Cattura dell'agitazione basata sul citoscheletro del nucleo dell'ovocita di topo su scale spaziali

Sommario

Questo protocollo fornisce un quadro sperimentale per documentare l'impatto fisico del citoscheletro sulla forma nucleare e sugli organelli interni privi di membrana nel sistema ovocitario di topo. Il framework può essere adattato per l'uso in altri tipi di cellule e contesti.

Abstract

Una delle principali sfide nella comprensione delle cause dell'infertilità femminile è quella di chiarire i meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule germinali femminili, chiamate ovociti. Il loro sviluppo è caratterizzato dalla crescita cellulare e dalle successive divisioni, due fasi critiche che preparano l'ovocita alla fusione con gli spermatozoi per avviare l'embriogenesi. Durante la crescita, gli ovociti riorganizzano il loro citoplasma per posizionare il nucleo al centro della cellula, un evento predittivo del successo dello sviluppo degli ovociti nei topi e nell'uomo e, quindi, del loro potenziale embriogenico. Negli ovociti di topo, è stato dimostrato che questa riorganizzazione citoplasmatica è guidata dal citoscheletro, la cui attività genera forze meccaniche che agitano, si riposizionano e penetrano nel nucleo. Di conseguenza, questa trasmissione di forza citoplasmatica-nucleoplasmatica sintonizza la dinamica degli organelli di elaborazione dell'RNA nucleare noti come condensati biomolecolari. Questo protocollo fornisce un quadro sperimentale per documentare, con un'elevata risoluzione temporale, l'impatto del citoscheletro sul nucleo su scale spaziali negli ovociti di topo. Descrive in dettaglio le fasi e gli strumenti di imaging e analisi delle immagini necessari per valutare i) l'attività del citoscheletro nel citoplasma dell'ovocita, ii) l'agitazione del nucleo dell'ovocita basata sul citoscheletro e iii) i suoi effetti sulla dinamica biomolecolare del condensato nel nucleoplasma dell'ovocita. Al di là della biologia degli ovociti, i metodi qui elaborati possono essere adattati per l'uso nelle cellule somatiche per affrontare in modo simile la sintonizzazione basata sul citoscheletro delle dinamiche nucleari su tutte le scale.

Introduzione

Il posizionamento nucleare è essenziale per molteplici funzioni cellulari e di sviluppo 1,2,3,4,5. Le cellule germinali femminili dei mammiferi chiamate ovociti rimodellano il loro citoplasma per posizionare il nucleo al centro della cellula nonostante subiscano una divisione asimmetrica delle dimensioni, che si basa sul successivo decentramento del cromosoma⁶ (Figura 1). Questa centratura del nucleo predice il successo dello sviluppo degli ovociti nei topi e nell'uomo ^7,8 e, quindi, il loro potenziale embriogenico (Figura 1).

Il rimodellamento citoplasmatico negli ovociti di topo è guidato principalmente dal citoscheletro dell'actomiosina⁹ (Figura 2). La sua attività genera forze meccaniche che agitano, si riposizionano e penetrano nel nucleo¹⁰ (Figura 2). Di conseguenza, questa trasmissione di forza citoplasmatica-nucleoplasmatica sintonizza la dinamica degli organelli di elaborazione dell'RNA messaggero nucleare chiamati macchioline nucleari¹¹, uno dei numerosi organelli senza membrana nel nucleo noti come condensati biomolecolari 12,13,14,15,16 (Figura 2).

L'imaging dal vivo è stato decisivo per decifrare le implicazioni funzionali dell'agitazione nucleare. I filmati della migrazione nucleare nel corso delle ore, così come i filmati ad alta risoluzione temporale della maglia di actina e del citoplasma di massa, hanno ampiamente contribuito all'elaborazione di un modello teorico per il posizionamento nucleare, collegando diverse scale temporali⁹. Inoltre, filmati ad alta risoluzione temporale del citoplasma, del profilo nucleare e dei componenti nucleari come la cromatina e i condensati nucleari, hanno evidenziato il ruolo dell'agitazione del nucleo basata sul citoscheletro sull'elaborazione dell'RNA e sull'espressione genica negli ovociti di topo, collegando diverse scale spazio-temporali all'interno della cellula^10,11. Nel complesso, un tale approccio di incrocio di scala basato sull'imaging dal vivo ha fornito il primo razionale che collega l'agitazione citoscheletrica del nucleo al successo dello sviluppo degli ovociti.

Il protocollo fornisce la pipeline di imaging e analisi delle immagini utilizzata per studiare la trasmissione delle forze citoplasmatiche (generate principalmente dalla F-actina e in parte dai microtubuli) al nucleo e ai suoi componenti interni negli ovociti di topo. Il risultato di questi esperimenti è quello di catturare il continuum delle forze su scale spaziali, dal citoscheletro nel citoplasma all'interno del nucleo attraverso filmati ad alta risoluzione temporale, come mostrato in due recenti studi ^10,11, che hanno stabilito il legame tra i movimenti attivi citoplasmatici, le fluttuazioni del contorno nucleare, così come il movimento e le fluttuazioni superficiali di un singolo tipo di condensati biomolecolari nucleari: macchioline nucleari. Lo stesso approccio può essere applicato ad altri sistemi modello in cui ci si aspetta che le forze citoplasmatiche cambino, come nel contesto delle cellule tumorali maligne¹⁷.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida della Comunità Europea e sono stati approvati dal Ministero dell'Agricoltura francese (autorizzazione n. 75-1170) e dalla Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; DUO 5291). I topi sono stati alloggiati nella struttura per animali con un ciclo luce/buio di 12 ore, con una temperatura ambiente di 22-24 °C e un'umidità del 40%-50%. I topi utilizzati includono la femmina OF1 (Oncins France 1, da 8 a 12 settimane) e la femmina C57BL/6 (da 10 a 14 settimane).

1. Raccolta e preparazione degli ovociti

1. Raccogliere ovociti da topi di età compresa tra 8 e 14 settimane come descritto in¹⁸ e¹⁹.
   1. In breve, per prima cosa estrarre le ovaie dai topi come in¹⁸ in terreno preriscaldato (37 °C) M2+Albumina sierica bovina (BSA) integrato con 1 μM di Milrinone¹⁹, che impedisce la ripresa della meiosi negli ovociti.
   2. Perforare i follicoli ovarici con aghi chirurgici per liberare gli ovociti in crescita dai follicoli antrali (fine della crescita degli ovociti²⁰).
   3. Raccogliere ovociti delle dimensioni necessarie per gli esperimenti (ovociti in crescita e/o completamente cresciuti) con una micropipetta specializzata per la raccolta degli ovociti, prima di lavarli e spostarli in piatti con terreno fresco sotto olio minerale.
2. Dissociare meccanicamente gli ovociti dalle cellule follicolari antrali pipettando su e giù e lasciare stabilizzare per 1 ora nell'incubatrice a 37 °C prima di procedere con le successive fasi sperimentali.
   NOTA: Gli ovociti vengono mantenuti a 37 °C durante tutte le fasi sperimentali. Per questo protocollo sono stati raccolti gli ovociti più grandi, che sono quelli completamente cresciuti.

2. Microiniezione di ovociti

NOTA: Per catturare l'attività basata sul citoscheletro nel citoplasma, viene utilizzato l'imaging in tempo reale in campo chiaro. La microiniezione di marcatori fluorescenti non è quindi necessaria e il protocollo può essere ripreso dalla fase 3. Per l'immagine del contorno nucleare, è stata utilizzata Rango, una sonda che mostra il tag YFP al suo N-terminale e un tag CFP al suo C-terminale^21,22. Quando viene fotografato in ovociti a 488 nm, etichetta l'intero nucleo, ad eccezione del nucleolo²³, e mostra un contorno nucleare molto nitido. Per visualizzare le macchioline nucleari, è stato utilizzato SRSF2-GFP (NM_011358), un marcatore delle macchioline nucleari¹¹. Lo stesso mezzo viene utilizzato per la raccolta degli ovociti, la microiniezione, la traduzione dell'RNA complementare e l'imaging di cellule vive.

1. Linearizzare il plasmide Rango con SfiI o il plasmide SRSF2-GFP con enzimi di restrizione AgeI.
2. Sintetizzare gli RNA complementari (cRNA) con il kit di trascrizione in vitro appropriato in base al promotore (T3 per Rango e T7 per SRSF2-GFP) e purificarli utilizzando un kit di purificazione su colonna, come descritto in precedenza²⁴.
   NOTA: RNA poliadenilato SRSF2-GFP che utilizza un kit di poliadenilazione per aumentare la stabilità del cRNA. Vengono utilizzati due diversi promotori a causa delle differenze nella spina dorsale del plasmide.
3. Misurare le concentrazioni di cRNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolumi.
4. Diluire il cRNA di Rango a 1000 ng/μL e il cRNA SRSF2-GFP a 600 ng/μL in dH₂O.
5. Centrifugare l'aliquota di cRNA a 4 °C per almeno 60 minuti a 25.000 x g prima della microiniezione.
6. Iniettare cRNA codificanti per YFP-Rango o SRSF2-GFP come descritto in^11,25 nel citoplasma degli ovociti in terreno M2+ BSA+Milrinone a 37 °C utilizzando un microiniettore.
7. Incubare gli ovociti per almeno 2 ore in terreno di coltura a 37 °C per la traduzione del cRNA.
8. Depositare gli ovociti in piccole goccioline di terreno di coltura (5 μL) su una piastra di coltura tissutale da 35 mm con fondo di vetro di copertura ricoperto di olio minerale. Posizionare un ovocita per gocciolina per evitare il fotosbiancamento degli ovociti vicini.

3. Imaging di cellule vive

NOTA: Gli ovociti di topo vivi sono stati esaminati con un microscopio confocale invertito dotato di un obiettivo ad immersione in olio Plan-APO 40x/1.25 NA, un piano di scansione motorizzato, una camera di incubazione (37 °C), una telecamera CCD accoppiata a una ruota portafiltri e un disco rotante. Le immagini ad alta risoluzione temporale vengono acquisite utilizzando Metamorph (di seguito denominato software di imaging) in modalità di acquisizione del flusso.

1. Aprire la finestra Acquisisci del software di imaging.
2. Impostare il tempo di esposizione su 500 ms, l'area della fotocamera su Full Chip e il binning su 1.
3. Nella scheda Acquisisci , impostare l'illuminazione per il canale richiesto. Per visualizzare l'attività citoplasmatica, illuminare gli ovociti con la luce trasmessa. Per ottenere l'immagine del nucleo marcato con YFP-Rango o SRSF2-GFP, illuminare gli ovociti con una lunghezza d'onda di eccitazione di 491 nm.
4. Per l'agitazione citoplasmatica o gli esperimenti YFP-Rango, concentrarsi sul nucleolo dell'ovocita che può essere facilmente osservato con la luce trasmessa (Figura 3A). Verrà acquisito un singolo piano. Per gli esperimenti con speckle nucleare, concentrarsi sulle goccioline di SRSF2-GFP (Figura 3C).
5. Nella scheda Speciale , impostare i parametri per ottimizzare la velocità di acquisizione come indicato di seguito.
   Otturatore della fotocamera: aperto per l'esposizione
   Modalità di cancellazione: CANCELLA PRESEQUENZA
6. Aprire la finestra Stream Acquisition (Acquisizione flusso) del software di imaging. Impostare i parametri di streaming in base all'esperimento. Per entrambi gli studi^10,11, utilizzare i parametri descritti di seguito.
   1. Nella scheda Acquisisci , impostare i seguenti parametri.
      Modalità di acquisizione: Stream to RAM
      Numero di fotogrammi: 480 (può essere ridotto a 240 fotogrammi per ridurre il tempo di imaging)
      Parametri della fotocamera: Acquisizione di immagini a frame rate
      Numero (Nb) di fotogrammi da saltare: 0
   2. Nella scheda Parametri controller fotocamera digitale , impostare i seguenti parametri.
      Stato della telecamera: HALT
      Modalità otturatore: APERTO MAI
      Modalità di cancellazione: CANCELLA PRESEQUENZA
      Numero di fotogrammi da mediare: 1
      NOTA 1: In modalità Stream, una volta impostato il tempo di esposizione, la durata del filmato è determinata dal numero di fotogrammi. Ad esempio, un tempo di esposizione di 500 ms e 480 fotogrammi generano un filmato di 4 minuti. È possibile visualizzare un'anteprima durante l'acquisizione dell'immagine.
7. Regolare un'area di interesse (ROI) attorno all'oggetto. Ridurre al minimo l'area del ROI riduce i tempi di acquisizione.
8. Fare clic su Acquisisci nella finestra Stream Acquisition per avviare il filmato.
9. Al termine dell'acquisizione, il filmato viene salvato come file .tif.
   NOTA: Per seguire le strutture nucleari durante i filmati ad alta risoluzione temporale, le sonde nucleari (YFP-Rango e SRSF2-GFP) devono avere un elevato rapporto segnale/rumore per facilitare la segmentazione degli oggetti durante le fasi successive dell'analisi delle immagini. I profili di espressione esogeni di SRSF2-GFP dovrebbero essere paragonabili alle immunocolorazioni a speckle nucleare endogene (Figura 3C-D). I cambiamenti nei profili di espressione di SRSF2-GFP rispetto alla colorazione endogena possono riflettere alte dosi di iniezione e traduzione di cRNA²⁶ (Figura 3C-D).

4. Analisi dell'immagine: agitazione citoplasmatica

NOTA: L'agitazione citoplasmatica che riflette l'intensità dell'attività citoscheletrica a base di actina negli ovociti è determinata da analisi di correlazione di immagini utilizzando un software di una precedente pubblicazione del laboratorio⁹ e disponibile su²⁷. Il software misura la quantità di intensità dei pixel conservata tra immagini consecutive. L'output è la perdita di correlazione tra le immagini nel tempo, a partire da 1 e decrescente esponenzialmente con il tempo, come in⁹.

1. Allinea le immagini time-lapse grezze (Δt=0,5 s) utilizzando il plug-in Fiji StackReg (Plugins>StackReg). Per installare il plug-in StackReg²⁸, abilitare il sito di aggiornamento BIG-EPFL²⁹ per ottenere l'accesso al plug-in.
2. Calcola le correlazioni dell'immagine in campo chiaro in 3 o 4 regioni citoplasmatiche di ~300 μm² seguendo i passaggi seguenti.
   1. Ritaglia le regioni e salvale come file di filmati separati. Apri la finestra Terminale.
   2. Digita ovocita, premi la barra spaziatrice , quindi premi Invio. Viene visualizzata una finestra denominata Signal and Slot. Scegli i file di filmato ritagliati che verranno analizzati.
      NOTA: È possibile selezionare più filmati contemporaneamente.
3. L'applicazione restituisce i file nella stessa cartella dei filmati. Vengono generati tre diversi file con estensioni .csv, .eps e .xls. Il file .xls contiene i dati per disegnare i grafici di correlazione per una regione. Valori medi di correlazione da diverse regioni all'interno di una cella.
4. Per motivi di chiarezza visiva, trasformare i valori di correlazione finali sottraendo il valore di ciascun punto temporale da 1 per ottenere una curva esponenziale invertita come in ¹¹.

5. Analisi delle immagini: mappe vettoriali citoplasmatiche

NOTA: Le mappe vettoriali citoplasmatiche degli ovociti di topo sono state generate dal plug-in Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS)³⁰ precedentemente implementato per rilevare i flussi citoplasmatici negli ovociti di topo³¹ su Fiji ³² e disponibile su ³³. Le mappe mostrano la velocità del flusso citoplasmatico, l'ampiezza e la direzione, come in⁹ e¹¹.

1. Converti le immagini time-lapse in campo chiaro (Δt=0,5 s) in formato a 32 bit.
2. Riallinea le immagini con il plug-in Fiji StackReg in Plugins > StackReg e scegli la trasformazione Rigid Body .
3. Con lo stack di plugin sottrai media mobile jru v2 (negli strumenti Detrend della suite di plugin STICS), sbarazzati delle strutture stazionarie nel film sottraendo l'immagine media temporale del film. Le caselle di controllo Sottrai media statica e Output sub stack, selezionare Mantieni media spaziale e impostare il periodo su 5.
4. Disegna un ROI attorno all'ovocita, escludendo la corteccia per evitare gli effetti di confine del plugin.
5. Avvia il plug-in STICS map jru V2 (negli strumenti ICS), con una dimensione della sottoregione di 32 pixel, una dimensione del passo di 16 pixel, uno spostamento temporale STICS di 3, offset X e Y di 0, un moltiplicatore di velocità di 8, una soglia di magnitudine di 0 e caselle di controllo di Normalizza lunghezza vettoriale, Vettori centrali, Velocità di output e Usa maschera filmato.
   NOTA: Il plugin genera una mappa dell'ovocita in formato .tif, visualizzando i flussi citoplasmatici come vettori con colori che indicano le ampiezze del flusso, come in⁹ e¹¹, e un file excel con le velocità di flusso misurate.

6. Analisi dell'immagine: fluttuazioni del contorno nucleare

NOTA: Le fluttuazioni del contorno nucleare che riflettono l'agitazione della membrana nucleare possono essere determinate da filmati di nuclei marcati con YFP-Rango (Figura 4A,C). L'analisi delle immagini per le fluttuazioni del profilo nucleare richiede Fiji e l'installazione dei plug-in StackReg (abilitare il sito di aggiornamento BIG-EPFL²⁹ per ottenere l'accesso al plug-in StackReg), PureDenoise³⁴ e Ovocyte_nucleus. Il plug-in StackReg esegue la registrazione delle immagini per correggere eventuali movimenti globali. Il plugin PureDenoise rimuove il rumore delle immagini multidimensionali corrotte dal rumore misto Poisson-Gaussian e smussa il contorno nucleare. Il plugin Ovocyte_nucleus sommizza il segnale e riempie il buco corrispondente al nucleolo in modo da creare una maschera di nucleo binario, riallinearla con StackRreg e calcolare la distanza r dal baricentro della maschera del nucleo alla circonferenza della maschera per tutti gli angoli θ (θ° da 0° a 360° con incrementi di 1°), come nella Figura 4. Tutti i codici per questi plugin possono essere trovati a ³⁵.

1. Su Fiji, nel menu Plugins > CIRB > Verlhac , selezionare Ovocyte Nucleus Shape.
2. Nella finestra di dialogo, effettuare le seguenti operazioni.
   1. Selezionare la cartella contenente i filmati da analizzare.
   2. Selezionare l'angolo θ (si può scegliere un valore da 1° a 360° ed è stato utilizzato un valore di 1° per una risoluzione ottimale del contorno), i margini per il ritaglio (si consigliano 5 μm per mantenere l'intero nucleo).
   3. Selezionare la calibrazione XY e l'intervallo di tempo. Fare clic su OK.
      NOTA: I risultati vengono forniti come file .xls in una cartella out nella cartella contenente i filmati originali. Questo file visualizza tutti i raggi r misurati per ogni volta t e ogni angolo θ. Un esempio di file di output è fornito nella Tabella supplementare 1. La cartella out contiene anche un filmato della maschera del nucleo.
3. Utilizzando un foglio di calcolo, calcola il raggio medio R su tutti i punti temporali t per ogni angolo θ definito. Ciò consente di tracciare la forma media nel tempo (Figura 4B). Vedere l'esempio nella tabella supplementare 2.
4. Per ogni t e θ si sottrae il raggio medio R nel tempo dal raggio r. La varianza (r-R)² è una misura delle fluttuazioni dell'inviluppo nucleare.
5. Calcola la media delle fluttuazioni per tutti i punti temporali t e tutti gli angoli θ per ogni nucleo ed eventualmente per tutti i nuclei di una condizione.
   NOTA: Quando la forma dei nuclei è significativamente alterata, come nel caso di un citoscheletro alterato, i nuclei marcati con YFP-Rango vengono ruotati sulle Figi per orientare la parte liscia verso l'alto e l'invaginazione verso il basso, prima di procedere con l'analisi delle fluttuazioni del contorno nucleare, come in¹⁰.

7. Analisi delle immagini: Movimenti di speckle nucleari (dinamica diffusiva)

NOTA: L'analisi del movimento dello speckle nucleare permette di dedurre il tipo di dinamica (guidata, diffusiva o confinata) di quegli organelli dalle loro tracce.

1. Selezionare immagini in modalità flusso di ovociti che esprimono goccioline SRSF2-GFP che si muovono principalmente sull'asse X-Y.
2. Correggere lo sbiancamento di immagini time-lapse di ovociti che esprimono SRSF2-GFP utilizzando il metodo di corrispondenza dell'istogramma nelle Figi (Regolazione dell'immagine > > Correzione della candeggina).
3. Riallinea le immagini con il plug-in Fiji StackReg.
4. Traccia i centri delle goccioline SRSF2-GFP utilizzando il plug-in Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Premere Aggiungi traccia per avviare il tracciamento e premere Termina traccia al termine. Non attivare la correzione di centratura.
5. Copiare le tracce in un foglio di calcolo per procedere con i calcoli degli spostamenti quadratici medi temporali (MSD) come in ¹¹ e calcolare gli MSD temporali da ogni traiettoria di goccioline di 20 s.
6. Adatta le curve (msd(t) = beta x t^α) con il metodo di Nelder-Mead utilizzando il software R per stimare l'esponente di diffusione alfa (α).
7. Misurare il coefficiente di diffusione efficace per poter confrontare le diverse condizioni poiché la diffusione dovrebbe essere anomala (α< 1).
8. Calcolare il coefficiente di diffusione effettivo D_eff da un adattamento lineare (alfa=1) sui primi 40 punti (20 s) della curva MSD temporale e normalizzare in base alla dimensione delle goccioline (D_eff in μm²/s x 3/2 πr in μm).

8. Analisi dell'immagine: fluttuazioni della superficie della macchia nucleare

NOTA: L'evoluzione del contorno della macchia nucleare nel tempo, una lettura della trasmissione della forza attiva su questi organelli, è stata misurata con un plug-in personalizzato Radioak³⁶ per l'uso nelle Fiji e disponibile su³⁷. Il plugin estrae i valori dei raggi di una data selezione per tutti gli angoli intorno al centro della selezione. La variazione di forma nel tempo è stata misurata confrontando il valore del raggio rispetto al suo valore medio per ciascun angolo. Il plugin permette di quantificare le fluttuazioni di forma e offre un'opzione per visualizzare queste dinamiche. Per installarlo, scarica il file Radioak_.jar e inseriscilo nella cartella plugins di Fiji. Riavvia Fiji. Questo plugin è una versione aggiornata del plugin utilizzato per analizzare le fluttuazioni del profilo nucleare di cui sopra e implementare una pipeline comparabile.

1. Nei filmati di flusso di goccioline SRSF2-GFP, selezionare goccioline più grandi di dimensioni comparabili (raggio ~2,5 μm).
   NOTA: Se le goccioline sono troppo piccole, una risoluzione insufficiente porterà a misurazioni aberranti delle fluttuazioni superficiali.
2. Ritagliare le immagini time-lapse di goccioline che si estendono per 15 s (Δt= 0,5 s) disegnando un rettangolo attorno alla gocciolina e selezionare Immagine > Ritaglio (Figura 5).
3. Riallinea le immagini con il plug-in Fiji StackReg in Plugins > StackReg e scegli la trasformazione Corpo rigido .
4. Uniforma l'immagine per rimuovere il rumore intorno alla gocciolina utilizzando l'opzione Uniforma Fiji in Elabora.
5. Crea una maschera binaria di droplet utilizzando l'opzione Converti in maschera nelle Figi in Elabora > binario. Utilizzare il metodo predefinito e scuro per lo sfondo (Figura 5).
6. Analizza la maschera di goccioline binarie generata utilizzando l'opzione Analizza particelle nelle Figi in Analizza, seleziona le opzioni Cancella risultati e Aggiungi a Manager e salva la regione di interesse (ROI) in RoiManager (Altro > Salva) in formato zip per essere letto da Radioak. Le ROI devono essere salvate in una cartella chiamata contours nella stessa cartella dei filmati, in file chiamati imagename_UnetCortex.zip per ogni filmato che deve essere trovato da Radioak.
7. Nel menu Fiji Plugins > CIRB > Radioak , selezionare Get Radii per elaborare un solo filmato o Do One Folder per analizzare tutti i filmati della stessa cartella.
   NOTA: Viene visualizzata una finestra per selezionare il numero dell'angolo e la scala. Radioak è stato lanciato con incrementi di angolo di 1° da 0° a 360° (input di 360) e sono stati estratti i valori dei raggi.
8. Selezionare il filmato o la cartella contenente i filmati da analizzare. I risultati vengono forniti come file .xls (uno per ogni filmato) in una directory radioakres nella cartella contenente i filmati originali. Ogni file visualizza tutti i raggi r misurati (in μm se il parametro scala è stato compilato) per ogni tempo t (in sezione) e ogni angolo (in radianti; Figura 5; si veda l'esempio di .xls output nella tabella supplementare 3).
9. Nel foglio di calcolo, calcola il raggio medio R su tutti i punti temporali t per ogni angolo definito (vedi esempio nella Tabella supplementare 4). Questo permette di tracciare la forma media nel tempo.
10. Tracciare la varianza (r-R)² in μm² che corrisponde alla misura delle fluttuazioni della superficie delle goccioline.

Risultati

I pannelli di immagini nella Figura 3 mostrano esempi di un tipico ovocita completamente cresciuto (Figura 3A), il nucleoplasma in un ovocita completamente cresciuto che esprime YFP-Rango (Figura 3B), il nucleoplasma in un ovocita completamente cresciuto che esprime un corretto (pannello di sinistra; Figura 3C) o un eccessivo (pannello di destra; Figura 3C) dose di cRNA SRSF2-GFP e immunocolorazione di macchioline nucleari in un ovocita adulto utilizzando l'anticorpo SC35 (Figura 3D). La dose corretta di cRNA di SRSF2-GFP da microiniettare è stata definita sulla base di confronti visivi tra i profili di espressione di SRSF2-GFP con i profili endogeni delle macchioline nucleari.

Le forze di agitazione citoplasmatica negli ovociti, come dimostrato da precedenti lavori di laboratorio che utilizzano mappe vettoriali STICS e analisi di correlazione di immagini (vedi⁹ e¹¹), possono essere diminuite da perturbazioni del citoscheletro, sia genetiche (ad esempio, topo con mutazione FMN2) che chimiche (ad esempio, citocalasina D). Le mappe STICS degli ovociti di controllo mostrano numerosi vettori, con colori che indicano alte velocità di flusso, mentre le mappe di ovociti con forze citoscheletriche interrotte mostrano meno vettori, con colori che indicano basse velocità di flusso. Allo stesso modo, la correlazione delle immagini si perde molto velocemente negli ovociti di controllo rispetto agli ovociti con forze citoscheletriche interrotte. Ciò è osservabile sulle curve di correlazione, con una diminuzione più rapida della curva per gli ovociti di controllo rispetto agli ovociti con forze citoscheletriche interrotte⁹ o un aumento più rapido quando la curva è invertita¹¹.

Le forze del citoscheletro agitano il nucleo e i suoi organelli interni, in particolare i condensati nucleari come le macchioline nucleari^10,11. Nella Figura 4A, il nucleo degli ovociti di controllo è soggetto a importanti fluttuazioni periferiche, visibili utilizzando la sonda nucleare YFP-Rango. La forma del nucleo negli ovociti con forze citoscheletriche alterate è stabile nel tempo (Figura 4C). L'analisi delle fluttuazioni del profilo nucleare è fondamentale per quantificare con precisione l'agitazione. Determinando la varianza della distanza tra il centroide del nucleo e la sua periferia, (r-R)² (Figura 4B), è stato possibile quantificare le fluttuazioni, mostrando che l'agitazione nucleare è 6 volte superiore negli ovociti di controllo rispetto agli ovociti con forze citoscheletriche interrotte¹⁰. Nella Figura 5A-B, le macchioline nucleari (goccioline SRSF2-GFP⁺) sono mostrate in contesti di controllo e di interruzione delle forze citoplasmatiche ad alta risoluzione temporale. Nei controlli, la superficie delle goccioline fluttua significativamente di più rispetto alle superfici delle goccioline negli ovociti con forze citoplasmatiche interrotte, che possono essere visualizzate e quantificate utilizzando il plug-in Radioak³². Visivamente, i colori verde e rosso (output Radioak visibile nelle immagini in basso della Figura 5A-B) indicano gli angoli in cui il plugin ha rilevato cambiamenti di superficie tra immagini consecutive e il bianco indica una mancanza di cambiamenti di superficie.

Figura 1: Illustrazione dell'oogenesi tardiva del topo e dell'embriogenesi precoce. Illustrazione della centratura del nucleo che si verifica nella crescita tardiva dell'ovocita, della centratura del cromosoma che si verifica durante la divisione dell'ovocita e delle prime fasi (stadi a 1 cellula e a 2 cellule) dell'embriogenesi. I genomi femminili (nucleo ovocitario e pronucleo femminile) sono in rosa, il pronucleo maschile è in blu. I nuclei dell'embrione (dopo la fusione dei genomi parentali) sono viola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Illustrazione del rimodellamento citoplasmatico e nucleare su scale in ovociti di topo in crescita. Questa figura riassume i principali risultati di ^9,10,11. Illustrazione del rimodellamento del citoplasma basato sull'actomiosina, dell'agitazione nucleare e del rimodellamento funzionale del condensato biomolecolare nucleare su scale spazio-temporali. Il rimodellamento di squame incrociate di macchioline nucleari migliora le reazioni biomolecolari associate alla loro funzione (ad esempio, lo splicing del pre-mRNA). Si noti che questo protocollo consente la valutazione dell'agitazione nucleare solo su scale spaziali ma non temporali, poiché tutte le immagini sono fatte con la stessa risoluzione temporale di 0,5 s tra i fotogrammi dell'immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini campione dell'ovocita completamente cresciuto e del nucleoplasma. (A) Immagine in campo chiaro di un ovocita completamente cresciuto che mostra la cromatina (ciano) che circonda il nucleolo. Un cerchio bianco punteggiato delinea il nucleo. (B) Nucleo di ovociti vivi che esprimono YFP-Rango; Si noti l'assenza di fluorescenza nel nucleolo. (C) Esempio di nucleo di ovocita vivo che esprime SRSF2-GFP dopo microiniezione di dosi corrette di cRNA (pannello di sinistra) o alte dosi di cRNA (pannello di destra); Si notino le fasi condensata (gocciolina) e disciolta a sinistra e la loro assenza nella condizione a destra. (D) immunocolorazione a speckle nucleare in un ovocita fisso; si noti il profilo di espressione endogeno che è paragonabile a quello in C (pannello di sinistra). Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Uscite del plug-in di controllo e fluttuazioni del contorno nucleare interrotto. (A) Time-lapse di un nucleo di ovociti di controllo che esprime YFP-Rango (in alto) e la sua corrispondente maschera binaria generata dal plugin Ovocyte_nucleus (in basso). (B) Principio delle misure delle fluttuazioni di profilo nucleare nel tempo e in una data direzione. Le direzioni sono definite da un angolo di rotazione θ con incrementi di 1° da 0° a 360°. Sono rappresentate due forme rappresentative a t=0 s (giallo) e t=135 s (viola). La forma blu corrisponde alla forma media nel tempo. (C) Fluttuazioni del profilo nucleare di un nucleo in un ovocita con forze citoscheletriche ridotte a causa della rottura sia della F-actina (topo con mutazione FMN2) che dei microtubuli (trattamento con nocodazolo; come in¹⁰). Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Uscite plug-in di controllo e fluttuazioni della superficie delle goccioline interrotte. (A) Ritaglio di una gocciolina nucleare SRSF2-GFP di controllo ripresa a 500 ms per fotogramma e mostrata in Ice Look Up Table (LUT) (in alto); maschera binaria della stessa gocciolina generata dalle Figi (al centro); e il plug-in Radioak emette dopo l'analisi delle fluttuazioni superficiali della gocciolina (in basso), con il verde e il rosso che indicano gli angoli in cui il plug-in ha rilevato i cambiamenti della superficie tra immagini consecutive e il bianco che indica la mancanza di cambiamenti della superficie. (B) Fluttuazioni superficiali di una gocciolina nucleare in ovociti con forze citoscheletriche ridotte a causa della rottura sia della F-actina che dei microtubuli (come in¹¹). Barre di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Esempio di output dell'analisi di Ovocyte_nucleus plugin. Lo stesso nucleo analizzato di quello mostrato in Figura 4A. Theta (θ) è l'angolo in gradi e da t1 a t600 corrispondono al numero di fotogramma, che può essere convertito nel tempo. I raggi sono espressi in μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 2: Foglio di calcolo di esempio utilizzato per calcolare le fluttuazioni del profilo nucleare. Lo stesso nucleo analizzato di quello mostrato in Figura 4A. Theta (θ) è l'angolo in gradi e da t1 a t600 corrispondono al numero di fotogramma, che può essere convertito nel tempo. Scheda Grezzo e medio: i raggi sono espressi in μm. Scheda r-R: Le distanze r-R sono espresse in μm. Tabella (r-R)²: I valori di fluttuazione sono espressi in μm². Le tabulazioni x e y corrispondono alle coordinate cartesiane dei raggi della scheda Non elaborata e Media. Permettono di disegnare la forma media del nucleo nel tempo nella scheda della forma media. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 3: Esempio di output dell'analisi del plug-in Radioak. La stessa gocciolina analizzata come quella mostrata nella Figura 5A. Vengono visualizzati i raggi misurati in punti temporali e angoli distinti. I raggi sono espressi in μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 4: Foglio di calcolo di esempio utilizzato per calcolare le fluttuazioni della superficie delle goccioline nucleari. La stessa gocciolina analizzata come quella mostrata nella Figura 5A. Theta (θ) è l'angolo in gradi e da t1 a t600 corrispondono al numero di fotogramma, che può essere convertito nel tempo. Scheda Grezzo e medio: i raggi sono espressi in μm. Scheda r-R: Le distanze r-R sono espresse in μm. Tabella (r-R)²: I valori di fluttuazione sono espressi in μm². Le tabulazioni x e y corrispondono alle coordinate cartesiane dei raggi della scheda Raw e average. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

I passaggi chiave di questo protocollo includono una corretta microiniezione di ovociti senza compromettere la loro sopravvivenza o la loro normale funzione ^9,10,11, nonché la microiniezione di quantità predefinite di cRNA che consentirebbero la corretta visualizzazione di strutture rilevanti, come le macchioline nucleari.

Stabilire il legame tra la dinamica citoplasmatica e quella (intra)nucleare è essenziale quando si studia come il citoscheletro agita il nucleo o il suo interno. Questo protocollo, con lievi modifiche, permette di correlare l'intensità dell'agitazione citoplasmatica alla dinamica delle goccioline nucleari YFP-Rango o SRSF2-GFP (come in¹¹). Per procedere, gli ovociti devono essere prima filmati per 120 secondi in modalità campo chiaro per catturare l'agitazione citoplasmatica, prima di essere immediatamente filmati per 120 secondi con un laser a 491 nm per catturare il contorno nucleare o la dinamica delle goccioline. Nel caso di goccioline nucleari di SRSF2-GFP, la correlazione può essere valutata semplicemente confrontando i loro coefficienti di diffusione efficaci (vedere il punto 7 di questo protocollo) con i valori invertiti di intensità massima dell'agitazione citoplasmatica ottenuti utilizzando analisi di correlazione di immagini (vedere il punto 4 di questo protocollo). Un altro punto importante è la dimensione dei condensati scelti per l'analisi delle fluttuazioni della superficie delle goccioline. Le goccioline di diametro simile dovrebbero essere selezionate per le analisi comparative per evitare distorsioni, poiché le dimensioni modulano l'intensità delle fluttuazioni superficiali.

Ci sono alcune limitazioni per questo protocollo. Le analisi delle fluttuazioni del contorno nucleare si basano sulla colorazione intranucleare completa, come YFP-Rango o NLS-GFP. Per le analisi su macchioline nucleari, la microiniezione di quantità eccessive di cRNA SRSF2-GFP può portare ad apparenti alterazioni delle proprietà di separazione di fase di questo marcatore di condensato (Figura 3C), come precedentemente esaminato da altri²⁶. Verificare che i profili di espressione delle proteine esogene siano paragonabili a quelli endogeni è quindi fondamentale. Inoltre, goccioline relativamente piccole (raggio <2 μm) dovrebbero essere escluse dalle pipeline di analisi delle fluttuazioni superficiali a causa delle limitazioni della risoluzione spaziale con gli strumenti qui definiti. Questo problema di risoluzione può essere solitamente risolto con l'uso di microscopi più risolutivi che, ad esempio, potrebbero essere necessari per sondare le fluttuazioni superficiali di condensati più piccoli nel nucleo dell'ovocita o nel nucleo significativamente più piccolo delle cellule somatiche.

Nel complesso, questo protocollo consente la cattura dell'agitazione basata sull'actina e sul citoscheletro dei microtubuli del nucleo dell'ovocita di topo attraverso le scale. In particolare, consente di documentare la mobilizzazione del citoplasma basata sul citoscheletro, le fluttuazioni del contorno nucleare, insieme agli spostamenti di speckle nucleari simili a quelli liquidi e alle fluttuazioni superficiali. Sebbene alcuni studi in altri tipi cellulari affrontino alcuni di questi argomenti 38,39,40 attraverso protocolli distinti di varia complessità a scale spaziali individuali, questo semplice protocollo fornisce per la prima volta gli strumenti necessari per affrontare le dinamiche cellulari menzionate su più scale in un'unica pipeline di lavoro. Inoltre, i dati generati da questo approccio, se integrati con la modellazione biofisica come in^10,11, consentono una valutazione minimamente invasiva di: i) cambiamenti nella meccanica nucleare¹⁰; ii) la trasmissione delle forze attive basate sul citoscheletro nel citoplasma ai condensati nel nucleo¹¹; e iii) la dissipazione di questa energia attiva attraverso diversi compartimenti cellulari^10,11. È importante sottolineare che questo protocollo è versatile, in quanto può essere adattato non solo ad altri condensati nucleari come il nucleolo²³, ma anche ad altri tipi di cellule come le cellule tumorali, dove sono stati documentati cambiamenti nei comportamenti del condensato sia citoscheletrico che nucleare^17,41.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 disco rotante	Microscopio DMI6000B Yokogawa
	Microiniettore Leica
Femtojet	Eppendorf
Fiji
Ruota portafiltri	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Software Metamorph	Imaging universale,		versione 7.7.9.0
Olio minerale	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Topi Thermo Scientific
OF1 e C57BL/6	Kit
	Termo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	Kit QImaging
RNAeasy	Qiagen	74104
SC35 anticorpo	Abcam	ab11826	Anticorpo speckle nucleare; topo IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmide	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Micropipetta stripper	Soluzioni		specializzate per la raccolta di ovociti
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessaggio mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Camera termostatica	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows