L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Quantificazione degli anticorpi autoreattivi nei topi dopo encefalomielite autoimmune sperimentale
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello di malattia che ricapitola la malattia autoimmune della sclerosi multipla (SM) a livello istopatologico e molecolare. L'EAE è indotto dall'immunizzazione di animali da esperimento tramite iniezione sottocutanea di peptidi di mielina corta insieme a coadiuvanti specifici per aumentare la risposta immunitaria. Come la controparte umana, i topi EAE sviluppano lesioni demielinizzanti, infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC), attivazione della glia e danno neuronale. Un corpo coerente di prove supporta anche un ruolo meccanicistico per la disfunzione delle cellule B nell'eziologia sia della SM che dell'EAE. Le cellule B possono fungere da cellule presentanti l'antigene e da fonte primaria di citochine pro-infiammatorie e autoanticorpi. Nell'EAE, vengono generati anticorpi contro i peptidi mielinici che sono stati impiegati per indurre la malattia. È stato dimostrato che tali autoanticorpi mediano la perdita di mielina o la riattivazione delle cellule T patogene nel SNC. Questo articolo descrive un efficiente protocollo basato su ELISA per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi C57BL/6J immunizzati con il peptide della glicoproteina 35-55 degli oligodendrociti mielinici (MOG35-55). Il metodo proposto funge da potente strumento per studiare la specificità e l'entità della risposta umorale aberrante nel contesto della demielinizzazione autoimmune.
Introduzione
La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiltrazione focale di cellule immunitarie nel parenchima cerebrale, rottura delle guaine mieliniche che avvolgono gli assoni, attivazione della glia e perdita neuronale1. Oltre al ruolo ben consolidato delle cellule T patogene, molteplici linee di evidenza hanno evidenziato il coinvolgimento delle cellule B nella mediazione della risposta autoimmune contro il SNC. Le cellule B subiscono un'espansione clonale nel cervello della SM e sono stati rilevati anticorpi contro i componenti della mielina all'interno delle lesioni demielinich....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state eseguite in conformità con le linee guida sperimentali approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della Carolina orientale. In questo studio sono stati utilizzati topi femmina Wildtype C57BL / 6J di età compresa tra 8 e 10 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). L'EAE è stato indotto a seguito di rapporti precedentemente pubblicati 12,13,14.
1. Raccolta del siero
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Per dimostrare la robustezza del presente test ELISA, il metodo è stato testato su campioni di siero isolati da una coorte di topi femmina C57BL/6J a 20 giorni dopo l'immunizzazione (dpi) con 100 μg di peptide MOG35-55 nell'adiuvante di Freund completo (CFA) seguendo un protocollo di induzione EAE convalidato 12,13,14. Gli animali hanno anche ricevuto 400 ng di tossina della pertosse nei giorni 0 e 2. I campioni di siero di anim.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Qui, è stato riportato un protocollo basato su ELISA semplice ed efficiente per quantificare accuratamente la risposta umorale in un modello animale rilevante di patologia della SM. Questo metodo è stato recentemente impiegato per descrivere il nuovo ruolo della proteina atassina-1 nel controllo dei livelli sierici di autoanticorpi nel paradigma EAE MOG35-55/C57BL6J12. A questo proposito, è necessario prendere in considerazione una serie di fattori, al fine di ottenere risultati coerenti e biologi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (R03NS131908) e dal Dipartimento della Difesa attraverso il programma di ricerca sulla sclerosi multipla con il premio n. W81XWH-22-1-0517. Le opinioni, le interpretazioni, le conclusioni e le raccomandazioni sono quelle dell'autore e non sono necessariamente approvate dal Dipartimento della Difesa. Questo studio è stato supportato anche dai fondi per le startup della East Carolina University.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringhe da 1 mL BD | Biosciences | 309628 | |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Fisher | 05-408-129 | |
| Aghi da 25 G | BD Biosciences | 305122 | |
| substrato da 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) | Thermo Fisher | N301 | Conservare a 4 ° C |
| Guarnizioni adesive | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A7906 | Conservare a 4 ° C |
| C57BL/6J topi femmina | Il Jackson Laboratory | 000664 | Gli animali di età compresa tra 8 e 10 settimane dovrebbero essere utilizzati per esperimenti EAE |
| Provette criogeniche | Fisher | 10-500-25 | |
| Vassoio di dissezione | Fisher | S111022 | |
| Forbici per dissettore | Fisher Strumenti per la scienza | fine 14082-09 | |
| Tampone di rivestimento ELISA | BioLegend | 421701 | Negozio a 4 gradi C |
| Excel software | Microsoft | Foglio di calcolo di analisi | |
| Pinze | Strumenti di scienze fini | 11152-10 | |
| Capra Anti-topo IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Negozio a 4 ° C |
| Sorgente luminosa a LED | Fisher | AMPSILED21 | |
| Lettore di micropiastre | Fisher | 14-377-575 | |
| Acqua di grado di biologia molecolare | Corning | 46-000-Cl | |
| Peptide di topo MOG35-55 | EZBiolab | cp7203 | Conservare a -80 ° C |
| Pipetta multicanale | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes forbici a molla | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp piastre a 96 pozzetti | BioLegend | 423501 | |
| Agitatore orbitale | Fisher | 88-861-023 | |
| Forno | VWR | 445-0024 | |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Centrifuga refrigerata da tavolo | Thermo Fisher | 75002441 | |
| soluzione Stop | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
Riferimenti
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
