Un modello per l'esposizione sperimentale dell'uomo alle zecche larvali di Ixodes scapularis

Le zecche dure (Ixodidae: Acari) sono ectoparassiti obbligati che si nutrono di sangue che si verificano in tutto il mondo e sono in grado di trasmettere un'ampia gamma di agenti patogeni, tra cui batteri, virus e parassiti, di grande importanza medica e veterinaria. Le zecche ixodid devono rimanere attaccate all'ospite per giorni per completare un pasto di sangue e hanno la capacità di rimanere attaccate alla pelle evitando il riconoscimento, prevenendo la coagulazione locale del sangue e facilitando l'alimentazione a lungo termine ^1,2,3. Studi sugli animali hanno dimostrato che gli ospiti non permissivi acquisiscono resistenza ai morsi di zecca con esposizioni ripetute alle zecche, il che può portare a una diminuzione della capacità di trasmettere un agente patogeno, mentre le zecche possono parassitare ripetutamente gli ospiti permissivi. La resistenza acquisita alle zecche dipende dalla natura della risposta immunitaria dell'ospite 4,5,6,7.

Le malattie trasmesse dalle zecche sono una minaccia crescente negli Stati Uniti (USA), con il numero di casi segnalati più che raddoppiato tra il 2004 e il 2016 ^8,9. A causa dei cambiamenti climatici, gli areali geografici delle diverse zecche continuano ad espandersi^10,11. Le principali malattie trasmesse dalle zecche negli Stati Uniti includono la malattia di Lyme, l'anaplasmosi, l'ehrlichiosi, la rickettsiosi della febbre maculosa, la babesiosi, la tularemia e la malattia da virus Powassan⁸. La malattia di Lyme, causata dall'infezione da Borrelia burgdorferi sensu lato, è la malattia trasmessa dalle zecche più comune negli Stati Uniti e in Europa¹². Con circa 476.000 individui con diagnosi di malattia di Lyme ogni anno negli Stati Uniti, c'è un onere sia per la salute pubblica che per l'economia per gli individui e per la società 13,14,15.

Ixodes scapularis (la zecca dalle zampe nere o cervo) è il vettore principale della malattia di Lyme, così come dell'anaplasmosi, della babesiosi, della malattia di Borrelia miyamotoi e della malattia da virus Powassan negli Stati Uniti. Altre specie di zecche importanti dal punto di vista medico negli Stati Uniti includono Amblyomma americanum (zecca della stella solitaria), Dermacentor variabilis (zecca del cane americano), Ixodes pacificus (zecca dalle zampe nere occidentale), Dermacentor andersoni (zecca del legno delle Montagne Rocciose), Ixodes cookei (zecca della marmotta), Dermacentor occidentalis (zecca della costa del Pacifico), Rhipicephalus sanguineus (zecca del cane marrone) e Amblyomma maculatum (zecca della costa del Golfo)¹⁶.

Lo sviluppo di un metodo per esporre i volontari della ricerca alle punture di zecca supporta gli studi che utilizzano il vettore naturale per cercare prove di infezione, una procedura nota come xenodiagnosi 17,18,19,20,21, e per saperne di più sull'immunità indotta dall'esposizione alle zecche, che può contribuire alla scoperta di un vaccino anti-zecche ^5,6,7. La procedura qui descritta è stata sviluppata e utilizzata nel primo studio di ricerca sull'uomo che utilizza larve di Ixodes scapularis allevate in laboratorio per la xenodiagnosi dell'infezione da B. burgdorferi dopo terapia antibiotica (NCT01143558), pubblicato nel 2014¹⁹. Il sistema è stato utilizzato con successo in uno studio di fase 2 per verificare se una xenodiagnosi positiva fosse correlata alla persistenza dei sintomi dopo il trattamento antibiotico della malattia di Lyme (NCT02446626) e in uno studio che esplorava la risposta dell'ospite alle punture di zecca (NCT05036707).

Questo protocollo descrive il processo per la creazione della medicazione di contenimento, la procedura di posizionamento delle zecche e la procedura di rimozione delle zecche, nonché la cura del sito necessaria per mantenere la medicazione di contenimento. I dettagli riguardanti la colonia di zecche di I. scapularis esente da agenti patogeni e le procedure di esposizione alle zecche utilizzate per gli studi sopra citati sono stati precedentemente descritti^19,22. Questa metodologia offre uno strumento di ricerca flessibile che può essere adattato allo studio di diversi aspetti della risposta dell'ospite umano alle punture di zecca, dell'efficacia dei farmaci per la prevenzione delle zecche, nonché della malattia di Lyme e di altre malattie trasmesse dalle zecche.

L'esposizione dei volontari alle punture di zecca è un metodo sperimentale e deve essere condotto nell'ambito di un protocollo di ricerca clinica approvato dalle autorità regolatorie competenti. Gli studi clinici (NCT01143558, NCT02446626 e NCT05036707) sono stati approvati dai rispettivi comitati di revisione istituzionali, condotti nell'ambito delle esenzioni per i dispositivi sperimentali concesse dalla Food and Drug Administration statunitense e condotti in conformità con le linee guida di buona pratica clinica. Inoltre, questi studi sono stati registrati con ClinicalTrials.gov e il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti.

1. Preparazione della medicazione contenitiva

1. Per creare un modello di misurazione, fotocopiare la medicazione di contenimento idrocolloidale da 3" x 3" lungo il lato delle linee di misurazione (Figura 1A e Tabella dei materiali).
2. Taglia il modello fotocopiato lungo la linea di 1". Quindi, taglia lungo la linea da 2", creando un cerchio da 2" con un centro da 1" (Figura 1B).
3. Usando questo modello, tagliare la medicazione in schiuma non adesiva per creare un cerchio di 2" con un centro di 1" (Figura 2A, B e Tabella dei materiali).
4. Usando lo stesso modello, taglia un cerchio di 2 pollici al centro della medicazione idrocolloidale extrasottile da 4 "x 4" (Figura 2C, D).
5. Tagliare lo strato idrocolloidale della medicazione di contenimento da 3" x 3" sulla linea di 11/2".
6. Tirare indietro il rivestimento di carta dello strato idrocolloidale della medicazione di contenimento per esporre l'adesivo. Posizionare la medicazione in schiuma tagliata all'interno del cerchio da 2" dell'adesivo (Figura 3A). Ciò garantirà che la medicazione in schiuma si estenda oltre l'apertura della medicazione di contenimento. Riposizionare il rivestimento di carta sullo strato idrocolloidale della medicazione (Figura 3B).
   NOTA: Queste misurazioni sono state utilizzate per studi che hanno coinvolto fino a 10 zecche larvali di I. scapolaris . Per gli studi che hanno coinvolto fino a 30 zecche larvali di I. scapularis , il modello per il centro della schiuma è stato tagliato tra i segni da 1" e 11/2" per consentire un'area più ampia per il posizionamento. Le misure della medicazione di contenimento possono essere adattate di conseguenza al disegno dello studio.

2. Posizionamento delle zecche

1. Conservazione delle zecche
   1. Conservare le zecche larvali di I. scapularis in un frigorifero per uso medico con la temperatura impostata a 9-10 °C.
   2. Conservare le zecche in una fiala coperta con un tappo a rete per consentire un flusso d'aria adeguato. Confezionare la fiala di zecche in un sacchetto di plastica sigillabile con una spugna leggermente inumidita per mantenere l'umidità e prevenire l'essiccazione.
2. Posizionamento delle zecche
   1. Togliete le zecche dal frigorifero per farle scaldare a temperatura ambiente. Le zecche possono diventare attive in soli 15 minuti fuori dal frigorifero.
   2. Posiziona un foglio bianco attorno all'area di posizionamento per visualizzare facilmente qualsiasi segno di spunta caduto inavvertitamente.
   3. Inumidisci una garza da 4 "x 4" con acqua pulita o soluzione salina e usala per pulire la pelle del sito di posizionamento. L'area deve essere asciugata tamponando o lasciata asciugare all'aria.
      NOTA: Quando si seleziona il sito del corpo per il posizionamento delle zecche, considerare le aree che non limitano le attività quotidiane del volontario e dove l'integrità della medicazione può essere facilmente monitorata dal partecipante. Non posizionare le zecche in aree in cui potrebbero essere schiacciate a causa della pressione diretta (ad esempio, la parte posteriore). Valutare i peli del corpo del partecipante e, se necessario, tagliare accuratamente i peli del corpo in eccesso usando le forbici nel sito dell'adesivo, evitando danni alla pelle. Evitare l'uso di un rasoio per la depilazione, poiché potrebbe aumentare il rischio di lesioni e infezioni della pelle.
   4. Una volta che la pelle è asciutta, rimuovere il rivestimento adesivo dal lato idrocolloidale della medicazione preparata e fissarlo saldamente alla pelle nel sito di posizionamento, assicurandosi che lo strato di rete rimanga aperto.
   5. Rompere il tampone di legno (vedi Tabella dei materiali) a metà per esporre le estremità frastagliate.
   6. Aprire con cautela la fiala di zecche.
   7. Utilizzando l'estremità frastagliata del tampone di legno, trasferire le zecche attive dal flaconcino e posizionarle sulla pelle all'interno della medicazione di contenimento (Figura 4A). Chiedi a un altro membro del team di monitorare il sito di posizionamento delle zecche per assicurarsi che le zecche rimangano all'interno della medicazione di contenimento. Utilizzare del nastro adesivo per intrappolare le zecche che fuoriescono dalla fiala durante questo processo.
      NOTA: Rompere un tampone di legno e utilizzare l'estremità frastagliata è efficace per la manipolazione e il trasferimento delle zecche senza causare danni alle zecche. Un piccolo pennello con setole morbide di colore chiaro funziona anche per trasferire le zecche dal contenitore al sito della pelle.
   8. Una volta posizionato il numero specificato di zecche per lo studio, rimuovere il rivestimento adesivo dallo strato di rete della medicazione di contenimento e chiuderlo sopra l'apertura.
   9. Dopo essersi assicurati che l'adesivo sia fissato saldamente, applicare la medicazione idrocolloidale extra-sottile da 4" x 4" preparata sopra la medicazione di contenimento per una maggiore sicurezza (Figura 4B).
      NOTA: Ulteriori informazioni riguardanti la colonia di zecche di I. scapularis esente da agenti patogeni e la durata delle procedure di esposizione alle zecche utilizzate negli studi citati possono essere trovate nelle sezioni dei metodi degli studi pubblicati^19,22.

3. Cura del sito

1. Fornire una copertura impermeabile e un nastro ipoallergenico da 2" (vedi Tabella dei materiali) al partecipante alla ricerca.
2. Fornire istruzioni per la cura del sito di contenimento delle zecche.
   1. Controllare periodicamente la medicazione e monitorare i bordi per un'adesione sicura alla pelle. Applicare altro nastro adesivo per rinforzare i bordi di ravvivatura secondo necessità.
   2. Non graffiare il sito di medicazione e astenersi dall'aprire o rimuovere la medicazione durante il periodo di studio.
   3. Evitare di fare il bagno o immergersi in acqua. Inoltre, evita le docce calde e limita la durata della doccia. Prima di fare la doccia, proteggere la medicazione contenitiva con la copertura barriera all'acqua in dotazione e rimuoverla dopo aver completato la doccia. Asciuga delicatamente la medicazione e ispezionala per assicurarti che rimanga sicura.
   4. Evitare attività che possono portare a una forte sudorazione e compromettere l'integrità della medicazione (ad esempio, esercizio aerobico, escursioni prolungate).

4. Rimozione delle zecche

1. Preparazione fiale di raccolta
   1. Etichettare le fiale di raccolta delle zecche con gli identificatori desiderati (ad esempio, codice di studio, data).
   2. Se è necessaria la conservazione di zecche vive, praticare dei fori nel tappo delle fiale con un ago da 20 G. Utilizzare uno strato di rete di nylon o poliestere insieme al tappo per sigillare la fiala. Metti un pezzetto di spugna umida in un sacchetto sigillabile con la fiala di zecche per mantenere l'umidità.
2. Rimozione delle zecche
   1. Posiziona delle lenzuola bianche intorno al sito della benda e assicurati che una bacinella di raccolta sia a portata di mano.
   2. Usando salviettine imbevute di alcol, rimuovere con cura la benda dalla pelle.
   3. Una volta rimossa completamente, posizionare la benda nella bacinella di raccolta ed esaminarla per verificare la presenza di zecche staccate.
   4. Valutare il sito di posizionamento per le zecche attaccate. Le zecche che si sono alimentate fino al rifornimento si staccheranno (Figura 5A). Per le zecche attaccate rimanenti, utilizzare una pinza a punta fine per la rimozione (Figura 5B).
   5. Pulisci la pelle con salviettine imbevute di alcol o acqua e sapone.

Lo studio ha dimostrato che la procedura è sicura e ben tollerata, con l'evento avverso primario che è un lieve prurito nel sito dei morsi, osservato nel 58% delle procedure. Non ci sono stati eventi avversi gravi correlati alla procedura quando si utilizzano zecche larvali pulite di I. scapularis allevate in laboratorio19. Nelle 43 procedure condotte, la percentuale media di recupero delle zecche attaccate rispetto alle zecche posizionate è stata del 45% ± del 27% (DS), con una percentuale mediana del 40% (Figura 6).

La durata esatta dell'attaccamento delle zecche larvali di I. scapularis all'uomo rimane poco chiara, poiché il tempo dal posizionamento della zecca all'attacco della zecca non è stato osservato di routine. In un caso in cui un volontario di ricerca è stato osservato per 2 ore e mezza, nessuna delle zecche si era attaccata entro la fine del periodo. Ci vogliono da 4 a 5 giorni dal posizionamento delle zecche larvali di I. scapularis per nutrirsi fino alla replezione19.

Figura 1: Misure della medicazione di contenimento. (A) Una fotocopia della medicazione di contenimento. (B) Il modello di misurazione della medicazione di contenimento creato tagliando la fotocopia in corrispondenza dei segni desiderati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Creazione di medicazioni di rinforzo non adesive e idrocolloidali. (A) Utilizzo del modello di misurazione della medicazione di contenimento per tagliare la medicazione in schiuma. (B) Un cerchio da 2" con una medicazione in schiuma centrale da 1". (C) Utilizzando il modello di misurazione della medicazione di contenimento per tagliare la medicazione idrocolloidale. (D) Una medicazione idrocolloidale da 4" x 4" con un centro da 2". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Medicazione di contenimento. (A) La medicazione in schiuma sul lato adesivo dello strato idrocolloidale della medicazione di contenimento. (B) Medicazione di contenimento utilizzata per l'alimentazione delle zecche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Posizionamento delle zecche. (A) Trasferimento delle zecche sul volontario di ricerca. (B) Fissaggio della medicazione di contenimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Raccolta di zecche. (A) Punte piene staccate. (B) Rimozione delle zecche attaccate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Recupero di zecche larvali di Ixodes scapolaris gonfie. Ogni punto rappresenta la percentuale di zecche larvali di I. scapularis rigonfie recuperate utilizzando il protocollo descritto. La percentuale media di zecche guarite è stata di 45 ± 27 (DS). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La dottoressa Adriana Marques ha un brevetto US 8,926,989 B2; ed è consulente scientifico non retribuito della Global Lyme Alliance e dell'American Lyme Disease Foundation. Siu Ping Turk e Aleah Eschman non hanno un'associazione che possa rappresentare un conflitto di interessi. Il contenuto di questa pubblicazione non riflette necessariamente le opinioni o le politiche del Dipartimento della Salute e dei Servizi Umani, né la menzione di nomi commerciali, prodotti commerciali o organizzazioni implica l'approvazione da parte del governo degli Stati Uniti.