 dotato di fili di acciaio inossidabile che possono essere avvolti intorno agli incisivi per mantenere la bocca aperta.
   NOTA: I cuscinetti isotermici sono consigliati per riscaldare i topi mentre sono sedati, prevenire l'ipotermia a temperatura ambiente ed evitare la mortalità correlata all'anestesia¹⁵. Ogni animale anestetizzato deve essere monitorato dalla mancanza di un riflesso di astinenza quando le dita dei piedi vengono pizzicate per confermare la profondità dell'anestesia. Se necessario, può essere somministrata una dose di mantenimento di ketamina a 1/3 della dose originale (senza xilazina).
3. Con la mandibola e le guance retratte, posiziona delicatamente la lingua fuori dalla bocca.
4. Per i topi dei gruppi C+L+, pipettare 70 μL di PS sul dorso della lingua (a una delle concentrazioni testate). Mantenere i topi in un ambiente buio per una durata di 20 minuti come periodo di pre-irradiazione. Assicurarsi che durante questo periodo la lingua di ogni animale rimanga posizionata all'interno della cavità orale per evitare l'ingestione del fotosensibilizzante (PS).
5. Dopo il periodo di fotosensibilizzazione, estrarre la lingua dalla bocca per l'illuminazione. Posizionare il dispositivo LED sul dorso della lingua e illuminarlo a 37,5 J/cm² (7 minuti con il dispositivo attuale) (Figura 3).
6. Per gli animali del gruppo C+L-, pipettare 70 μL di PS a una delle concentrazioni testate sul dorso della lingua e tenere questi topi al buio per 27 minuti.
7. Per gli animali del gruppo C-L+ (trattati con luce senza fotosensibilizzazione precedente), pipettare 70 μL di soluzione salina sterile sul dorso della lingua. Tenere i topi al buio per 20 minuti e poi illuminare la lingua a 37,5 J/cm² (7 minuti con il presente dispositivo).
8. Per i topi del gruppo C-L- (non trattati né con PS né con luce), pipettare 70 μL di soluzione salina sterile sul dorso della lingua e tenerli al buio per 27 min.
9. Recuperare C . albicans dalla lingua di tutti i topi subito dopo il trattamento. Tamponare il dorso della lingua per 1 minuto con un batuffolo di cotone sterile.
10. Posizionare ciascun tampone del campione in una provetta contenente 1 mL di soluzione fisiologica sterile e vortice per 1 minuto per risospendere le cellule microbiche.
11. Eseguire immediatamente diluizioni seriali di 10 volte in PBS e piastre aliquote da 25 μL su piastre SDA in duplicato. Incubare le piastre aerobicamente a 37 °C per 48 ore.
12. Dopo 48 ore, utilizzare un contatore digitale di colonie (vedi Tabella dei materiali) per determinare il conteggio delle colonie di lievito. Calcolare il carico di C. albicans (CFU/mL) per ogni animale.
13. Trasformare i valori di CFU/mL in log₁₀ e analizzarli correttamente in base al disegno dell'esperimento e alle ipotesi dei dati.
    NOTA: Nella presente indagine, è stato utilizzato l'ANOVA unidirezionale di Welch e il test post-hoc di Games-Howell (α = 0,05)¹⁶ .

5. Analisi istopatologiche

1. L'ottavo giorno, anestetizzare i topi con ketamina a 100 mg/kg combinata con xilazina a 10 mg/kg tramite iniezione intraperitoniale ed eutanasia con un sovradosaggio di ketamina (200 mg/kg somministrata per via intraperiotoniale). Confermare la morte controllando l'assenza di movimento respiratorio (apnea) e l'assenza di battito cardiaco (asistolia).
2. Pizzica con cura la lingua ed estraila dalla bocca dell'animale. Utilizzando un bisturi manuale, praticare un'incisione prima delle papille circumvallate per rimuovere chirurgicamente l'intera lingua senza causare lesioni alle regioni anteriori e centrali.
3. Fissare la lingua in formalina tamponata al 10% (pH 7,2-7,4) per 24 h e lavarla in acqua corrente per 2 h.
4. Procedere con l'inclusione nel processo di paraffina: disidratazione, chiarificazione e impregnazione^10,14.
5. Tagliare le sezioni seriali (5 μm di spessore) utilizzando un microtomo, quindi fissare le sezioni su vetrini. Procedere alla colorazione di queste sezioni utilizzando periodicamente acido-Schiff ed ematossilina (PAS-H) per l'esame istopatologico e l'identificazione dei funghi attraverso l'osservazione al microscopio ottico.
6. Chiedere a un patologo, preferibilmente cieco ai gruppi studiati, di esaminare la reazione tissutale dovuta all'infezione da C. albicans .
7. Descrivere le caratteristiche istologiche del tessuto (epitelio e tessuto connettivo), in particolare le risposte infiammatorie locali di intensità variabile.

Il modello murino di OC ha mostrato tipiche macchie bianche e pseudomembrane sulla lingua di tutti i topi infetti (Figura 4A). C. albicans recuperati da animali C-L- hanno confermato la colonizzazione tissutale da parte di questo microrganismo (valori compresi tra 1,62 x 104 e 4,80 x 105 CFU/mL). Come previsto, gli animali del gruppo NCtr non hanno mostrato alcuna alterazione tissutale o crescita di colonie dopo il campionamento (Figura 4B).

L'aPDT ha diminuito la vitalità di C. albicans quando i curcuminoidi sono stati utilizzati a 80 μM per la fotosensibilizzazione (Figura 5). La riduzione media del log10 ottenuta con aPDT mediata da PS a 80 μM è stata di 2,47, rispetto a quella del gruppo C-L- (p = 0,008).

Il numero di colonie di C. albicans recuperate dalle lingue dei topi non è stato significativamente diverso tra i topi trattati con curcuminoidi senza illuminazione (gruppi C+L-), topi trattati con luce ma non precedentemente fotosensibilizzati (gruppi C-L+) e topi non trattati (gruppo C-L-) (p ≥ 0,210).

Le caratteristiche istologiche delle lingue degli animali non infetti (NCtr) hanno mostrato tessuti normali/sani, tra cui lamina propria intatta, membrana basale e papille filiformi (Figura 6A). Al contrario, esaminando le immagini istopatologiche delle lingue dei topi del gruppo C-L-, era evidente che il lievito e i filamenti erano presenti all'interno dello strato cheratinizzato dell'epitelio, sebbene non vi fosse infiltrazione di funghi. Nel tessuto connettivo sottostante è stata osservata una lieve risposta infiammatoria, mediata principalmente da cellule mononucleate, e le papille filiformi erano notevolmente assenti (Figura 6B). L'analisi istologica delle lingue dei topi in entrambi i gruppi C+L- e C-L+ ha mostrato caratteristiche simili. Al contrario, le sezioni della lingua dei topi trattati con aPDT mediata da curcuminoidi da 80 μM hanno rivelato un numero ridotto di cellule fungine, principalmente limitate allo strato cheratinizzato dell'epitelio (Figura 6C).

Figura 1: Struttura chimica del fotosensibilizzante. La struttura chimica della miscela salina solubile in acqua utilizzata come fotosensibilizzante, composta per il 53,4% da curcumina naturale e per il 46,6% da altri curcuminoidi (demetossicurcumina e bis-demetossicurcumina). Il peso molecolare medio finale è 730.32 g/mol. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Cronologia del protocollo per il modello murino di candidosi orale e aPDT. Una timeline che delinea il protocollo per il modello murino di candidosi orale e terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Illuminazione delle lingue dei topi dopo la fotosensibilizzazione. Dopo la fotosensibilizzazione (incubazione del tessuto infetto con il fotosensibilizzante), le lingue sono state illuminate a 37,5 J/cm2 utilizzando una luce LED blu (~455 nm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Lesioni bianche nel modello murino di candidosi orale. (A) Immagini rappresentative che raffigurano le lesioni bianche osservate nel modello murino di candidosi orale. (B) Controllo negativo (non infetto). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Candida albicans recuperata dalle lingue dei topi. I dati rappresentano i valori medi ± deviazione standard del log10 (CFU/mL) dei gruppi di trattamento. L'ANOVA unidirezionale di Welch ha indicato che gli effetti dei trattamenti erano statisticamente significativamente diversi tra i gruppi (p < 0,001). Diverse lettere minuscole (a, b, c) accanto alle medie indicano differenze statisticamente significative secondo il test di Games-Howell (p≤ 0,030). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Immagini rappresentative di sezioni istologiche di lingue di topo. Le sezioni istologiche delle lingue di topo sono state colorate con PAS-H e le immagini sono state catturate a 200x. (A) Topi di controllo negativo senza candidosi orale indotta, fotosensibilizzazione e illuminazione (gruppo NCtr). (B) Topi con candidosi orale indotta, né fotosensibilizzati né esposti all'illuminazione a LED (gruppo C-L-). (C) Animali con candidosi orale indotta, esposti a curcuminoidi da 80 μM e illuminazione a LED da 37,5 J/cm2 (gruppo C+L+ 80). Barre di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fascicolo supplementare 1: Gruppi sperimentali. Un elenco dei gruppi sperimentali utilizzati nel presente studio. Fare clic qui per scaricare il file.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.