Method Article

Stampa 3D a polimerizzazione a due fotoni di dispositivi di coltura cellulare neuronale su microscala

DOI:

10.3791/66142

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June 7th, 2024

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1Neuroscience Department, International School for Advanced Studies, 2Mathematics Department, International School for Advanced Studies

In This Article

Summary

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La stampa 3D su scala micrometrica consente la prototipazione rapida di dispositivi polimerici per colture cellulari neuronali. Come prova di principio, le connessioni strutturali tra i neuroni sono state vincolate creando barriere e canali che influenzano la crescita dei neuriti, mentre le conseguenze funzionali di tale manipolazione sono state osservate dall'elettrofisiologia extracellulare.

Abstract

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Le colture neuronali sono state un modello sperimentale di riferimento per diversi decenni. Tuttavia, mancano la disposizione delle cellule 3D, i vincoli spaziali sulla crescita dei neuriti e la connettività sinaptica realistica. Quest'ultimo limita lo studio della struttura e della funzione nel contesto della compartimentazione e diminuisce l'importanza delle culture nelle neuroscienze. Approssimare ex vivo la disposizione anatomica strutturata della connettività sinaptica non è banale, nonostante sia la chiave per l'emergere dei ritmi, della plasticità sinaptica e, in ultima analisi, della fisiopatologia cerebrale. Qui, la polimerizzazione a due fotoni (2PP) viene impiegata come tecnica di stampa 3D, consentendo la rapida fabbricazione di dispositivi di coltura cellulare polimerica utilizzando polidimetil-silossano (PDMS) su scala micrometrica. Rispetto alle tradizionali tecniche di stampaggio di repliche basate sulla microfotolitografia, la stampa su microscala 2PP consente di realizzare prototipi in modo rapido e conveniente. Questo protocollo illustra la progettazione e la fabbricazione di dispositivi microfluidici basati su PDMS finalizzati alla coltura di reti neuronali modulari. Come prova di principio, viene presentato un dispositivo a due camere per vincolare fisicamente la connettività. In particolare, una crescita assonale asimmetrica durante lo sviluppo ex vivo è favorita e può essere diretta da una camera all'altra. Al fine di sondare le conseguenze funzionali delle interazioni sinaptiche unidirezionali, vengono scelti array di microelettrodi commerciali per monitorare l'attività bioelettrica di moduli neuronali interconnessi. Qui, vengono illustrati i metodi per 1) fabbricare stampi con precisione micrometrica e 2) eseguire registrazioni extracellulari multisito in vitro in colture neuronali corticali di ratto. Diminuendo i costi e la futura accessibilità diffusa della stampa 3D 2PP, questo metodo diventerà sempre più rilevante nei laboratori di ricerca di tutto il mondo. Soprattutto nella neurotecnologia e nella registrazione di dati neurali ad alto rendimento, la facilità e la rapidità della prototipazione di modelli in vitro semplificati miglioreranno il controllo sperimentale e la comprensione teorica dei sistemi neurali in vivo su larga scala.

Introduction

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Lo studio dell'attività neuronale negli organismi comportamentali presenta diverse sfide. Ad esempio, l'accesso fisico al tessuto cerebrale è limitato dalla necessità di mantenerne l'integrità, quindi le regioni superficiali del cervello sono più facilmente considerate. Isolare bersagli specifici all'interno del tessuto intatto è spesso un compito arduo e talvolta impossibile. Sebbene le colture neuronali omogenee dissociate offrano un comodo accesso alle proprietà molecolari, biochimiche e biofisiche dei singoli componenti (sub)cellulari di un circuito neurale, si perde una connettività realistica e un'organizzazione anatomica del cervello intatto. Questi vincoli fondamentali hanno ispirato gli sforzi di ricerca per raggiungere una via di mezzo, in cui la complessità in vivo è evitata mentre la struttura può essere costruita in vitro, che è su richiesta 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . In particolare, le colture neuronali modulari sono state oggetto di ricerche approfondite negli ultimi decenni, con l'obiettivo di affrontare le questioni chiave della fisiologia del cervello come descritto di seguito.

Organizzazione: Studi in vivo mostrano che il cervello è strutturato anatomicamente in strati con precisi tipi di cellule e matrici di proiezioni. I saggi funzionali hanno rivelato l'organizzazione delle reti neuronali in assiemi e moduli di nodi, con precisi schemi di connettività10,11. Il ruolo della connettività e dei motivi microcircuitali, tuttavia, non può essere studiato adeguatamente in vivo a causa dell'enorme numero di sinapsi coinvolte, nonché degli effetti intrecciati dello sviluppo e della plasticità dipendente dall'attività.

Trasferimento del segnale: In colture in vivo o casuali in vitro , è difficile valutare il trasferimento del segnale. L'esame della conduzione assonale e del potenziale d'azione lungo la sua lunghezza richiede di guidare la crescita dei neuriti mediante la funzionalizzazione superficiale o il patterning chimico, fornendo un elevato rapporto segnale-rumore nelle letture extracellulari dell'attività elettrica12.

Rilevanza traslazionale: Decifrare il ruolo esclusivo degli elementi pre- e post-sinaptici in condizioni patologiche richiede l'accesso a questi elementi individualmente. Le colture modulari con connettività vincolata, che segregano efficacemente gli elementi pre e post-sinaptici, sono strumenti indispensabili a questo scopo13.

Esistono diversi metodi per ottenere una qualche forma di struttura nella coltura neuronale. Possono essere ampiamente classificati come manipolazione chimica e fisica delle superfici9. I primi metodi 14,15 si basano sulla propensione delle cellule neuronali ad attaccarsi a determinati composti (bio)chimici. Ciò richiede il deposito di adesivo o molecole attraenti su una superficie con precisione su microscala e seguendo uno schema dettagliato. Mentre questo consente una copertura parziale della superficie delle cellule, seguendo il modello desiderato, i metodi chimici sono intrinsecamente limitati e hanno un tasso di successo relativamente basso nella guida alla crescita dei neuriti16. Il pieno controllo sulla direzionalità degli assoni richiede la definizione di un gradiente spaziale di sostanze chimiche ad-hoc per modellare la guida assonale17. Questi ultimi metodi comportano la manipolazione fisica della superficie e sono più comunemente usati per strutturare le reti neuronali in vitro. Le cellule neuronali sono fisicamente vincolate nei punti desiderati da confinamenti geometrici, come camere microscopiche, pareti, canali, ecc., modellando un polimero biocompatibile come il polidimetilsilossano (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 polimerizzato e solidificato in un dispositivo microfluidico. Il metodo de facto per la fabbricazione microfluidica PDMS è la fotolitografia morbida21, in cui una maschera bidimensionale viene modellata su microscala e impiegata per incidere selettivamente un materiale a base di silicio dopo l'esposizione ai raggi UV. In poche parole, una resina polimerizzabile ai raggi UV (cioè fotoresist) viene rivestita su un wafer di silicio attraverso lo spin-coating, raggiungendo un'altezza specifica determinata dalla sua viscosità e velocità di rotazione. Quindi, la maschera modellata viene posizionata sopra il fotoresist ed esposta alla luce UV. Le aree trasparenti all'interno della maschera, corrispondenti alle regioni di interesse, consentiranno alla luce UV di indurre reticolazione localizzata delle molecole di fotoresist. Le aree di fotoresist non esposte vengono lavate via con un solvente, con conseguente formazione di uno stampo principale. Questo viene ripetutamente utilizzato per cuocere un elastomero a scelta (ad esempio, PDMS), che viene poi inciso con le geometrie desiderate in tutte le repliche desiderate. Tale metodo di fabbricazione è il metodo più comune per fabbricare dispositivi microfluidici22. Forse i principali limiti della fotolitografia morbida sono il prerequisito di un notevole investimento di capitale e la scarsa familiarità dei laboratori biologici con le tecniche e le competenze richieste. La preparazione della maschera e le fasi di fotolitografia morbida necessarie per progettare geometrie complesse ad altezza multipla e ad alto rapporto d'aspetto non sono banali23 e spesso richiedono l'outsourcing. Anche se sono stati proposti metodi alternativi e a basso budget, non sempre soddisfano i requisiti di alta precisione della prototipazione biologica24.

Qui, viene presentato un metodo di produzione alternativo, che si basa sulla polimerizzazione a due fotoni (2PP) e sulla produzione additiva. È semplice e non richiede di per sé competenze avanzate di microfabbricazione e microfotolitografia. Il campo di ricerca della microfabbricazione di 2PP è emerso alla fine degli anni '9025 e da allora ha assistito a una crescita esponenziale26. Maggiori informazioni sui principi fondamentali di questa tecnica possono essere trovate altrove26. In breve, focalizzando l'impulso di luce di eccitazione nello spazio tridimensionale, 2PP sfrutta la dipendenza non lineare dell'assorbimento multifotone dall'intensità. Ciò garantisce la capacità di assorbimento confinato, garantendo un'eccitazione precisa e selettiva all'interno di regioni molto localizzate. In sostanza, un fotoresist a toni negativi, un materiale con una solubilità ridotta in seguito all'esposizione alla luce, è sottoposto a un fascio focalizzato di impulsi laser a femtosecondi a un basso ciclo di lavoro27. Ciò consente impulsi con intensità elevate a basse potenze medie, consentendo la polimerizzazione senza danneggiare il materiale. L'interazione di monomeri radicali fotoindotti dà origine a oligomeri radicalici, dando inizio a una polimerizzazione che si estende in tutto il fotoresist fino a un volume distinto, cioè voxel, la cui dimensione dipende dall'intensità e dalla durata degli impulsi laser28.

In questo lavoro, vengono presentate due componenti: A) la progettazione e la fabbricazione rapida di uno stampo stampato in 3D, riutilizzabile molte volte per produrre dispositivi di coltura cellulare neuronale polimerica monouso (Figura 1), e B) il loro accoppiamento meccanico sulla superficie di substrati planari di colture cellulari neuronali, o anche di array di microelettrodi integrati nel substrato in grado di registrazioni multisito di segnali bioelettrici.

La progettazione assistita da computer di un modello meccanico 3D è descritta molto brevemente qui e accompagnata dai passaggi che portano a uno stampo stampato in 3D e alla fabbricazione di dispositivi PDMS è anche dettagliata.

È possibile utilizzare una varietà di applicazioni software di progettazione assistita da computer per generare il modello di oggetto 3D di partenza e produrre un file STL per controllare il processo di stampa 2PP. All'interno della Tabella dei Materiali, la prima e l'ultima applicazione elencate sono gratuite o fornite con una licenza gratuita. La costruzione di un modello 3D richiede sempre la creazione di uno schizzo 2D, che viene poi estruso nelle successive fasi di modellazione. Per dimostrare questo concetto, un generico processo di progettazione di software CAD 3D è evidenziato nella sezione del protocollo, che porta a una struttura composta da cubi sovrapposti. Per informazioni più complete, sono disponibili una serie di tutorial online e risorse di formazione gratuite, come indicato nella Tabella dei materiali.

Il file STL risultante viene quindi tradotto in una serie di comandi che devono essere eseguiti dalla stampante 3D (ad esempio, la procedura di slicing). Per la specifica stampante 3D 2PP in uso, il software DeScribe viene utilizzato per importare il file STL e convertirlo nel formato proprietario General Writing Language (GWL). Il successo del processo di stampa 2PP dipende da vari parametri, in particolare la potenza del laser e la sua velocità di scansione, la cucitura e le distanze di tratteggio-affettatura. La scelta di questi parametri, insieme alla scelta dell'obiettivo e del fotoresist, dipende dalle caratteristiche più piccole del progetto, nonché dall'applicazione prevista. Pertanto, l'ottimizzazione dei parametri diventa essenziale per soddisfare i requisiti di diversi scenari di progettazione e casi d'uso. Per questo lavoro, la ricetta consigliata IP-S 25x ITO Shell (3D MF) è stata considerata come configurazione per i parametri di stampa. In definitiva, una parte stampata meccanicamente stabile viene stampata con la risoluzione necessaria, riducendo al minimo il tempo di stampa 3D.

Il progetto dello stampo e il relativo file STL, dimostrato in questo lavoro, comprendono un telaio quadrato per separare lo spazio di una coltura cellulare in due compartimenti: un'area esterna (ad esempio, denominata Source in seguito) e un'area interna (ad esempio, denominata Target successivamente). Questi due compartimenti sono collegati attraverso insiemi di microcanali, ciascuno caratterizzato da bordi ad angolo acuto, progettati per ostacolare specificamente la crescita dei neuriti dal Target alla Sorgente, ma non viceversa, e come tali promuovere una connettività sinaptica direzionale tra i neuroni che crescono sulle due aree.

Studi precedenti hanno impiegato diverse geometrie di microcanali per incoraggiare la crescita direzionale dei neuriti. Gli esempi includono le forme triangolari18, le strutture spinate a canale19 e i canali rastremati20. Qui viene utilizzato un design caratterizzato da barriere ad angolo acuto lungo i bordi del microcanale, caratterizzato anche da ingressi asimmetrici. Questi microcanali servono a stabilire una continuità tra un interno chiuso, il compartimento Target, e l'area esterna, il compartimento Source. La forma ad imbuto della parte iniziale dei microcanali, dal lato Sorgente, è progettata per favorire la formazione di fasci assonali e la loro crescita lungo il percorso più breve, cioè rettilineo, che collega la Sorgente al Target. Lo spazio triangolare realizzato affrontando angoli acuti ha un volume maggiore sul lato del bersaglio per mirare a ritardare efficacemente il pathfinding dei neuriti favorendo il rapido sparo di fasci provenienti dalla Sorgente e l'occupazione dello spazio disponibile. La scelta di 540 μm per la lunghezza dei microcanali filtra efficacemente la crescita dendritica generalmente più corta39. Inoltre, la loro altezza di 5 μm impedisce ai somata cellulari di penetrare attraverso i microcanali. Nel complesso, questa configurazione ha dimostrato di promuovere la connettività unidirezionale tra i moduli di destinazione esterni di origine e interni ed è presentata qui come una prova di principio tra le molte scelte alternative.

Mentre i dispositivi PDMS, fabbricati con lo stampo 2PP, possono essere fissati alla superficie di comuni substrati di coltura cellulare, come vetrini coprioggetti o piastre di Petri, in questo lavoro sono stati utilizzati array di microelettrodi integrati nel substrato disponibili in commercio. Non è stato fatto alcuno sforzo per ottimizzare il design 3D in base al layout dell'array di microelettrodi e l'accoppiamento meccanico è stato eseguito sotto la guida della stereomicroscopia con l'obiettivo di posizionare il dispositivo attraverso l'array, lasciando alcuni microelettrodi scoperti su entrambi i lati, la sorgente e il target. Ciò consente la valutazione preliminare delle conseguenze funzionali della connettività vincolata nelle colture cellulari neuronali.

Protocol

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Tutte le procedure di movimentazione degli animali sono state eseguite in conformità alle leggi europee e italiane (Direttiva del Parlamento Europeo e del Consiglio del 22 settembre 2010 [2010/63/UE]; Decreto del Governo 4 marzo 2014, n. 26), sono stati esplicitamente approvati dall'OpBA (Comitato per la Cura degli Animali) presso la Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati e sono stati ufficialmente autorizzati dal Ministero della Salute (Autorizzazione n. 22DAB. N.UVD). Ciò ha portato alla disponibilità di materiale non senziente dal tessuto cerebrale di ratto espiantato, da utilizzare per la validazione sperimentale del metodo presentato in questo lavoro.

1. 3D fabbricazione di stampi mediante polimerizzazione a due fotoni

  1. Generazione dei file CAD
    NOTA: I seguenti passaggi illustrano un flusso di lavoro di progettazione 3D generico, utilizzando un software di progettazione assistita da computer (ad esempio, SolidWorks). Il file di progettazione STL di esempio descritto in questo lavoro (Figura 2) è disponibile come file di codifica supplementare 1, nonché tramite Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).
    1. Avviare l'applicazione desktop del software di progettazione assistita da computer. Dalla barra dei menu in alto, seleziona Nuovo.
    2. Dalle opzioni, scegliere Parte: una rappresentazione 3D di un singolo componente di progettazione. Premere la combinazione di tasti Ctrl + 5 per impostare la vista dall'alto dello schizzo.
    3. Dal pannello laterale, selezionare Schizzo e scegliere Rettangolo d'angolo. Selezionare un bordo del rettangolo facendo clic su di esso. Quando viene visualizzato un pannello dei parametri, impostare la lunghezza su 100 unità.
    4. Ripetere il passaggio 1.1.3 per lo spigolo perpendicolare al precedente: impostarne la lunghezza a 50 unità. Selezionare il rettangolo trascinandolo su di esso tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse.
    5. Dal menu Aggiungi relazione , selezionare Fissa per vincolare le relazioni tra le linee.
    6. Uscire dallo schizzo e ripetere i passaggi da 1.1.3 a 1.1.5, creando un nuovo rettangolo (più piccolo) che si sovrappone allo schizzo precedente.
    7. Dal pannello laterale, selezionare Funzioni e scegliere Estrusione/Base: impostare la profondità dei rettangoli grande e piccolo rispettivamente a 5 e 10 unità.
    8. Dal menu File , salvare la parte in formato STL (ad esempio, Standard Tassellation Language).
  2. Elaborazione dei file CAD
    1. Trasferire il file STL su un personal computer, dotato del software applicativo DeScribe.
    2. Avvia Descrivi e dal menu File, apri il file STL. Apparirà una rappresentazione 3D del modello.
    3. Dalla sezione di orientamento nel menu a destra, ruotare il modello per orientarlo in modo appropriato nello spazio e centrarlo nel piano.
    4. Regolare il ridimensionamento generale selezionando la sezione Ridimensionamento del menu a destra.
    5. Dal menu a discesa in alto, selezionare la ricetta IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Questo specifica IP-S come fotoresist, 25x per il potere di ingrandimento dell'obiettivo, substrato rivestito di ossido di indio-stagno (ITO) come substrato di stampa e stampa a guscio e scaffold come modalità operativa con caratteristiche di medie dimensioni (MF).
    6. Navigare attraverso la procedura guidata, selezionando e impostando Distanza di sezionamento su 1 μm e Distanza di tratteggio su 0,5 μm sia per il guscio che per l'impalcatura.
    7. Nella fase di output della procedura guidata di importazione, in suddivisione, definire la dimensione del blocco come X = 200 μm, Y = 200 μm e Z = 265 μm e l'offset del blocco come X = 133 μm, Y = 133 μm e Z = 0, assicurandosi che le delicate strutture dei microcanali non siano influenzate dalle linee di cucitura.
    8. Come modalità di scansione, utilizzare l'impostazione predefinita: Galvo per il piano X-Y e Piezo per l'asse Z.
    9. Premere Salva e, nel menu testuale successivo, sostituire la riga var $baseLaserPower = $shellLaserPower con var $baseLaserPower = 75, per ridurre al 75% la potenza laser nello strato più basso della stampa.
    10. Trasferisci i file GWL ottenuti con i passaggi precedenti nella workstation dedicata alla stampa 3D 2PP.
  3. Stampa 3D e sviluppo campioni
    1. Avviare il software applicativo NanoWrite . Dopo l'inizializzazione della stampante, fare clic su Exchange Holder sull'interfaccia del software, per inserire il supporto del supporto di supporto e montare l'obiettivo.
    2. Montare l'obiettivo 25x nella posizione appropriata sul nasello. Identificare quale lato del substrato di vetro è rivestito con ITO, tramite un multimetro elettronico impostato per misurare le resistenze: la lettura dovrebbe essere valori bassi, come 100-300 Ω, ma solo per il lato rivestito di ITO.
    3. Posizionare il substrato di vetro sul supporto, orientando il lato rivestito in ITO verso l'alto. Usa del nastro adesivo per tenerlo saldamente in posizione.
    4. Sotto la cappa chimica, applicare una goccia di fotoresist IP-S al centro del substrato di vetro.
    5. Inserire il supporto nella stampante 3D, con la goccia di resina rivolta verso l'obiettivo (cioè verso il basso).
    6. Tramite il menu File del software, caricare i file GWL. Selezionare Approach Sample (Avvicina campione) per avvicinare l'obiettivo alla goccia di resina.
    7. Selezionare Trova interfaccia per consentire il rilevamento dell'interfaccia di stampa ITO-fotoresist, in base alla differenza dell'indice di rifrazione dei due materiali.
    8. Selezionare Avvia processo per avviare la stampa. Al termine della stampa, premere Exchange Holder per recuperare il supporto.
    9. Recupera il supporto e rimuovi delicatamente il supporto con la parte stampata. Immergere il substrato di vetro in acetato di etere metilico di glicole propilenico (PGMEA) per 20 minuti sotto la cappa aspirante, per sviluppare la parte stampata.
    10. Rimuovere il substrato dal PGMEA e immergerlo nell'isopropanolo per 5 minuti. Lasciare asciugare la parte stampata all'aria, sotto la cappa chimica.
  4. Trattamento post-stampa e montaggio stampo
    1. Polimerizzare la parte stampata mediante esposizione alla luce UV (ad es. 365-405 nm) con una potenza sufficiente per 5-20 minuti (vedere la discussione per i dettagli sull'alimentazione).
    2. Sotto una cappa a flusso laminare, rimuovere delicatamente la parte stampata dal substrato di vetro. Far cadere ~2 μL di resina sul fondo di una capsula di Petri da 35 mm x 10 mm.
    3. Posiziona con cura la parte stampata sopra la goccia e lascia che la resina scorra sotto la parte. Polimerizzare ulteriormente la parte stampata mediante esposizione alla luce UV, per 5 min.
    4. Coprire la capsula di Petri con il suo tappo e trasferirla in forno per la polimerizzazione a caldo, per 30 minuti a 80 °C. Non preriscaldare il forno per evitare deformazioni o fratture della parte stampata. Dopo l'indurimento, la parte stampata verrà fissata in modo permanente al fondo della capsula di Petri. D'ora in poi, la parte stampata e montata sarà indicata come stampo.

2. Fabbricazione del dispositivo PDMS dallo stampo e dai substrati di coltura cellulare

  1. Fabbricazione di dispositivi PDMS
    1. Preparare 20 mL di miscela 10:1 (rapporto peso) della base edell'agente indurente del PDMS non polimerizzato. Per ogni dispositivo, e a seconda dell'altezza richiesta, sono sufficienti 1-2 mL di miscela PDMS. Conservare il PDMS non polimerizzato in eccesso a -20 °C per un uso successivo.
    2. Sotto una cappa a flusso laminare, mescolare accuratamente il composto per 4 minuti. Poiché la miscela intrappola le bolle d'aria in modo uniforme, diventerà opaca.
    3. Trasferire la miscela in una provetta da 50 μL e centrifugarla a 168 x g per 5 minuti, per eliminare le bolle d'aria dalla miscela e ottenere un aspetto chiaro.
    4. Trattare lo stampo con 10 μL di agente idrofobico (es. Repel-silano ES) e lasciarlo riposare per 7 minuti, garantendo un distacco graduale del PDMS polimerizzato dallo stampo in un secondo momento.
    5. Sciacquare lo stampo 1x con etanolo al 70% e 2x con acqua deionizzata (DI). Lasciare asciugare lo stampo all'aria sotto la cappa a flusso laminare.
    6. Versare delicatamente la miscela PDMS sullo stampo, fino a raggiungere l'altezza finale prevista del dispositivo. Per evitare la formazione di bolle d'aria, versare il composto delicatamente e da vicino alla superficie dello stampo.
    7. Coprite lo stampo e trasferitelo per 18 minuti in forno preriscaldato e stabilizzato a 80 °C, per la stagionatura. Per apparecchi di altezza superiore a 5 mm e fino a 1 cm, prolungare il tempo di polimerizzazione da 18 a 25 min.
    8. Sotto la cappa a flusso laminare, staccare delicatamente il blocco PDMS polimerizzato dallo stampo e immergerlo in isopropanolo per almeno 10 minuti, all'interno di una capsula di Petri in vetro. L'isopropanolo elimina il PDMS non reticolato. Tenere sempre coperto il blocco PDMS.
    9. Rinnovare l'isopropanolo e, al microscopio stereoscopico, ritagliare con cura la sezione quadrata centrale del dispositivo (identificata come l'area target, in questo lavoro) con un coltello oftalmico. Quindi, procedi a tagliare ulteriormente lungo i bordi per ottenere la forma definitiva del dispositivo.
    10. Recuperare il dispositivo dall'isopropanolo e immergerlo in etanolo per 30 minuti, quindi risciacquarlo 3 volte con acqua deionizzata sterile. Mantenere la sterilità da questo punto in poi.
    11. Sotto una cappa a flusso laminare, trasferire il dispositivo in una nuova capsula di Petri, lasciando il tappo leggermente aperto. Lasciare asciugare completamente all'aria.
  2. Montaggio del dispositivo e preparazione dei substrati di coltura cellulare.
    1. Sterilizzare ogni array di microelettrodi (MEA) immergendolo in etanolo al 70% per 30 minuti, quindi risciacquarlo 3 volte con acqua deionizzata sterile.
    2. Utilizzando una pinzetta fine sterile, sotto una cappa a flusso laminare e uno stereomicroscopio, montare il dispositivo PDMS sull'area interna di un MEA. Allineare un lato del dispositivo PDMS al centro dell'area MEA interna, con microelettrodi integrati nel substrato, in modo che pochi microelettrodi rimangano scoperti sia dall'area di origine che da quella di destinazione (vedere la Figura 2).
      NOTA: Per questo lavoro, non è necessario allineare i microelettrodi MEA al microcanale del dispositivo PDMS. Potrebbe essere necessaria una leggera pressione sul dispositivo per ottenere una tenuta ermetica tra il dispositivo PDMS e la superficie MEA. Evitare a tutti i costi di toccare i microelettrodi con la punta delle pinzette.
    3. Inserire il dispositivo MEA con PDMS su di esso nella camera di pulizia del plasma, per attivare l'attivazione superficiale tramite plasma ad aria. Iniziare il processo con un'evacuazione della camera con la pompa a vuoto di 4 minuti. Quindi, aprire leggermente la valvola dell'aria per consentire uno spurgo controllato dell'aria. Chiudere la valvola dell'aria e accendere gli induttori al plasma, regolando il livello di potenza RF tra 10 W e 18 W.
    4. Una volta visualizzata una luce luminosa, lasciare che il processo venga eseguito per 80 secondi. Quindi, spegnere l'induttore al plasma, chiudere la valvola della pompa del vuoto e aprire delicatamente la valvola dell'aria. Aprire la camera per recuperare il MEA.
      NOTA: Se il trattamento al plasma prevede l'esposizione di MEA a un ambiente non sterile, posizionare ciascun MEA sotto la luce UV in una cappa a flusso laminare per 30 minuti, per garantire la sterilità.
    5. Aggiungere 1 mL di soluzione di polietilenimmina (PEI) allo 0,1% in peso/volume al MEA e incubarlo a 37 °C per una notte. Aspirare la soluzione PEI e risciacquare con acqua sterile deionizzata 5 volte. Aggiungere 1 mL del terreno di coltura cellulare al MEA e incubarlo prima della semina cellulare.

3. Coltura cellulare neuronale ed elettrofisiologia

  1. Preparare in anticipo il mezzo di dissezione, la soluzione di digestione e le soluzioni 1-3 (vedere Tabella 1).
  2. Coltura cellulare neuronale dissociata.
    1. Afferra delicatamente un cucciolo di ratto Wistar neonatale di 0-1 giorni per il muso ed esegui una rapida decapitazione usando un paio di forbici affilate.
    2. Staccare la pelle del cuoio capelluto, praticare un'incisione lungo la linea mediana sagittale del cranio usando delle forbici sottili, quindi creare un taglio coronale attraverso il cranio all'incrocio del cervelletto.
    3. Rimuovere il cranio, estrarre il cervello con una spatola fine e trasferirlo in un terreno di dissezione freddo (4 °C).
    4. Rimuovere il tessuto sottocorticale, l'ippocampo e le meningi. Tritare il tessuto in piccoli pezzi (cioè 1-2 mm3) e trasferirli in una provetta da 15 ml. Eliminare la soluzione e sciacquare il tessuto utilizzando un terreno di dissezione fresco, seguito da un lavaggio con mezzo di digestione.
    5. Scartare il terreno di digestione, quindi aggiungere 1 mL di soluzione 1. Incubare la miscela a 37 °C per 5 min. Scartare la soluzione 1 e sciacquare il tessuto con un mezzo di dissezione fresco. Aggiungere quindi 1 mL della soluzione 2 e conservare la miscela per 10 minuti a 4 °C.
    6. Scartare la soluzione 2 e risciacquare il tessuto con un mezzo di dissezione fresco. Quindi aggiungere 1 mL della soluzione 3. Dissociare meccanicamente le cellule pipettando lentamente la soluzione su e giù per 20-30 volte. Quando appare una miscela uniformemente torbida di cellule dissociate, aumentarne il volume a 3 ml aggiungendo il mezzo di dissezione.
    7. Raccogliere il pellet cellulare centrifugando la miscela a 100 x g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura preriscaldato.
    8. Contare le cellule (cioè da una camera di conteggio delle cellule) e regolare di conseguenza la densità della soluzione di semina cellulare.
    9. Seminare ogni MEA con 1 mL di soluzione di semina con la densità nominale delle celle di 1,8 x 106 (~ 6500 cellule/mm2). Incubare i MEA seminati in un'incubatrice umida a 37 °C e al 5% di CO2 . Sostituire il terreno di coltura con terreno di coltura fresco (cioè prodotto settimanalmente) ogni 2 giorni.
  3. Elettrofisiologia extracellulare
    NOTA: Le colture di cellule neuronali dissociate raggiungono un fenotipo elettrico completamente maturo dopo 2-3 settimane in vitro. Le sezioni seguenti descrivono un protocollo di stimolazione extracellulare che utilizza un software applicativo MEA commerciale (Experimenter) per stimolare elettricamente una delle popolazioni neuronali coltivate in moduli, cioè Source o Target, registrando contemporaneamente l'attività di entrambe le popolazioni, in reti mature.
    1. Montare delicatamente un MEA all'interno dello stadio di testa dell'amplificatore elettronico multicanale, all'interno di un incubatore a secco (37 °C, 5% CO2 ) e lasciarlo alloggiare per 10 minuti. Un tappo PDMS personalizzato può essere fabbricato separatamente e utilizzato come copertura ermetica per ogni MEA, per ridurre l'evaporazione dell'acqua e mantenere la sterilità.
    2. Avvia il software Experimenter. Impostare la frequenza di campionamento a 25 kHz e avviare l'acquisizione dei dati premendo Start DAQ. Nel pannello Visualizzazione dati, vengono visualizzate le tracce grezze dell'attività registrata extracellulare per ciascun canale.
    3. Monitora l'attività spontanea e identifica visivamente e seleziona 3 coppie di microelettrodi vicini che sono attivi durante i burst di burst di attività sincronizzate spontanee a livello di rete, sia dal lato sorgente che da quello di destinazione.
    4. Nel pannello dello stimolatore del software, configurare i parametri per ciascuna delle coppie di microelettrodi stimolanti in configurazione bipolare: selezionare una forma d'onda dell'impulso bifasico e impostare le ampiezze di picco a ± 800 mV e la durata dell'impulso a 200 μs.
    5. Impostare il registratore e registrare per un periodo da 300 ms prima a 1000 ms dopo la stimolazione.
    6. Ripetere i passaggi da 3.3.3 a 3.3.5 per il lato Sorgente e Destinazione in modo interlacciato per il numero di ripetizioni richiesto.

Results

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La fabbricazione di un dispositivo di coltura cellulare polimerica (neuronale) a 2 compartimenti è riportata qui, esemplificando l'uso della stampa 3D 2PP per la prototipazione rapida di dispositivi PDMS. In particolare, viene prodotto un dispositivo per reti neuronali modulari con connettività sinaptica unidirezionale e la sua caratterizzazione funzionale viene presentata in termini di elettrofisiologia extracellulare multisito. In breve, è stato realizzato uno stampo in scala micrometrica mediante scrittura laser diretta, utilizzando una stampante 3D disponibile in commercio. In particolare, la stampante eroga una potenza di 50 mW attraverso impulsi laser con lunghezza d'onda centrale di 780 nm e una durata da 80 a 100 fs. Durante il processo di fabbricazione, il raggio laser viene focalizzato attraverso l'obiettivo (25x, NA=0,8) della stampante sul fotoresist a toni negativi (IP-S) per scansionare il volume di stampa utilizzando lo scanner galvo per gli assi x e y e il tavolino piezoelettrico per l'asse z. Il volume di stampa è stato opportunamente suddiviso in blocchi di 200 mm x 200 mm x 265 mm per realizzare uno stampo con dimensioni complessive di 6500 mm x 6500 mm x 545 mm e volume nominale di 12.423 mL. La Figura 2A rappresenta uno schizzo 2D dello stampo, evidenziandone le dimensioni e le dimensioni delle caratteristiche, mentre la Figura 2B mostra una foto ravvicinata del dispositivo finito montato su un MEA. Gli stampi preparati come descritto nella sezione precedente erano durevoli e potevano essere riutilizzati più di 50 volte per fabbricare dispositivi PDMS.

Lo stampo stampato è stato utilizzato per la fusione del dispositivo PDMS, che è stato poi montato sull'area interna di array integrati vetro-substrato di array di microelettrodi (MEA), da utilizzare per registrazioni extracellulari multisito dell'attività elettrica neuronale e come prova di principio. I MEA commerciali integrati nel substrato sono stati utilizzati per monitorare l'attività delle colture modulari in risposta a stimoli elettrici localizzati nello spazio forniti extracellulari da un sottoinsieme di microelecrodi situati in ciascun compartimento di coltura. Ogni MEA contiene 120 microelettrodi al nitrato di titanio (TiN) con un diametro di 30 μm e un passo interelettrodico di 100 μm. La Figura 2C-D mostra il posizionamento del dispositivo PDMS sulla parte superiore del MEA. Le caratteristiche geometriche dei singoli microcanali del dispositivo, insieme all'ingombro complessivo della camera mostrato nella Figura 2C, portano a una compartimentazione dei neuroni in coltura. Questi possono essere distinti in base al vano a cui appartengono, nell'area esterna (Source) del dispositivo o nell'area interna (Target) del dispositivo. La guida assonale preferita, limitata dalla sorgente alla destinazione, è dettata dai bordi ad angolo vivo dei microcanali. La Figura 2D mostra il posizionamento del dispositivo polimerico sul MEA e l'area di copertura relativa degli elettrodi di registrazione situati all'interno dei compartimenti Source o Target. Si noti che un allineamento preciso dell'interno dei microcanali del dispositivo a una o più file di microelettrodi MEA non è stato né richiesto né perseguito per il nostro caso di studio.

L'evidenza rappresentativa della crescita asimmetrica dei neuriti è fornita nella Figura 3, durante lo sviluppo ex vivo, che mostra neuriti marcati con fluorescenza nell'imaging dal vivo, 6 giorni (Figura 3A) e 2 giorni dopo la placcatura cellulare (Figura 3B-D). Mentre i neuriti sul lato Target del dispositivo incontravano barriere ad angolo acuto come ostacoli che impedivano la loro progressione nello spazio, i neuriti provenienti dal lato Source crescevano ininterrottamente e attraversavano i canali. Questa asimmetria favorisce una connessione assonale unidirezionale tra i neuroni nei due compartimenti, proiettando dalla sorgente alla destinazione, come esplicitamente previsto dal progetto. Questo risultato è ulteriormente supportato da una valutazione elettrofisiologica (funzionale) delle risposte elettriche evocate da stimoli erogati alternativamente in ciascuno dei due compartimenti.

Dopo 3-4 settimane in vitro, quando le reti neuronali hanno raggiunto la piena maturità29,30, la connettività funzionale attraverso i due compartimenti ha potuto essere sondata fornendo brevi stimoli elettrici e monitorando le risposte neuronali che hanno evocato31. Impulsi elettrici bifasici con un'ampiezza di 800 mV sono stati quindi applicati alternativamente solo alla Sorgente o solo alle popolazioni Target (N ripetizioni = 150, N colture modulari = 6), erogati da 3 coppie giustapposte di microelettrodi planari in configurazione bipolare, e in modo interlacciato. Pertanto, le 3 coppie di elettrodi potrebbero trovarsi all'interno dell'area sorgente del MEA o all'interno dell'area target del MEA. Le risposte elettriche evocate da ogni stimolo potrebbero quindi essere rilevate da tutti i microelettrodi MEA dopo un ritardo di propagazione. Le registrazioni sono state eseguite con una frequenza di campionamento di 25 kHz/canale e i segnali elettrici grezzi extracellulari risultanti sono stati digitalizzati con una risoluzione di conversione da analogico a digitale di 16 bit. Un algoritmo di rilevamento dei picchi che attraversa la soglia32 è stato utilizzato offline per rilevare il tempo di occorrenza dei potenziali d'azione extracellulari, senza eseguire alcun ordinamento dei picchi. Le Figure 4A-B mostrano chiaramente una forte asimmetria delle risposte evocate, ripetute 150 volte, a seconda della posizione dell'erogazione dello stimolo, suggerendo un significativo impatto funzionale dei vincoli geometrici sulla direzionalità preferita della connettività. Infatti, dopo aver stimolato il lato Sorgente, la frequenza di attivazione della popolazione neuronale Sorgente - stimata calcolando l'istogramma peri-stimolo spike-times - è aumentata come previsto generando una rete completa di potenziali d'azione 33,31,34 ed è stata seguita, dopo un certo ritardo, da un aumento della frequenza di attivazione della popolazione Target. Tuttavia, poiché la stimolazione è stata fornita all'interno della popolazione bersaglio, solo la velocità di fuoco della popolazione bersaglio è aumentata, con la popolazione sorgente che è rimasta per lo più silenziosa. La Figura 4C-D ripete lo stesso paradigma stimolo/risposta in una coltura di controllo, senza alcun dispositivo polimerico presente (cioè una coltura neuronale non strutturata), anche gli stimoli extracellulari sono stati erogati in 4 ripetizioni. Per tali condizioni di controllo, non si è verificata alcuna asimmetria nelle risposte evocate da entrambi gli stimoli. Mentre il sottoinsieme di microelettrodi MEA utilizzati per fornire gli stimoli corrispondeva a quello utilizzato nelle reti modulari, la posizione dell'erogazione dello stimolo ha portato a una risposta evocata simile da parte dell'intera popolazione. Ciò conferma che il dispositivo PDMS favoriva la connettività sinaptica unidirezionale, attraverso i due compartimenti. Nel complesso, le risposte asimmetriche evocate nelle colture modulari (N = 6) e le risposte simmetriche evocate nelle colture di controllo (N = 4) indicano fortemente una connettività anatomica vincolata di un sistema in vitro compartimentato. I dati elettrofisiologici e gli script utilizzati per generare la Figura 4, sono resi disponibili tramite Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).

figure-results-1
Figura 1: Schizzo della produzione di microstampi 2PP e stampaggio replica PDMS. (A) Un modello 3D viene progettato in CAD ed esportato in formato STL (Standard Tessellation Language), (B) istruisce la stampa 3D a 2 fotoni attraverso la polimerizzazione indotta dal laser all'interno di una goccia di resina (IP-S). (C) La struttura risultante viene utilizzata come stampo per la fabbricazione ripetuta di repliche PDMS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Esempio di prototipazione rapida in-house di un dispositivo PDMS per coltura cellulare polimerica (neuronale). (A) In meno di 24 ore, la produzione additiva su microscala consente di passare da un modello CAD a un master stampato in 3D, da utilizzare immediatamente, e ripetutamente, come stampo replica con elastomeri biocompatibili, come PDMS. (B-C) I dispositivi PDMS risultanti sono accoppiati a un substrato planare di coltura cellulare neuronale, qui rappresentato da una serie di microelettrodi. Per il disegno specifico del campione in (A), sono definite due camere: una denominata Sorgente e indicata da S, e l'altra denominata Bersaglio e indicata da T. (D) I neuroni placcati in ciascuna camera possono far crescere i loro neuriti solo attraverso una serie di microcanali. Se allineati in modo appropriato sotto la guida della microscopia stereoscopica in (C), due serie di microelettrodi integrati nel substrato vengono lasciati esposti, in modo che l'attività bioelettrica dei neuroni vicini situati in entrambi i compartimenti possa essere stimolata e registrata. Si noti qui che l'allineamento dei microelettrodi all'interno dei singoli microcanali non era la priorità di questa prova di principio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Imaging dal vivo di molecole reporter fluorescenti imperniate dalle cellule, identifica i neuriti allungati dai neuroni, pochi giorni dopo la placcatura cellulare. (A-D) Micrografie a fluorescenza confocali rappresentative di colture neuronali modulari del dispositivo fabbricate da Figura 1 e Figura 2 (N = 4, 128 singoli microcanali) sono state acquisite 2 e 6 giorni dopo la placcatura delle cellule. (B-D) L'ingrandimento 40x e una scala di grigi invertita delle micrografie per una maggiore visibilità. Le terminazioni dei microcanali dai compartimenti Sorgente e Destinazione sono indicate rispettivamente da S e T. (A) mostra l'immagine a scansione larga della coltura, dove Source (cioè l'area quadrata interna) e Target (cioè l'area esterna) sono pieni di cellule, 6 giorni dopo la placcatura. (B) e (C) mostrano, al primo punto temporale di 2 giorni dopo la placcatura, la crescita dei neuriti rispettivamente ai lati Sorgente e Bersaglio dei microcanali. I piccoli triangoli neri indicano esempi rappresentativi di presunti terminali di fasci assonali, apparentemente provenienti solo dalla Sorgente. I confini dei microcanali a forma di freccia indicano l'allungamento dei neuriti lungo il bordo (B), dove il loro passaggio è ininterrotto e guidato verso il bersaglio. Nella direzione opposta, e vicino all'estremità del bersaglio di un microcanale (C), i neuriti che hanno origine dal bersaglio e avanzano verso il lato della sorgente sono intrappolati negli angoli acuti. (D) rivela ulteriormente i dettagli della crescita dei neuriti all'interno di un microcanale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Caratterizzazione funzionale delle risposte elettriche neuronali, con e senza il dispositivo PDMS. I MEA sono stati utilizzati come substrati di coltura cellulare e impiegati per misurare le risposte di spiking a livello di rete evocate da un impulso di stimolazione elettrica bifasica molto breve (cioè 200 μs, 0,8 V), erogato in una configurazione bipolare. Con il dispositivo PDMS della Figura 2, le risposte di picco neuronale registrate dalla sorgente (rosso) e dal bersaglio (blu) differiscono, a seconda di dove viene erogato lo stimolo. I presunti ritardi assonali, sinaptici e di integrazione diventano evidenti in (A) ma non in (B), suggerendo l'esistenza di una connettività sinaptica preferita (cioè dalla sorgente alla destinazione). (C-D) In condizioni di controllo (cioè senza dispositivo PDMS), le risposte evocate rilevate da due set distinti di microelettrodi MEA non dipendono dalla posizione di erogazione dello stimolo. L'ombreggiatura di colore chiaro, che avvolge le linee nei grafici, denota l'errore standard istantaneo della media (N stimoli = 150). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome della soluzioneComposizione
polietilenimmina (PEI) 0,1%1 mL di soluzione madre PEI, 9 mL di acqua deionizzata sterile (DI).
Terreno di coltura (50 mL)Medium Essenziale Minimo (MEM), integrato con 20 μM di glucosio, 50 μg/mL di gentamicina, 50 μM di L-glutammina e 10% di siero di cavallo inattivato al calore.
Mezzo di dissezione (1000 mL)Sali bilanciati Hanks′ 9,52 g, Bicarbonato di sodio 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-glucosio 6 g, Acido chinurenico (concentrazione finale 200 μM), D-AP5 (concentrazione finale 25 μM), Gentamicina 250 μl, Albumina sierica bovina 300 mg, Solfato di magnesio 1,44 g. Regolare il pH a 7,3, proteggere dalla luce e conservare a 4°C.
Mezzo di digestione (100 mL)Cloruro di sodio 800 mg, Cloruro di potassio 37 mg, Acido fosfato di sodio 99 mg, HEPES 600 mg, Bicarbonato di sodio 35 mg, Acido chinurenico, 200 μL (da stock 100 mM), D-AP5 100 μL (da stock 25 mM). Regolare il pH a 7,4, proteggere dalla luce e conservare a 4 °C.
Soluzione 1Tripsina 5 mg, Desossiribonucleasi I 1,5 mg, in 2 mL di mezzo di digestione.
Soluzione 2Inibitore della tripsina 5 mg, in 5 mL di terreno di dissezione.
Soluzione 3Desossiribonucleasi I 1,5 g, in 2,5 mL di terreno di dissezione.

Tabella 1: Tabella delle soluzioni. Fare riferimento alla tabella dei materiali per le descrizioni dei prodotti.

File di codifica supplementare 1: Il file di progettazione STL corrisponde alla struttura illustrata nella Figura 2A. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

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Nonostante sia vecchia di decenni, l'applicazione della tecnologia 2PP nello stampaggio di repliche basate su PDMS su scala micrometrica è uno sviluppo recente43,44. In questo contesto, una serie di punti sono discussi di seguito per aiutare gli utenti a riprodurre efficacemente questo lavoro.

Per la progettazione di modelli 3D, assicurarsi che il modello non contenga fori o autointersezioni. Privilegia il formato di file binario quando si salva come STL, per il suo ingombro di dimensioni del file inferiore rispetto alla codifica ASCII. Ciò è particolarmente vantaggioso per i progetti con geometrie intricate e per oggetti larghi millilitri. L'utilizzo di file STL binari implica anche un basso carico della CPU, in una fase successiva del processo di preparazione della parte meccanica per la stampa 3D. Le dimensioni fisiche degli elementi all'interno del file STL sono rappresentate in unità adimensionali. Durante la post-elaborazione del file STL, le unità vengono interpretate come micrometri. Pertanto, si consiglia di adottare in anticipo l'unità di interesse, cioè il micrometro, durante la preparazione del file. La precisione del modello stampato è determinata dal numero di superfici che si avvicinano ai triangoli tassellati. Per un numero insufficiente di superfici, emergerà una rugosità superficiale indesiderata. Ciononostante, puntare a una precisione eccessivamente elevata da un numero molto elevato di superfici comporta un elevato carico computazionale, che rallenta l'elaborazione dei file.

Per la stampa 3D, durante la stampa, l'oggetto fisico 3D viene formato utilizzando la scansione galvo veloce nel piano x-y e il movimento piezoelettrico nella direzione z. Questo focalizza il raggio laser a femtosecondi all'interno di un determinato voxel 3D. Tuttavia, quando le strutture di stampa sono più grandi degli intervalli di copertura spaziale del galvo e del piezo, l'oggetto deve essere suddiviso a livello di codice in blocchi. Sebbene questo sia un requisito per le parti stampate di dimensioni millimetriche, le giunzioni tra i blocchi sono associate a linee di cucitura (imperfette). Un'attenta ottimizzazione del numero di blocchi e il posizionamento delle linee di cucitura nelle direzioni x, y e z sono fondamentali per evitare di interrompere le caratteristiche geometriche critiche dell'oggetto finale con le linee di cucitura. Le bolle possono formarsi sull'interfaccia di stampa per vari motivi (ad esempio, impurità e disomogeneità dei substrati del fotoresist) e influire negativamente sulla qualità e sull'integrità della struttura stampata. Inoltre, una maggiore potenza del laser può portare a un aumento della loro presenza. Riducendo la potenza del laser, nello strato più basso della parte stampata, si riducono al minimo le possibilità di formazione di bolle. In alternativa alla stampa dell'intera parte come struttura solida, è possibile prendere in considerazione il metodo shell-and-scaffold. Prevede la stampa solo della superficie esterna della parte (guscio) e degli elementi prismatici triangolari al suo interno. Questi elementi sono separati da strati orizzontali (scaffold), che trattengono la resina non polimerizzata in piccole tasche. Questo metodo riduce significativamente i tempi di stampa, in particolare per le strutture di dimensioni millimetriche. Tuttavia, poiché la resina non polimerizzata rimane, l'esposizione ai raggi UV post-stampa è indispensabile per garantire la piena stabilità meccanica, anche se questo passaggio deve essere eseguito delicatamente per evitare qualsiasi deformazione della parte stampata. Il tempo di polimerizzazione post-stampa dipende dalla resina scelta, dallo spessore del pezzo e dalla potenza UV40. Per ottenere risultati ottimali, si consiglia di condurre una prova iniziale per stimare il tempo necessario per l'indurimento a piena profondità, utilizzando una goccia di fotoresist e valutando il suo taglio in sezione, dopo l'esposizione ai raggi UV. Il periodo di stagionatura abituale varia da 5 a 20 minuti.

Per lo stampaggio di repliche PDMS, la fabbricazione pulita di un dispositivo PDMS con caratteristiche su scala micrometrica, senza strutture per camere bianche, può essere impegnativa: le microparticelle sospese nell'aria possono risiedere sulla superficie altamente adesiva del PDMS e ostacolare la tenuta tra il dispositivo e il substrato o bloccare la sezione dei singoli microcanali. L'esecuzione delle fasi del protocollo sotto una cappa a flusso laminare e la schermatura costante della superficie del PDMS con isopropanolo riducono sostanzialmente al minimo i rischi di contaminazione. La temperatura di polimerizzazione e la sua durata influenzano direttamente la reticolazione PDMS e le proprietà fisiche risultanti. In particolare, l'adesività del PDMS polimerizzato è un fattore critico. Da un lato, è necessaria una tenuta ermetica tra il dispositivo PDMS e la superficie utilizzata per la coltura delle cellule neuronali (ad esempio, un vetrino coprioggetti o un MEA), per limitare efficacemente il passaggio dei neuriti. D'altra parte, il dispositivo PDMS dovrebbe attaccarsi alla superficie in modo reversibile, in modo che il delicato strato isolante MEA non venga danneggiato dopo aver rimosso il dispositivo. Mentre il restringimento del PDMS durante l'indurimento si verifica e potrebbe essere corretto ridimensionando in anticipo lo stampo, per le temperature e gli intervalli di polimerizzazione qui indicati il restringimento sarà inferiore al 2%42 e non influirà in modo significativo sui dispositivi PDMS a strato singolo. Nel complesso, seguire con precisione i valori di temperatura e durata di polimerizzazione consigliati, per ottenere i migliori risultati.

Panoramica dei vantaggi e dei limiti del metodo
Viene proposta una tecnica basata sulla scrittura laser diretta a 2 fotoni per la fabbricazione rapida di dispositivi polimerici su micro-scala per lo studio sperimentale di reti neurali modulari. A differenza della fotolitografia soft, l'approccio proposto non richiede un alto livello di competenza tecnica, a condizione che una configurazione di stampa 3D 2PP funzionale sia accessibile e operativa. Sorprendentemente, il metodo consente di passare da un modello 3D progettato da CAD a un dispositivo PDMS funzionale in un solo giorno, fornendo così un percorso diretto ed efficiente dall'ideazione alla realizzazione tangibile. In particolare, optando per la modalità di stampa shell-and-scaffold si riduce notevolmente il tempo necessario per creare lo stampo, poiché viene stampata solo una frazione del suo volume. La successiva polimerizzazione UV del componente stampato ne garantisce la stabilità meccanica e la robustezza, come qui verificato su 50 cicli di fusione con PDMS.

Rispetto ai metodi tradizionali, la stampa 3D 2PP vanta un chiaro vantaggio, che è più pronunciato quando si tratta di fabbricazione di stampi con un rapporto d'aspetto significativo, requisiti di risoluzione impegnativi e geometrie tridimensionali complesse. La produzione di stampi master utilizzando la litografia UV standard è vincolata da uno spessore di resistenza di circa 200 μm. Per ottenere un'altezza e un rapporto d'aspetto maggiori sono necessari intricati processi di spin-coating e di esposizione35, costosi processi LIGA (litografia, galvanica e stampaggio) o incisione ionica reattiva profonda (DRIE)36 . In netto contrasto, come dimostrato nel lavoro pionieristico di Kumi et al. nel 201037, la tecnica 2PP offre una portata essenzialmente illimitata per il rapporto d'aspetto delle parti stampate, che va dal sub-micrometro al millimetro. Qui, è stato esemplificato il processo di microfabbricazione di uno stampo con una significativa differenza di altezza delle sue porzioni, con una differenza di oltre 100 volte tra l'altezza dei microcanali (5 μm) e l'altezza massima dello stampo (545 μm; vedi Figura 2).

Inoltre, la risoluzione sub-micrometrica potrebbe essere facilmente raggiunta seguendo le specifiche del protocollo delineate. In confronto, ottenere migliori risoluzioni degli stampi attraverso la fotolitografia UV richiede investimenti di capitale. Le maschere con la migliore risoluzione, che utilizzano la deposizione di cromo su quarzo ad una risoluzione nominale di 600 nm, hanno un prezzo di diversi ordini di grandezza superiore rispetto alle maschere di trasparenza sopraelevate stampate al laser, che possiedono una risoluzione di 250 μm35, tuttavia si veda il lavoro di Pirlo et al.41. Per essere praticabile per l'uso interno, un metodo scelto deve essere conveniente. Per molti laboratori biologici, la spesa complessiva associata alla fotolitografia morbida convenzionale o alla scrittura laser diretta rappresenta un ostacolo. Sebbene sia possibile rendere entrambe le tecnologie più accessibili acquistando e assemblando i componenti essenziali, questo approccio richiede competenze aggiuntive e richiede comunque un investimento notevole. In questo contesto, un punto essenziale da considerare è il più ampio spettro di applicazioni realizzabili attraverso la scrittura laser diretta. A differenza della fotolitografia morbida convenzionale, principalmente limitata alla microproduzione di stampi, la stampa 3D 2PP presenta una notevole versatilità. Le sue potenziali applicazioni spaziano dalla microfluidica e microottica alla fotonica integrata e alla micromeccanica. Ciò rende l'investimento in questa tecnologia attraente come struttura condivisa per molteplici e diversi campi scientifici. Ad esempio, la metodologia basata su 2PP ideata in questo protocollo è il risultato di una collaborazione interdisciplinare tra i dipartimenti di neuroscienze e matematica all'interno della nostra istituzione. Inoltre, lo sviluppo del fotoresist è un campo di ricerca attivo e può potenzialmente espandere la gamma di applicazioni della stampa 3D 2PP. Un esempio calzante è la recente introduzione della resina IP-PDMS. Polimerizzando in strutture con proprietà come PDMS38, questa resina sblocca il potenziale per la microfabbricazione diretta di componenti biocompatibili che hanno una superficie contorta o contengono spazi cavi. Queste complessità rappresentano un ostacolo al raggiungimento di risultati simili attraverso le procedure convenzionali di stampaggio delle repliche.

Come dimostrazione di questo metodo, sono state fornite prove che suggeriscono lo sviluppo di connettività unidirezionale tra due moduli in una rete neuronale modulare. Lo stampo su microscala, prodotto con la tecnica 2PP, ha avuto una resistenza sufficiente per essere sottoposto a più fusioni PDMS e ha la precisione su microscala richiesta. In conclusione, l'ambito di applicazione del protocollo descritto in questo lavoro si estende oltre il caso illustrato. Man mano che l'accesso alla tecnologia di stampa 2PP diventa sempre più diffuso, l'investimento iniziale richiesto per la sua implementazione diminuirà, mentre la sua gamma di potenziali applicazioni si espanderà.

Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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M.G. riconosce il sostegno finanziario del Programma Quadro H2020 dell'Unione Europea attraverso l'European Innovation Council (progetto IN-FET, GA n. 862882, progetto Arbor-IO, FLAG-ERA e Human Brain Project, ID 650003) e della SISSA (Area Neuroscienze). G.N. riconosce il sostegno finanziario del Ministero dell'Università e della Ricerca (MUR) attraverso il bando Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Area Matematica). Ringraziamo M. Gigante, B. Pastore e M. Grandolfo per la loro assistenza con la stampa 3D, la coltura cellulare e l'imaging dal vivo, nonché i dottori P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente e H.C. Schultheiss per le discussioni. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-PropanolSigma-Aldrich650447
BB cure polimerizzatore compattoPCube SrlLunghezze d'onda 365-405 nm, Potenza 120W
BioMed Amber Resin 1 LformlabsResina utilizzata per il montaggio dello stampo stampato in 3D su piastra di Petri
Siero bovino AlbuminaSigma-AldrichA9418
Software applicativo CAD SolidWorksDassault Systè mes SolidWorks Corporation, USFusion 360 (Autodesk Inc., Stati Uniti), AutoCAD (Autodesk Inc., Stati Uniti), PTC Creo (PTC corp., Stati Uniti), SolidWorks (Dassault Systè mes SolidWorks corp., Stati Uniti) e Tinkercad (Autodesk Inc., Stati Uniti).
                                                                --------------------------------------
Tutorial: https://www.mycadsite.com/tutorials.html
Corsi di formazione: https://www.autodesk.com/training
CellTracker Green CMFDAInvitrogenC7025
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG8270
D-AP5Tocris#0106
Deossiribonucleasi ISigma-AldrichD5025
DeScribeNanoscribe GmbH & Co.
di-Sodio idrogeno fosfatoSigma-Aldrich106585
GentamicinaThermo Fisher15710049
Hanks′ Sali bilanciatiSigma-AldrichH2387
HEPESSigma-AldrichH7523
Siero di cavalloSigma-AldrichH1138
in vitro Sistema di registrazione MEA MEA2000 miniSistemi multicanale GmBH, Reutlingen, Germania
IP-S PhotoresistNanoscribe GmbH & Co.
Acido chinurenicoSigma-AldrichK3375
L-Glutammina (200 mM)Gibco25030081
Solfato di magnesioSigma-AldrichM2643
MEA software applicativo di registrazione (Sperimentatore)Sistemi multicanale GmBH, Reutlingen, Germania
Terreno minimo essenzialeSigma-Aldrich51412C
NanoWriteNanoscribe GmbH & Co.
pugnalata oftalmica KG 15 °HESTIA Medical
Photonic Professional GT2 (PPGT2)Nanoscribe GmbH & Co. KGSN617
Detergente al plasmaHARRICK PLASMA
Soluzione di poli(etileneimmina)Sigma-AldrichP3143
Cloruro di potassioSigma-AldrichP3911
Acetato di etere metilico di glicole propilenico (PGMEA)Sigma-Aldrich484431
Repel-silano ESSigma-AldrichGE17133201
Substrati rivestiti di soda calce ITO per 3D MF DiLLNanoscribe GmbH & Co.
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS6014
Cloruro di sodioSigma-AldrichS9888
MEA planari integrati nel substrato (120MEA100/30iR-ITO-gr)Sistemi multicanale GmBH, Reutlingen, GermaniaElettrodi TiN, isolatore SiN, 4 elettrodi di riferimento interno, 120 elettrodi di registrazione, spaziatura degli elettrodi 100 e micro; m, diametro dell'elettrodo 30 e micro; m
SYLGARD 184 KitDow Corning
TripsinaSigma-AldrichT1005
Inibitore della tripsinaSigma-AldrichT9003
pompa a vuoto Monofase asincrona 2 poli CIMAMOTORI
KGKGColtello da Stampante 3D KG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13(2011).
  2. Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
  3. Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Designing neural networks in culture. Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).
  4. DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32(2016).
  5. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010(2012).
  6. Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044(2020).
  7. Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400(2014).
  8. Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157(2016).
  9. Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
  10. Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424(2016).
  11. Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
  12. Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031(2011).
  13. Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
  14. Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  15. Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
  16. Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
  17. Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
  18. Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625(2017).
  19. le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412(2015).
  20. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  21. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie - International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  22. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
  23. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276(2017).
  24. Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307(2019).
  25. Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
  26. Baldacchini, T. Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , Elsevier. (2015).
  27. Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication. , CRC Press. (2018).
  28. Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
  29. Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
  30. Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
  31. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056(2010).
  32. Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26(2014).
  33. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701(2016).
  34. Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49(2017).
  35. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).
  36. Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
  37. Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
  38. Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
  39. Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  40. Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
  41. Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408(2011).
  42. Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002(2014).
  43. Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
  44. Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).

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